CN107964011A - 取代吡唑并吡啶类衍生物及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及式(I)取代吡唑并吡啶类衍生物及其在药物学上可接受的盐、异构体、前药和药物组合物,此类化合物为可溶性鸟苷酸环化酶的刺激剂,其中R1表示为噻吩或取代吡啶基,R2表示为‑NH2、‑NHCH3、‑NHC(=O)CH(CH3)2,R3为氢或C1~C4的烷基,R4为C1~C6的烷基。本发明还公开了所述化合物的制备及其作为药物的应用,特别是作为治疗心血管疾病,如抗肺动脉高压药物的应用。
Description
技术领域
本发明涉及可刺激可溶性鸟苷酸环化酶的化合物及其在药物学上可接受的盐、异构体、前药和药物组合物,还涉及其制备以及其作为药物的应用,特别是作为治疗心血管疾病的药物的应用。
背景技术
可溶性鸟苷酸环化酶(Soluble Guanylate Cyclasey,sGC)是NO-sGC-cGMP信号转导通路中的关键的信号转导酶,可被一氧化氮(NO)所激活,从而催化鸟苷三磷酸(GTP)转化为环鸟苷单磷酸(cGMP),cGMP作为第二信使调节转导通路下游的相关效应器,包括蛋白激酶、磷酸二酯酶(PDE)以及某些离子通道等,从而调节相应生理过程,如舒张血管、血管平滑肌细胞产生、血小板的凝集以及神经传导等。
可溶性鸟苷酸环化酶是由一个较大的α亚基和一个较小含血红素的β亚基组成的异源二聚体,人类sGC有α1,α2,β1和β2四种亚基,α1/β1和α2/β1这两种异源二聚体较为典型。与β亚基结合血红素部位是活性调节部位的一部分,对于激活机制十分重要。NO能与血红素的亚铁离子结合,从而可以显著增加酶的活性,但是,NO不能刺激不含血红素的酶。CO也能与血红素的亚铁离子结合,但是效果较NO差。
sGC存在氧化型和还原型两种型态,还原型是它的活化状态。病理条件下产生的过量的NO与过氧负离子结合形成过氧化亚硝酸盐,通过氧化和硝化作用使酶和其他蛋白失活,造成细胞损伤。由于NO的生物利用率降低、sGC由活化态的还原型转化成失活态的氧化型,sGC对内源性的NO以及NO释放药物的敏感度降低,导致NO-sGC-cGMP信号转导通路受阻,其可导致如高血压、血小板活化、细胞增生增加,内皮机能障碍、动脉粥样硬化、心绞痛、心衰、血栓、中风、性功能障碍和心肌梗死,其中以肺动脉高压较为严重,它使肺部血管压力增大从而引起右心肥大最终导致右心衰竭甚至死亡。因此,对该通路的修复就变得尤为重要,主要是要提高cGMP的水平。一种不依赖于NO直接激活sGC的治疗途径是一种比较有希望的方法,因为普遍认为这种方法效率高并且副作用少。根据是否依赖于血红素可以将其分为两种类型:1、血红素依赖型sGC刺激剂(sGC stimulator);2、非血红素依赖型sGC激活剂(sGC activator),一些潜在的治疗方法还包括:PPAR-γ激动剂、生存素拮抗剂、活性T细胞核因子抑制剂、他汀类药物、酪氨酸激酶抑制剂、Rho激酶抑制剂、抗炎药、二氯乙酸盐、肾上腺髓质素、弹性蛋白酶抑制剂、血清素质膜转运蛋白抑制剂和5-羟色胺受体拮抗剂、血管活性肠肽、骨髓源性干细胞等。
近年来,已经有一些文献报道了可以不依赖于NO而直接刺激可溶性鸟苷酸环化酶得化合物,如:3-(5’-羟甲基-2’-呋喃基)-1-苄基吲唑(YC-1)、脂肪酸、二苯基碘鎓六氟磷酸盐、异甘草素以及各种被取代的吡唑衍生物。此外,WO98/16507、WO98/23619、WO00/06567、WO00/06568、WO00/06569、WO00/21954、WO02/42299、WO02/42300、WO02/42301、WO02/42302、WO02/092596、WO03/004503、US06/052397、US09/023717、WO2013/004785、中描述了作为可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂的吡唑并吡啶衍生物。其中还特别描述了在3位上具有嘧啶残基的吡唑并吡啶衍生物,这一类型的化合物在刺激可溶性鸟苷酸环化酶方面具有很高的体外活性。
发明内容
本发明所用的化合物具有不依赖于NO而直接作用激活可溶性鸟苷酸环化酶的特点,可作为治疗心血管疾病的药物。该化合物具有如权利要求1所描述的吡唑并吡啶的结构,这种新类型的吡唑并吡啶衍生物的特点是吡唑环1位被噻吩基甲基或取代吡啶基甲基所取代;另外,吡唑环3位上具有一种嘧啶残基,特点是其4,6位为氨基或取代氨基。本发明提供了式I所示的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物。
其中:
R1为噻吩或取代吡啶,
R2为氨基或取代氨基,
R3为氢或C1~C4的烷基,
R4为C1~C6的烷基。
优选的化合物为其中R1为:
R2为-NH2、-NHCH3、-NHC(=O)CH(CH3)2;
R3为氢、甲基或乙基;
R4为甲基、乙基、异丙基、环戊基和环己基。
本发明式I还可以是其盐的形式,一般是与有机或无机碱或酸形成的盐。
本发明优选生理学可接受的盐。本发明化合物的生理学可接受的盐可以是本发明物质与无机酸、羧酸或磺酸的盐,特别优选的是例如与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、鞣酸形成的盐。其它的酸,如草酸,虽然其本身并非药学上可接受的,但可以用于制备用作中间体的盐,以获得本发明化合物及其药学上可接受的盐。
生理学上可接受的盐同样可以是具有游离羧基的本发明化合物的金属或铵盐。特别优选的是如钠、钾、镁或钙盐、以及无机氨或有机胺,如乙胺、二乙胺、三乙胺、N,N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、二甲基氨基乙醇、精氨酸、赖氨酸或乙二胺的铵盐。
本发明的化合物可以互变异构形式存在,并且本发明同样也包含了该类形式。
本发明的化合物还可以是其可能的溶剂化物。
卤素(用于本发明目的的卤素)是氟、氯、溴和碘。
本发明还涉及制备本发明式I化合物的合成方法,包括:
1)氯甲基噻吩或取代吡啶(II)与3-氰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(III)反应得到中间体3-氰基-1-噻吩/取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(IV)。
2)2-(1-噻吩或取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-4,5,6-嘧啶三胺(V)与氯甲酸酯(VI)反应得到中间体4,6-二氨基-2-(1-噻吩或取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-5-嘧啶基氨基甲酸酯(VII)。
其中:R1、R2、R4的定义如权利要求1所述。
3)4,6-二氨基-2-(1-噻吩或取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-5-嘧啶基氨基甲酸酯(VII)与R3-X(VIII)反应得到4,6-二氨基-2-(1-噻吩或取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-5-嘧啶基(烷基)氨基甲酸酯(I)。
其中:R1、R2、R3、R4的定义如权利要求1所述,X为离去基团。如卤素,优选的是碘,或甲磺酸酯,任选的是在有机溶剂中在冷却的情况下进行的。
制备权利要求1所定义的式I化合物所需要的式(V)化合物的合成方法如下所示:
其中,R1的定义如权利要求1所述。
本发明还包含至少一种本发明式I的化合物与一种或多种有机硝酸盐或NO供体的组合。
用于本发明目的的有机硝酸盐和NO供体一般是通过释放NO或NO物质而表现出其治疗作用的物质。可提及的优选实例有:硝普钠、硝酸甘油、硝酸异山梨酸酯、单硝酸异山梨酯、马多明和SIN-1。
此外,本发明还包含与一种或多种可抑制环鸟苷酸(cGMP)的分解的化合物的组合。其优选的是磷酸二酯酶1、2和5;Beavo和Reifsnyder(1990)TiPS11,第150至155页命名的物质的抑制剂。在这方面特别优选的是磷酸二酯酶5抑制剂,尤其是化合物昔多芬(WO94/28902)、伐地那非(WO99/24433)或tadalafil(WO 95/19978)中的一种。这些抑制剂加强了本发明化合物的作用,并且增加了所需的药理学作用。
本发明还涉及一种包含至少一种本发明化合物的药物,其优选的还一起包含一种或多种药理学可接受的赋形剂或载体,并且还涉及其用于上述目的的应用。这里的药用载体包括但不限于:离子交换剂,氧化铝,硬脂酸铝,卵磷脂,血清蛋白如人血白蛋白,缓冲物质如磷酸盐,甘油,山梨酸,山梨酸钾,饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物,水,盐或电解质,如硫酸鱼精蛋白,磷酸氢二钠,磷酸氢钾,氯化钠,锌盐,胶态氧化硅,三硅酸镁,聚乙烯吡咯烷酮,纤维素物质,聚乙二醇,羧甲基纤维素钠,聚丙烯酸酯,蜂蜡,羊毛脂。
该活性成分可以具有全身和/或局部作用,因此,其可以适宜的途径进行给药,所说的适宜途径如口服、胃肠外、肺、鼻、舌下、舌、颊、直肠、经皮、结膜、局部给药或以植入物的形式给药。
该活性成分还可以适于这些给药途径的给药形式进行给药。
适于口服给药的有可以迅速和/或以改变的方式传递活性成分的公知的给药形式,如片剂(未包衣片或包衣片,如具有肠包衣或莫包衣的片剂)、胶囊、糖衣片、颗粒、小药丸、粉剂、乳剂、混悬液和气雾剂。
采用胃肠外给药可能可避免吸收步骤(静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰髓内给药)或者包含吸收(肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内给药)。适于胃肠外给药的给药形式特别是用于注射和输入的溶液、混悬液、乳剂、冷冻干燥物和无菌粉末形式的制剂。
适于其他给药途径的有例如吸入(特别是粉末吸入、喷雾)的药物、鼻滴剂/溶液、喷雾剂;用于舌、舌下或颊给药的片剂或胶囊、栓剂、用于耳朵和眼睛的制剂、阴道胶囊、水性混悬液(洗剂、振摇混合物)、亲脂性混悬液、软膏、乳膏、乳液、糊剂、撒粉或植入物,如斯腾特固定模。
可以用本身已知的方法将该活性成分转化成所述的给药形式。其可以用惰性无毒的适宜药用赋形剂来实现。其特别是包括载体(例如微晶纤维素)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂(例如十二烷基硫酸钠)、分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然生物聚合物(例如蛋白质)、稳定剂(例如抗氧剂和抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料如氧化铁)或矫味剂和/或掩味剂。在适宜的情况中,所说的活性成分可以以微囊包封的形式存在于一种或多种上述载体中。
除本发明式I的化合物外,上述药物制剂还可以包含其他药物活性成分。
英文缩写与其中文全称对照
具体实施方式
关于制备通式I化合物更详尽的资料见实施例,但下面的实施例仅是本发明优选的说明性方案,对本发明不构成任何限制。
实施例
实施例1:4,6-二氨基-2-[1-(噻吩-2-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯
A:苯偶氮丙二腈
称取4.66g(50mmol)苯胺装入250mL双口烧瓶中,冰浴片刻,缓慢滴加8.5mL浓盐酸,尽量保持温度在0~5℃;滴毕,待温度稳定后,慢慢加入4.55g(66mmol)亚硝酸钠和8mL水溶液,搅拌15min;然后慢慢加入8.04g醋酸钠和20mL水溶液;搅拌待温度稳定,滴加5.19g丙二睛和6mL乙醇溶液,产生大量鲜黄色固体,补加80mL水,继续反应1h。TLC监测,抽滤,滤饼用适量水洗涤,干燥,得鲜黄色固体8.24g,收率96.8%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.00(s,1H),7.41(dt,J=14.9,8.1Hz,4H),7.18(td,J=7.3,1.3Hz,1H)。
B:2-噻吩甲醇
称取5.0g(39.02mmol)2-噻吩甲酸溶于50mL无水THF中,缓慢滴加至2.47g(65.29mmol)NaBH4和57mL的无水THF中,反应产生大量气泡,滴毕,继续搅拌30min,不再有汽包产生。然后将6.97g(27.46mmol)I2溶于76mL无水THF,在滴加至反应液中,再次产生大量气泡,滴毕,搅拌片刻,油浴加热50℃反应过夜。TLC监测,剩极少量原料未反应,慢慢加入130mL水淬灭反应,乙醚(80mL*4)萃取,30mL饱和食盐水洗涤,减压蒸除溶剂,得淡黄色液体8.1g。
C:2-氯甲基噻吩
往上面所得2-噻吩甲醇粗品8.1g中加入20mL浓HCl,室温搅拌15min,然后加入50mL水,乙醚(40mL*4)萃取,用5%的NaHCO3溶液洗涤至水层显碱性,再用饱和NaCl溶液洗涤,无水MgSO4干燥,抽滤,蒸除溶剂,得棕色液体11.83g。
D:3-氰基-1-(噻吩-2-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶
将上述往上面所得2-氯甲基噻吩粗品11.83g和3氰基-1H-吡啶并[3,4-b]吡啶5.62g(39mmol)溶于90mL DMF中,搅拌下加入10.76g(78mmol)K2CO3,N2保护下于40℃油浴加热反应过夜。TLC监测,反应完全,加入200mL水,乙酸乙酯(100mL*3)萃取,饱和食盐水洗涤,无水Na2SO4干燥,减压蒸除溶剂,柱层析分离,得淡黄色固体4.11g,三步反应总收率为43.9%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm 8.83(dd,J=4.5,1.3Hz,1H),8.51(dd,J=8.2,1.3Hz,1H),7.60-7.39(m,2H),7.23(d,J=3.3Hz,1H),7.00(dd,J=5.0,3.6Hz,1H),6.03(s,2H)。
E:1-(噻吩-2-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰亚胺酸甲酯
称取4.11g(17.1mmol)苯偶氮丙二腈溶于180mL甲醇中,加入3.73g(69mmol)甲醇钠,室温反应2h。TLC监测,反应完全,得单一产物,直接用于下一步反应。
F:1-(噻吩-2-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒
向上述E步骤所得反应液中加入3.92mL(68.5mmol)冰醋酸和1.34g(25.1mmol)NH4Cl,64℃左右回流反应12h。TLC监测,反应完全。减压蒸除溶剂,加入180mL水,然后搅拌下加入7.1g(51.45mmol)K2CO3,乙酸乙酯(120mL*3)萃取,无水MgSO4干燥,抽滤,减压蒸除溶剂,干燥,得白色固体3.5g,收率79.5%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm 9.75(s,2H),8.75(dd,J=4.5,1.5Hz,1H),8.60(dd,J=8.2,1.5Hz,1H),8.47(s,1H),7.54-7.37(m,2H),7.20(d,J=2.6Hz,1H),6.99(dd,J=5.1,3.5Hz,1H),5.98(s,2H)。ESI-MS m/z:258.2[M+H]+。
G:2-[1-(噻吩-2-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-[(E)苯基二氮烯基]-4,6-嘧啶二胺
称取3.5g(13.6mmol)步骤F所得产物和2.34g(13.75mmol步骤A产物,溶于80mLDMF中,N2保护下110℃反应12h。TLC监测,反应完全,冷却,减压浓缩,抽滤,滤饼用适量水洗涤,再用少量乙醇洗涤,得橙黄色固体,滤液加入适量水至不再有固体析出,抽滤,滤饼用适量水洗后再用少量乙醇洗涤,得橘黄色固体,干燥,共得产物4.79g,收率82.4%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm 9.18(dd,J=8.1,1.6Hz,1H),8.68(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.54(s,2H),8.09-7.99(m,2H),7.94(s,2H),7.57-7.33(m,5H),7.19(d,J=2.5Hz,1H),6.99(dd,J=5.1,3.5Hz,1H),5.96(s,2H)。ESI-MS m/z:428.3[M+H]+。
H:2-[1-(噻吩-2-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺
称取4.79g步骤G产物溶于90mLDMF中,加入2.5g Raney-Ni(湿重),于氢化罐中65℃,65bar催化氢化反应10h。TLC监测,基本反应完,用硅藻土滤去催化剂,减压蒸除溶剂,柱层析分离,得黄色固体3.2g,收率84.0%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm 9.01(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),8.58(dd,J=4.5,1.7Hz,1H),7.41(dd,J=5.1,1.2Hz,1H),7.29(dd,J=8.0,4.5Hz,1H),7.14(d,J=2.4Hz,1H),6.97(dd,J=5.1,3.5Hz,1H),5.85(d,J=12.8Hz,6H),4.06(s,2H)。ESI-MS m/z:339.1278[M+H]+。
I:4,6-二氨基-2-[1-(噻吩-2-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯
称取0.8g(2.364mmol)步骤H产物溶于35mL吡啶中,置冰浴搅拌15min,然后用注射器吸取0.39g(3.948mmol)氯代甲酸甲酯加入反应液中,继续冰浴反应2h,撤去冰浴,室温反应过夜。TLC监测反应完全,减压蒸除溶剂,干燥,得1.2g黄色固体粗品。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm 8.95(dd,J=8.1,1.6Hz,1H),8.79(dd,J=4.5,1.5Hz,1H),8.74-8.65(m,2H),8.37(s,1H),7.70(s,3H),7.63(ddd,J=7.7,4.6,1.5Hz,2H),7.21(d,J=2.5Hz,1H),7.00(dd,J=5.1,3.5Hz,1H),6.03(s,2H),3.65(s,3H)。ESI-MSm/z:397.13[M+H]+。
实施例2:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸异丙酯
A:3-氰基-1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶
称取7.42g(41.629mmol)3-(氯甲基)-5-甲基吡啶盐酸盐和6g(41.629mmol)3-氰基-1H-吡唑[3,4-b]吡啶溶于120mLDMF中,搅拌下加入14.36g(104.06mmol)K2CO3,搅拌片刻,油浴加热40℃左右反应过夜,TLC监测,基本反应完。往反应液中加入200mL水,乙酸乙酯(120mL*3)萃取,80mL饱和食盐水洗涤,有机相用无水Na2SO4干燥,柱层析分离,得白色固体8.77g,收率84.5%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δδppm 8.81(dd,J=4.5,1.5Hz,1H),8.51(dd,J=8.2,1.5Hz,1H),8.43(d,J=1.8Hz,1H),8.36(d,J=1.5Hz,1H),7.55(dd,J=8.2,4.5Hz,2H),5.85(s,2H),2.25(s,3H)。ESI-MS m/z:250.1102[M+H]+。
B:1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰亚胺酸甲酯
称取9.48g(38.03mmol)实施例2步骤A产物溶于400mL甲醇中,搅拌下加入8.77g(162.34mmol)甲醇钠,室温搅拌反应2h。TLC监测,反应完全,得单一产物,直接用于下一步反应。
C:1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒
用注射器吸取8.7mL(152.14mmol)冰醋酸加入实施例实施例2步骤B产物的反应液中,然后再加入3g(55.056mmol)NH4Cl,油浴加热,64℃左右回流反应过夜。TLC监测,基本反应完,减压蒸除溶剂,然后加入400mL水和12g(86.96mmol)K2CO3,搅拌,加入适量NaCl至水饱和,乙酸乙酯(150mL*5)萃取,有机相用无水MgSO4干燥,抽滤,减压蒸除溶剂,干燥,得白色固体8g,收率79.0%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm 8.71-8.59(m,2H),8.36(dd,J=20.8,1.7Hz,2H),7.50(s,1H),7.35(dd,J=8.0,4.5Hz,1H),6.78(s,3H),5.73(s,2H),2.24(s,3H)。ESI-MS m/z:267.1354[M+H]+。
D:2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-[(E)苯基二氮烯基]-4,6-嘧啶二胺
称取3.9g(22.92mmol)实施例2步骤C产物和6g(22.53mmol)苯偶氮丙二腈溶于120mL DMF中,N2保护下于110℃左右反应12h,TLC监测,基本反应完,冷却,减压抽滤,滤饼用适量水洗涤,滤液加入适量的水至不再产生固体,抽滤,滤饼用10%的乙醇洗涤,干燥,共得橙黄色固体7g,收率71.2%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm 9.20(d,J=8.0Hz,1H),8.67(d,J=4.5Hz,1H),8.54(s,2H),8.39(d,J=26.1Hz,2H),8.03(d,J=8.2Hz,2H),7.93(s,2H),7.44(ddd,J=20.5,13.8,7.4Hz,5H),5.81(s,2H),2.25(s,3H)。ESI-MS m/z:437.4[M+H]+。
E:2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺
称取6.88g(15.763mmol)实施例2步骤C产物溶于150mL DMF中,加入3.89g Raney-Ni(湿重),置氢化罐,于65℃,65Bar条件下催化氢化反应12h,TLC监测,剩少量原料未反应,继续反应12h,TLC监测反应完全,用硅藻土滤去Raney-Ni,减压蒸除溶剂,柱层析分离,得黄色固体4.73g,收率86.4%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6),δppm9.03(d,J=7.8Hz,1H),8.59(s,1H),8.35(d,J=21.2Hz,2H),7.37(d,J=56.7Hz,2H),6.34-5.11(m,6H),4.07(s,2H),2.23(s,3H)。ESI-MS m/z:348.2[M+H]+。
F:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸异丙酯
称取0.6g(1.73mmol)2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺溶于35mL吡啶中,冰浴搅拌15min,用注射器吸取0.36g(2.94mmol)的氯代甲酸异丙酯滴加至反应液中,继续冰浴反应2h,撤去冰浴,室温反应过夜。TLC监测,反应完全,减压蒸除溶剂,干燥的淡黄色固体0.75g,收率约100%。Mp.252~254℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.96(dd,J=8.1,1.6Hz,1H),8.84-8.68(m,2H),8.59(s,1H),8.47(s,1H),8.24(dd,J=15.9,8.1Hz,1H),7.93-7.62(m,5H),7.54(dd,J=8.1,4.5Hz,1H),5.92(s,2H),4.89-4.76(m,1H),2.31(s,3H),1.20(d,J=61.6Hz,6H)。ESI-MS m/z:434.3[M+H]+。纯度99.1%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水(40∶60)(1.0mL/min),波长:210nm)。
实施例3:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3--基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸乙酯
方法同实施例2,将2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺和氯代甲酸乙酯反应得淡黄色固体。Mp.192~194℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.05(d,J=8.0Hz,1H),8.65(d,J=4.3Hz,1H),8.36(d,J=21.7Hz,2H),8.05(s,1H),7.61-7.20(m,2H),6.43(s,4H),5.78(s,2H),4.07(d,J=6.9Hz,2H),2.23(s,3H),1.25(t,J=6.5Hz,3H)。ESI-MS m/z:420.1573[M+H]+,442.1330[M+Na]+。纯度96.1%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例4:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3--基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸环戊酯
方法同实施例2,将2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺与氯代甲酸环戊酯反应得淡黄色固体。Mp.238~240℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm8.96(dd,J=8.1,1.5Hz,1H),8.77(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.53(s,1H),8.43(s,1H),8.23(s,1H),7.96-7.59(m,5H),7.54(dd,J=8.1,4.5Hz,1H),5.89(s,2H),5.03(s,1H),2.29(s,3H),1.93-1.35(m,8H)。ESI-MS m/z:460.2334[M+H]+,482.1980[M+Na]+。纯度97.9%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例5:4,6-二氨基2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯
方法同实施例2,将2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺和氯代甲酸甲酯反应得淡黄色固体。Mp.236~248℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.06(dd,J=8.0,1.4Hz,1H),8.62(dd,J=4.5,1.5Hz,1H),8.39(s,1H),8.33(s,1H),8.02(s,1H),7.44(s,1H),7.35(dd,J=8.1,4.5Hz,1H),6.20(s,4H),5.76(d,J=5.8Hz,2H),3.62(s,3H),2.23(s,3H)。ESI-MS m/z:406.5[M+H]+,428.3[M+Na]+。纯度97.9%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)
实施例6:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(甲基)氨基甲酸环戊酯
称取0.148g(0.3213mmol)实施例4化合物装入反应瓶中,加入2mL无水THF,置冰浴搅拌30min,用注射器吸取0.64mL 1.06mol/L的LiHMDS四氢呋喃溶液加至反应液中,继续冰浴搅拌20min,然后用微量进样器将20μL(0.3213mmol)CH3I加入反应液,继续反应4.5h,冰块自然融化。TLC监测,反应完全。往反应液中加入2mL5%的NH4Cl水溶液淬灭反应,再另加入8mL水,乙酸乙酯(25mL*3)萃取,减压蒸除溶剂,柱层析分离,得黄白色固体0.11g,收率72.1%。mp.240~242℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.07(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),8.62(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.36(d,J=21.1Hz,2H),7.43(s,1H),7.34(dd,J=8.0,4.5Hz,1H),6.33(s,4H),5.75(s,2H),5.04-4.93(m,1H),3.06-2.87(m,3H),2.23(s,3H),1.87-1.30(m,8H),ESI-MS m/z:474.2[M+H]+,496.5[M+Na]+。纯度100%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例7:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(甲基)氨基甲酸乙酯
方法同实施例6,实施例3化合物与碘甲烷反应得浅黄色固体。Mp.277~280℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.07(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.5Hz,1H),8.35(dd,J=17.5,1.6Hz,2H),7.52-7.29(m,2H),6.39(s,4H),5.75(s,2H),4.01(q,J=7.1Hz,2H),3.00(s,3H),2.22(s,3H),1.09(t,J=7.1Hz,3H)。ESI-MS m/z:433.3[M+H]+,456.3[M+Na]+。纯度99.7%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例8:4,6-二氨基2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(甲基)氨基甲酸异丙酯
方法同实施例6,实施例2化合物与碘甲烷反应得浅黄色固体。mp.276~279℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-D6)δppm 9.07(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.35(dd,J=17.1,1.6Hz,2H),7.42(s,1H),7.34(dd,J=8.0,4.5Hz,1H),6.32(s,4H),5.75(d,J=2.2Hz,2H),4.80(dt,J=12.6,6.3Hz,1H),2.99(s,3H),2.23(s,3H),1.09(d,J=6.3Hz,6H)。ESI-MS m/z:448.2[M+H]+,470.2[M+Na]+。纯度97.0%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例9:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(乙基)氨基甲酸乙酯
方法同实施例6,实施例4化合物与碘乙烷反应得白色固体。Mp.261~264℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.08(d,J=8.1Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.37(s,1H),8.33(d,J=1.4Hz,1H),7.42(s,1H),7.34(dd,J=8.1,4.5Hz,1H),6.30(s,4H),5.75(s,2H),4.02(dd,J=14.0,6.9Hz,2H),3.49(dt,J=14.2,7.1Hz,2H),2.23(s,3H),1.14(m,6H)。ESI-MS m/z:448.3[M+H]+,470.1[M+Na]+。纯度95.2%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例10:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(乙基)氨基甲酸异丙酯
方法同实施例6,实施例2化合物与碘乙烷反应得白色固体。Mp.269~271℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.08(d,J=8.1Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.37(s,1H),8.33(d,J=1.4Hz,1H),7.42(s,1H),7.34(dd,J=8.1,4.5Hz,1H),6.30(s,4H),5.75(s,2H),4.02(dd,J=14.0,6.9Hz,2H),3.49(dt,J=14.2,7.1Hz,2H),2.23(s,3H),1.14-0.75(m,6H)。ESI-MS m/z:461.3[M+H]+,484.3[M+Na]+。纯度97.7%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例11:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(乙基)氨基甲酸环戊酯
方法同6,实施例4与碘乙烷反应得白色固体。Mp.178~180℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.08(d,J=8.1Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.37(s,1H),8.33(d,J=1.4Hz,1H),7.42(s,1H),7.34(dd,J=8.1,4.5Hz,1H),6.30(s,4H),5.75(s,2H),4.02(dd,J=14.0,6.9Hz,2H),3.49(dt,J=14.2,7.1Hz,2H),2.23(s,3H),1.14-0.75(m,6H)。ESI-MS m/z:[M+H]+。纯度99.8%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例12:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(甲基)氨基甲酸甲酯
方法同实施例6,实施例5与碘甲烷反应得白色固体。Mp.252~254℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.05(dd,J=8.0,1.5Hz,1H),8.65-8.57(m,1H),8.35(d,J=16.7Hz,2H),7.41(s,1H),7.34(dd,J=8.0,4.5Hz,1H),6.42(s,4H),5.75(s,2H),3.66(s,1H),3.53(s,2H),3.00(s,3H),2.22(s,3H)。ESI-MS m/z:420.20[M+H]+,442.17[M+Na]+。纯度96.2%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm。
实施例13:4,6-二氨基-2-[1-(5-甲基吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(乙基)氨基甲酸甲酯
方法同实施例6,实施例5与碘乙烷反应得白色固体。mp 264~265℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(dd,J=8.1,1.6Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.35(d,J=17.9Hz,2H),7.41(s,1H),7.34(dd,J=8.0,4.5Hz,1H),6.35(s,4H),5.75(s,2H),3.67(s,1H),3.60-3.40(m,4H),2.22(s,3H),1.06(t,J=7.3Hz,3H)。ESI-MS m/z:434.22[M+H]+,889.38[2M+Na]+。纯度95.3%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm。
实施例14:N-{4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}乙酰胺
A:(2-氟吡啶-3-基)甲醇
称取10g(70.87mmol)2-氟烟酸溶于330mL无水四氢呋喃中,冰浴搅拌片刻,小份慢慢加入4.3g(113.07mmol)LiA1H4,产生大量气泡,随着加入LiA1H4量的增加,反应液由白色浑浊边黄色浑浊,加毕,继续反应2omin,TLC监测,反应完全,缓慢加入10.6mL水淬灭反应,产生大量气泡及固体,抽滤,滤液减压蒸除溶剂,得黄色液体7.78g,待用。
B:(3-氯甲基)-2-氟吡啶
将(3-氯甲基)-2-氟吡啶溶于85mL二氯甲烷,冰浴10min,缓慢滴加21.7mL(306.04mmol) 二氯亚砜,反应液由黄色变棕色,滴毕,继续冰浴反应2h,TLC监测,反应完全,继续冰浴片刻,缓慢滴加100mL水,N2吹送,碱液吸收废气,二氯甲烷(100mL*3)萃取,100mL饱和食盐水洗涤,无水MgSO4干燥,减压蒸除溶剂,得7.14g棕色液体,待用。1H-NMR(400MHz,CHLOROFORM-d1)δppm8.20(d,J=4.8Hz,1H),7.89(ddd,J=9.3,7.6,1.7Hz,1H),7.26-7.19(m,1H),4.63(s,2H)。
C:3-氰基-1-(2-氟吡啶3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶
将上述所得3-氯甲基)-2-氟吡啶和5.44g 3-氰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶溶于110mL DMF中,加入10.42g K2CO3,N2保护,室温搅拌30min,然后于40℃,N2保护下反应过夜。TLC监测,反应完全,加入200mL水搅拌,乙酸乙酯(110mL*3)萃取,60mL饱和食盐水洗涤,无水MgSO4干燥,抽滤,减压蒸除溶剂,柱层析分离,得白色固体7.54g,收率78.9%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.81(dd,J=4.5,1.5Hz,1H),8.53(dd,J=8.2,1.5Hz,1H),8.27-8.19(m,1H),7.92(ddd,J=9.6,7.4,1.9Hz,1H),7.56(dd,J=8.2,4.5Hz,1H),7.37(ddd,J=7.1,4.9,1.8Hz,1H),5.91(s,2H)。
D:1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲酰亚胺酸甲酯
称取7g(27.64mmol)3-氰基-1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶溶于295mL甲醇中,加入5.97g(110.51mmol)甲醇钠,室温搅拌反应2h。TLC监测,反应完全,产物单一,待用。
E:1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-甲脒
向上述实施例D步骤所得产物的反应液中加入6.33mL(110.57mmol)和2.96g(55.34mmol)NH4Cl,64℃反应10h,TLC监测,有少量原料未反应完,减压蒸除溶剂,加入70mL丙酮,搅拌数分钟,抽滤,少量丙酮洗涤,滤饼加入300mL水中,搅拌下加入9.9g(71.74mmol)K2CO3,乙酸乙酯(200mL*4)萃取,减压蒸除溶剂,用15mL EtOAc-PE(2∶1)混合溶剂搅拌,静置,倒出溶剂,干燥,得白色固体6.28g,收率84.0%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.69(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),8.63(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.19(d,J=4.7Hz,1H),7.72(ddd,J=9.6,7.5,1.8Hz,1H),7.40-7.28(m,2H),6.60(s,3H),5.79(s,2H)。
F:2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-[(E)苯基二氮烯基]-4,6-嘧啶二胺
称取5.5g(20.35mmol)实施例E步骤所得产物和3.5g(20.5676mmol)苯偶氮丙二腈溶于110mL DMF中,至于微波反应器中110℃反应30min,功率为50W。TLC监测,反应完全,冷却,抽滤,滤饼用适量水洗涤,得鲜黄色固体,滤液加入适量水至不再有固体析出,抽滤,滤饼用少量10%乙醇洗涤,得土黄色固体,干燥,共得产物7.96g,收率88.8%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.21(dd,J=8.1,1.6Hz,1H),8.66(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.53(s,2H),8.21(d,J=4.9Hz,1H),8.03(dd,J=8.2,1.0Hz,2H),7.91(s,2H),7.75(ddd,J=9.5,7.6,1.7Hz,1H),7.50(t,J=7.7Hz,2H),7.46-7.32(m,3H),5.86(s,2H)。
G:2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺
称取4.81g(10.92mmol)实施例E步骤所得产物溶于92mL DMF中,加入2.3g Raney-Ni(湿重),65℃,65Bar催化氢化10h。TLC监测,反应完全,加入400mL水,乙酸乙酯(300mL*6),柱层析分离,得淡黄色固体2.85g,收率75.0%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.05(dd,J=8.1,1.6Hz,1H),8.57(dd,J=4.5,1.7Hz,1H),8.18(d,J=4.5Hz,1H),7.79-7.62(m,1H),7.32(ddd,J=10.3,6.4,3.2Hz,2H),5.82(s,4H),5.76(s,2H),4.06(s,2H)。
H:N-{4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}乙酰胺
称取0.5g(1.423mmol)2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺溶于15mL DMF中,加入0.55g(1.423mmol)的HBTU和0.257g(0.3285mmol)ipriNEt,搅拌下加入82.5μL冰醋酸,室温反应过夜。TLC监测,基本反应完,加入50mL饱和食盐水,振摇,抽滤,柱层析分离,得棕黄色固体0.52g,收率92.9%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.07(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),8.67-8.55(m,2H),8.19(d,J=4.2Hz,1H),7.72-7.62(m,1H),7.38-7.27(m,2H),6.18(s,4H),5.81(s,2H),2.01(s,3H)。ESI-MSm/z:390.18[M+H]+,412.16[M+Na]+。
实施例15:N-{4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}-N-甲基乙酰胺
称取0.1g(0.254mmol)N-{4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-5-基}乙酰胺溶于1.5mL无水THF中,冰浴15min,加入0.26mL(0.254mmol,1M的THF溶液)LiMHDS,继续冰浴20min,加入16μL(0.254mmol)碘甲烷,反应过夜,冰块自然融化,TLC监测,加入1.5mL 5%的氯化铵溶液淬灭反应,另加6mL水,乙酸乙酯(20mL*3)萃取,柱层析分离,得白色固体0.1g,收率96.0%。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6) δppm9.13-9.01(m,1H),8.61(dd,J=4.5,1.7Hz,1H),8.19(d,J=4.8Hz,1H),7.73-7.58(m,1H),7.43-7.21(m,2H),6.59(s,4H),5.82(s,2H),2.97(s,3H),1.78(s,3H)。
实施例16:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯
方法同实施例14步骤H,2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺与氯代甲酸甲酯反应得淡黄色固体。Mp.248~250℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.07(dd,J=8.0,1.6Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.18(d,J=4.7Hz,1H),8.02(s,1H),7.68(t,J=8.0Hz,1H),6.25(s,4H),5.81(s,2H),3.62(s,3H)。ESI-MS m/z:410.1[M+H]+,432.3[M+Na]+。纯度97.5%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=30∶70,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例17:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸环戊酯
方法同时实例16:2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺与氯代甲酸环戊酯反应得淡黄色固体。Mp.250~253℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm9.08(dd,J=8.1,1.6Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.19(d,J=4.6Hz,1H),7.93(s,1H),7.69(t,J=8.7Hz,1H),7.43-7.25(m,2H),6.17(s,4H),5.81(s,2H),5.02(s,1H),1.71(dd,J=59.2,44.8Hz,8H)。ESI-MS m/z:464.20[M+H]+。纯度99.3%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈、水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例18:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸异丙酯
方法同时实例16:2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺与氯代甲酸异丙酯反应得淡黄色固体。Mp.187~190℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.07(dd,J=8.1,1.5Hz,1H),8.62(d,J=4.4Hz,1H),8.19(d,J=4.5Hz,1H),7.95(s,1H),7.79-7.60(m,1H),7.48-7.23(m,2H),6.24(s,4H),5.82(s,2H),4.82(dt,J=12.5,6.2Hz,1H),1.51-0.82(m,6H)。ESI-MS m/z:438.3[M+H]+,460.3[M+Na]+。纯度99.4%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例19:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(甲基)氨基甲酸甲酯
方法同实施例15,称取实施例16化合物与碘甲烷反应的白色固体。Mp.280~282℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.07(dd,J=8.0,1.5Hz,1H),8.60(dd,J=4.4,1.7Hz,1H),8.18(d,J=4.7Hz,1H),7.72-7.55(m,1H),7.42-7.22(m,2H),6.42(s,4H),5.81(s,2H),3.65(s,1H),3.53(s,2H),3.00(s,3H)。ESI-MS m/z:424.19[M+H]+,446.17[M+Na]+。纯度99.6%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例20:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(甲基)氨基甲酸异丙酯
方法同实施例15,称取实施例18化合物与碘甲烷反应的白色固体。Mp.279~281℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.09(dt,J=4.4,2.2Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.19(d,J=4.7Hz,1H),7.66(t,J=8.7Hz,1H),7.44-7.23(m,2H),6.35(s,4H),5.81(s,2H),4.80(dt,J=12.5,6.3Hz,1H),2.99(s,3H),1.18(dd,J=70.2,6.3Hz,6H)。ESI-MSm/z:452.22[M+H]+,474.20[M+Na]+。纯度98.9%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例21:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(甲基)氨基甲酸环戊酯
方法同实施例15,称取实施例17化合物与碘甲烷反应的黄白色固体。mp 237~239℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.08(dt,J=8.0,2.5Hz,1H),8.61(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.19(d,J=4.7Hz,1H),7.81-7.59(m,1H),7.34(ddt,J=12.4,4.9,2.4Hz,2H),6.35(s,4H),5.81(s,2H),4.98(s,1H),2.98(s,3H),1.88-1.12(m,8H)。ESI-MS m/z:478.24[M+H]+。500.22[M+Na]+。纯度99.5%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例22:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(乙基)氨基甲酸异丙酯
方法同实施例15,称取实施例18化合物与碘乙烷反应的白色固体。Mp.289~291℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.11(d,J=8.0Hz,1H),8.68-8.55(m,1H),8.19(d,J=4.8Hz,1H),7.67(t,J=8.8Hz,1H),7.33(ddd,J=8.3,7.2,3.6Hz,2H),6.27(s,4H),5.82(s,2H),4.83(dt,J=12.6,6.4Hz,1H),3.50(dd,J=14.4,7.2Hz,2H),1.38-1.19(m,2H),1.16-0.99(m,7H)。ESI-MS m/z:466.21[M+H]+,488.19[M+Na]+。纯度96.5%(经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例23:4,6-二氨基-2-[1-(2-氟吡啶-3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基(乙基)氨基甲酸环戊酯
方法同实施例15,称取实施例17化合物与碘乙烷反应的黄白色固体。Mp.222~224℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 9.10(d,J=8.0Hz,1H),8.67-8.52(m,1H),8.19(d,J=4.7Hz,1H),7.68(t,J=8.3Hz,1H),7.40-7.24(m,2H),6.25(s,4H),5.81(s,2H),5.01(s,1H),3.49(dd,J=14.4,7.1Hz,2H),1.83-0.81(m,11H)。ESI-MS m/z:492.23[M+H]+。纯度100%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例24:6-氨基-2-[1-(2-氟吡啶3-基)甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基]嘧啶-4,5-二氨基甲酸异丙酯
此化合物为合成实施例23时分出的一个副产物,白色固体。Mp.>300℃。1H-NMR(400MHz,CD3Cl)δ8.98(d,J=7.4Hz,1H),8.59(dd,J=4.5,1.6Hz,1H),8.09(d,J=4.8Hz,1H),7.71(s,1H),7.37(s,1H),7.30(dd,J=8.1,4.5Hz,1H),7.24(d,J=8.5Hz,1H),7.05-6.97(m,1H),5.92(s,2H),5.54(s,2H),5.02(ddt,J=27.1,12.5,6.2Hz,2H),1.30(dd,J=19.4,6.2Hz,12H).ESI-MSm/z:524.22[M+H]+,546.20[M+Na]+。纯度99.4%,经HPLC分析,色谱柱:C18 5μ250*4.6mm,流动相:乙腈/水=40∶60,流速:1.0mL/min,波长:210nm)。
实施例25:RNA水平上调实验:测定实施例化合物对人肺动脉平滑肌细胞SerpinB2和GREM1基因的RNA上调水平
细胞的培养和给药:
人肺动脉平滑肌原代细胞在平滑肌细胞培养基(ScienCell),37℃,5%CO2培养,经传代至3~7代后,往细胞培养基中加入100mM的受试样品0.5μL,轻轻混匀,室温孵育8小时。
RNA提取:
适量细胞沉淀加入1mL Trizol试剂,反复吹打,使充分裂解。裂解液转移至DEPC处理过的Eppendorf管中冰上孵育5min,使核蛋白复合物完全分离。加入0.2mL氯仿,剧烈晃动15s,冰上孵育3~5min。12000rpm,4℃离心15min,混合物分为三层,上层为RNA。将上层液相移至DEPC处理过的Eppendorf管中,加入0.5mL异丙醇,混匀后冰上孵育20min。4℃,12000rpm,离心10min。移走上清,小心地用75%的乙醇(用DEPC处理过的去离子水配制)洗涤沉淀。7500rpm,4℃离心3min,弃上清。室温干燥10分钟,加入20μL无RNase的水溶解RNA。分装后于-80℃冰箱保存备用。
逆转录:
各取5μg细胞总RNA用MMLV逆转录试剂盒完成cDNA第一链合成。5μg总RNA、1μLoligodT(0.5μg/μL)与10mM dNTPs混合物1μL混匀,加入DEPC处理过的去离子水至10μL。65℃作用5分钟使RNA变性,而后立即转移至冰上,作用至少1分钟。依次加入10×逆转录反应缓冲液2μL(200mM Tris-HCl,pH 8.4,500mM KCl)、25mM MgCl24μL、0.1M DTT 2μL、RNA酶抑制剂1μL,混匀,42℃作用2分钟。加入1μLMMLV逆转录酶,42℃作用50分钟,72℃15分钟灭活逆转录酶。加入1μL大肠杆菌RNA酶H(2单位/μL),37℃作用15分钟以消化单链RNA。反应产物即为cDNA第一链。
Real-time PCR:
Real-time PCR的反应根据SYBR-Green方法进行半定量,以ACTIN基因为内参,iQ5Multicolor Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad)进行检测。SerpinB2基因引物为5’-TCCATTCATCCTTCCGCTCT-3’(上游),5’-AAGTCTACTGCCTG GGGTTC-3’(下游);ACTIN基因引物为5’-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3’(上游),5’-AGGGGCCGGACTC GTCATACT-3,(下游)。Real-Time PCR反应体系如下:2×SYBR-Green Premix EX TaqTM试剂;50ng DNA‘基因引物0.1μM,终体积20μl。反应条件为95℃5分钟、95℃5秒、60℃30秒、40循环,通过分析产物的溶解曲线来确定扩增的特异性,利用CT值方法计算SerpinB2的相对表达量,每次实验重复至少三次。
数据统计与分析:
所获数据均使用SPSS Statistics 20.0及GraphPad Prism 5.01进行统计分析。符合正态分布的计量资料用不符合正态分布的计量资料用中位数及四分位数表示,计数资料用率表示。两组间计量资料的比较根据其分布特点应用独立样本t检验或非参数检验。基线SerpinB2水平用2-ΔCT(ΔCT=CT目的基因-CT内参基因)表示,其中目的基因为SerpinB2,内参基因为ACTIN,根据Real-time PCR结果计算。应用变量相关性分析明确基线SerpinB2水平是否与肺动脉高压严重程度相关,计算Pearson相关系数。P<0.05被认为差异或相关性具有统计学意义。
实验结果:
以100nM的受试样品对人肺动脉平滑肌细胞的SerpinB2和GREM1的RNA上调水平对化合物进行筛选。结果如表1所示。
表1.受试化合物对SerpinB2和GREM1的RNA水平提高情况
注:空白组加等量的DMSO
实施例26:血管环舒张实验,测定实施例化合物对大鼠胸主动脉血管的舒张作用
1)离体胸主动脉血管环的制备:
将大鼠断头处死,迅速取出胸主动脉,置于盛有冰冷的氧饱和的改良Kreb′s-Henseleit液(NaCl 118酬,NaHCO3mM,KCl 4.7mM,MgCl21.2mM,KH2PO4,1.2mM,CaCl22.5mM,葡萄糖10mM,pH 7.4±0.5)的培养皿中,小心洗去血栓并除去血管外结缔组织。
将血管剪成3mm宽的血管环,置于10ml含有Kreb′s-Henseleit液的37℃恒温浴槽中,下端固定,上端通过张力换能器连于多导生理记录仪。组织浴槽内持续通入95%氧和5%二氧化碳的混合气体,每5min更换营养液一次,待血管环孵育20-30分钟后,给予血管环2g预负荷,稳定45-60分钟。以3×10-7mol·L-1去甲肾上腺素(NE)诱发血管环收缩,待收缩达到最大值并平衡后(约8-10分钟),更换营养液,洗除阻,重新达到平衡。以此时张力值作为基础张力值,开始观察处理因素对血管张力的影响。
2)药物处理:
血管孵育到达平衡后,将3×10-7mol·L-1NE注入浴槽内预收缩血管环,待收缩达最大且稳定后,以浓度递增的方式给予受试化合物,观察受试化合物对去甲肾上腺素(NE)收缩血管环的舒张作用:计算舒张百分率和每个化合物的EC50值。
3)数据处理方法:
3×10-7mol/L NE诱导的最大张力值=给予3×10-7mol/L NE血管收缩平衡后的张力值-基础张力值
化合物舒张值=3×10-7mol/LNE诱导的最大张力值-给予受试化合物后的张力值
舒张百分率=舒张值/最大收缩值×100%
4)化合物对大鼠胸主动脉血管的舒张作用:
以3×10-7mol/L的NE预收缩大鼠胸主动脉环(1.50-2.2g,P<0.01),平衡后以浓度递增方式给予受试化合物,观察新化合物对去甲肾上腺素诱导的血管收缩的舒张作用,溶剂组给予含有1/1000DMSO的Kreb′s-Henseleit营养液。
5)结果1:新化合物特定浓度下的最大舒张作用。
选择浓度(3*10-6M)进行化合物的评价,测定化合物加入后产生的最大舒张效应。测定结果见表2.
表2.化合物对去甲肾上腺素造成己收缩大鼠胸主动脉环的舒张作用
空白溶剂由Kreb′s-Henseleit缓冲液组成,含有1/1000体积的DMSO)。舒张值为平均值±偏差,n=3-4。
6)结果2:多剂量累加实验结果:反应受试化合物在单位时间(5分钟)内舒张作用强弱
受试化合物5个浓度(1×10-8M、3×10-8M、1×10-7M、3×10-7M、10-6M)依次加入,每个浓度孵育时间为5分钟(前一个浓度化合物尚未达到最大舒张效应,达到5分钟时即加入下一个浓度)。随时间延长,溶剂组收缩张力有8-15%的降低:受试实施例化合物4,5,6,7可浓度依赖性的显著舒张胸主动脉,化合物的IC50值如表3所示(最大舒张率以100%计算)。
表3.化合物对去甲肾上腺素造成己收缩大鼠胸主动脉环的舒张作用IC50值
样品代号 | Mean±s.d |
实施例7 | 6.76E-07±1.32E-06 |
实施例8 | 3.58E-07±4.00E-07 |
实施例19 | 8.59E-08±6.05E-08 |
SGC002(对照药) | 3.00E-07±3.78E-07 |
化合物每种浓度处理大鼠胸主动脉环5min。空白溶剂由Kreb′s-Henseleit缓冲液组成,含有1/1000体积的DMSO)。数值为平均值±偏差,n=2-6。
Claims (11)
1.式I所示的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物。
其中:
R1为噻吩或取代吡啶基,
R2为氨基或取代氨基,
R3为氢或C1~C4的烷基,
R4为C1~C6的烷基。
2.如权利要求1所述的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物。
其中:
R1为:
R2为-NH2、-NHCH3、-NHC(=O)CH(CH3)2,
R3为氢、甲基或乙基,
R4为甲基、乙基、异丙基、环戊基或环己基。
3.如权利要求2所述的化合物及其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物,其中所述化合物优选具有下面结构。
4.制备权利要求1~3任一项所述化合物的方法,其包括:
1)氯甲基噻吩或氯甲基取代吡啶(II)与3-氰基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(III)反应得到中间体3-氰基-1-噻吩甲基/吡啶基甲基取代-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(IV)。
其中:R1的定义如权利要求1所述。
2)2-(1-噻吩甲基或取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-4,5,6-嘧啶三胺(V)与氯甲酸酯(VI)反应得到中间体4,6-二氨基-2-(1-噻吩甲基/取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-5-嘧啶基氨基甲酸酯(VII)。
其中:R1、R2、R4的定义如权利要求1所述。
式V化合物通过如下反应路线制备:
3)4,6-二氨基-2-(1-噻吩甲基或取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-5-嘧啶基氨基甲酸酯(VII)与R4-X(VIII)反应得到4,6-二氨基-2-(1-噻吩甲基/取代吡啶基甲基-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-3-基)-5-嘧啶基(烷基)氨基甲酸酯(I)。
其中:R1、R2、R3、R4的定义如权利要求1所述,X为离去基团。
5.一种药物,其包含至少一种如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物和至少一种其他的赋形剂。
6.一种药物,其包含至少一种如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物和与其结合的至少一种有机硝酸盐或NO供体。
7.一种药物,其包含至少一种如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物和与其结合的至少一种可以抑制cGMP分解的化合物。
8.如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物用于制备治疗心血管疾病的药物方面的应用。
9.如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物用于制备治疗高血压的药物方面的应用。
10.如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物用于制备治疗血栓栓塞性疾病和局部缺血的药物方面的应用。
11.如权利要求9~10中任意一项所述的应用,其中使用如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂化物和与其结合的至少一种有机硝酸盐或NO供体或与其结合的至少一种可以抑制cGMP分解的化合物。
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