CN107929281B - 银杏内酯组合物的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及银杏内酯的用途，具体涉及银杏内酯组合物在制备预防/治疗亨廷顿病药物中的应用。通过实验证明银杏内酯组合物能够显著延长进入暗室的潜伏期，显著减少进入暗箱的错误次数，显著缩短模型大鼠在水迷宫中游泳时间和游泳距离，即缩短模型大鼠在水迷宫中寻找目标平台的过程，表明其能够改善模型大鼠学习记忆能力。其次，银杏內酯组合物能够显著升高纹状体中DA、DOPAC、5‑HT等单胺类神经递质的含量，相对增强的中枢DA功能降低，从而使胆碱系统功能平衡。因此，银杏内酯组合物具有制备成预防/治疗亨廷顿病药物的作用与应用价值。

Description

银杏内酯组合物的医药用途

技术领域

本发明属于涉及医药技术领域，特别是涉及银杏内酯组合物在治疗/预防亨廷顿病中的应用。

背景技术

亨廷顿病(Huntington's disease，HD)，又称大舞蹈病或亨廷顿舞蹈症(Huntington's chorea)，是一种常见的神经退行性疾病。该病由美国医学家乔治亨廷顿于1872年发现，因而得名。主要病因是患者第四号染色体上的编码亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)的基因发生突变，产生了变异的蛋白质，该蛋白质在细胞内逐渐聚集在一起，形成大的分子团，在脑中积聚，影响神经细胞的功能，临床表现以学习记忆障碍(痴呆)及运动障碍(舞蹈症)为主要特征，病理学检查发现HD病人脑内纹状体退变，生化改变为中枢多巴胺能系统与胆碱系统功能失衡。迄今为止，此病尚无良好有效的治疗方法。

HD动物模型一般归为遗传和非遗传两类。非遗传类模型又称之为经典的HD动物模型。经典模型通过兴奋性中毒机制或线粒体崩解诱发细胞死亡。越来越多的证据表明神经退行性疾病的发生与线粒体缺陷相关。HD病人的线粒体复合体Ⅱ/Ⅲ活性显著下降，而复合体IV的活性下降轻微。3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)是一种不可逆抑制线粒体酶琥珀酸脱氢酶的毒素，是线粒体复合体Ⅱ/Ⅲ抑制剂。其可以选择性引起纹状体的退变，其引起的病理改变与HD病人十分相似，因此，可以应用3-NP选择性地抑制线粒体复合体Ⅱ/Ⅲ活性，以建立模拟神经退行性疾病尤其是亨廷顿病临床表现的动物模型。

与大多数神经变性疾病一样，亨廷顿病缺乏特异性的治疗方法。目前尚无十分有效的药物可以延缓亨廷顿病的进展，但舞蹈样动作、精神障碍等常见症状通过合理的药物治疗均可获得不同程度的改善，而且还可以提高患者的生活质量并防止并发症发生。因此，在现阶段缺乏有效治疗方法的情况下，应重视对症治疗。氟哌啶醇是目前临床中常用的控制亨廷顿病症状的药物，作为多巴胺(dopamine,DA)受体阻滞剂，可以阻断DA受体，使HD病人相对增强的中枢DA功能降低，而与胆碱系统功能平衡。

银杏叶提取物是目前国际上使用最为广泛的中药提取物之一，其中银杏内酯是银杏叶提取物及其制剂主要的药效活性成分，具有拮抗血小板活化聚集、降脂、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、保护神经系统等广泛的药理作用。目前还未见银杏叶提取物能对亨廷顿病具有治疗或预防作用的相关报道。

发明内容

本发明对银杏内酯提取物的组合物进行研究，旨在得到一种具有治疗或预防亨廷顿病的银杏内酯组合物。

由此，本发明提出了银杏内酯组合物在制备治疗和/或预防亨廷顿病药物中的应用。

具体地，亨廷顿病药物针对的症状包括舞蹈样动作、认知功能减退和/或精神障碍。

本发明还提出了一种银杏内酯组合物在治疗或预防线粒体复合体Ⅱ/Ⅲ活性下降诱发的神经退行性疾病中的应用。

具体地，线粒体复合体Ⅱ/Ⅲ活性的下降由3-NP诱发。

进一步地，该银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其中，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～40)：(50～75):(0.2～5)。

进一步地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～35)：(50～70):(0.5～4)。

更进一步地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K＝(20～30)：(50～65):(0.8～4)。

具体地，上述亨廷顿病药物或线粒体复合体Ⅱ/Ⅲ活性下降诱发的神经退行性疾病中，银杏内酯组合物静脉滴注给药治疗有效量为0.2-0.8mg/kg/d。需要注意的是，该治疗有效量作为推荐剂量并不对剂量范围产生严格限制。本领域人员能理解，实际给药的用量可能低于上述剂量范围。针对某一对象的治疗有效量和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括给药对象的年龄、体重、性别、饮食、给药时间、疾病易感性、疾病进程、医生的判断。此外，本发明所述银杏内酯组合物可用于相关疾病的单一用药或联合用药治疗。

具体地，银杏内酯组合物可以使用各种药学上可接受的辅料制备成口服给药剂型、注射给药剂型。

进一步地，银杏内酯组合物可以制备成片剂、粉针剂、胶囊剂等等。

本发明采用腹腔注射3-NP复制HD动物模型，给予银杏内酯组合物药物干预后发现3-NP模型动物进入暗室的潜伏期显著延长，进入暗箱的错误次数显著减少；模型大鼠在水迷宫中游出时间和游出距离显著缩短，可见银杏内酯组合物能够显著改善模型大鼠学习记忆能力。其次，银杏内酯组合物药物干预后模型大鼠纹状体中DA、DOPAC、5-HT等单胺类神经递质含量显著升高，可见，银杏内酯组合物能够改善由上述神经递质含量失衡所引发的多动症状的出现。因此，由对于3-NP复制HD动物模型的药效均证实了银杏内酯组合物具有治疗亨廷顿病的作用。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式的内容仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

需要注意的是，如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。

银杏内酯类组合物对3-NP模型大鼠行为及脑内单胺类神经递质含量的影响

1、实验材料

1.1实验动物

SPF级SD大鼠(180～220g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2实验药品及试剂

原料银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由江苏康缘药业股份有限公司自制，具体如下：

3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)、多巴胺(dopamine,DA)、二羟基苯乙酸(dihydrox-yphenylacetic acid,DOPAC)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)购自Sigma；氟哌啶醇由北京市双桥制药厂生产。

1.3主要仪器

避暗箱、Morris水迷宫箱均购自中国医学科学院药物研究所；

1150型高效液相色谱仪为美国惠普公司产品。

2、实验方法

2.1模型建立

3-NP 20mg/kg腹腔注射，隔日1次，共造模20天。正常对照组：蒸馏水灌胃5天后，隔日腹腔注射与模型组等体积的生理盐水。

2.2分组及给药

雄性SD大鼠随机分组，每组10只：正常对照组、模型组、氟哌啶醇阳性对照组(起始剂量为10μg/100g体重，以后隔日递增10μg/100g体重，至100μg/100g体重)、银杏内酯组合物1、2、3、4低、中、高(1.25mg/kg、2.5mg/kg和5mg/kg)剂量治疗组，灌胃给药5天后腹腔注射3-NP，并继续连续给药20天。

2.3大鼠避暗实验

实验的第1天为训练时间，将鼠头向外放入避暗箱明室，动物一般会进人暗室受到电击1-2次。如动物不进入，则将其驱入暗室，使之产生记忆，实验共计5分钟。第2天为测试时间，记录动物四肢全部进人暗室的次数及进入暗室的潜伏期(进人暗室前的时间)，测定时限5分钟。

2.4大鼠Morris水迷宫实验

水迷宫为一直径100cm、高50cm的圆形容器，装置内壁及底部均为黑色，内盛适量水，控制水温在23-25℃。按逆时针方向将水迷宫均匀划分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限，第Ⅱ象限(位置为第Ⅱ象限45°平分线的中点)固定一直径约10cm黑色平台区，隐藏在水平面下约2cm处。实验期间，为减少外界因素对大鼠行为的干扰，实验过程中要尽量保持水温恒定，保证实验人员位置等外界实验环境的稳定性。大鼠每天训练2次，共训练4d，第1天训练时，所选入池位置为站台所对及相邻象限,将大鼠于象限边缘1/2弧度处头朝池壁入水。经180s未找到站台者,将其引领至站台，放置30s，引导其学习记忆。第2-4天重复如上操作。实验结束后记录各动物的游出时间(秒，s)及游出距离(cm)。

2.5脑组织单胺类神经递质含量测定

DA、DOPAC、5-HT标准品都溶于流动相(磷酸氢二钠100mM，乙二胺四乙酸二钠0.5mM，Octyl sulfate sodium salt 1mM，12％甲醇，调pH为3.8，经过滤脱气后使用，流量1.0ml/min。)中，浓度0.1mg/ml，使用时稀释到10ng/ml，进样量10μl。电化学检测器工作电压0.7V，测定温度37℃。标准品在浓度和峰面积间有良好的线性关系，r＞0.99。组织样品制备：纹状体组织内加入0.1M高氯酸(每100ml含L-半胱氨酸5mg，内标DHBA浓度为500ng/ml)0.4ml，制备匀浆，置高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心15min。取上清测定其中的多巴胺及其相关代谢产物的含量。

2.5数据处理

实验数据均以Mean±SD表示，所有数据用SPSS17.0软件进行分析。采用方差分析统计，p＜0.05有统计学差异。

3实验结果

3.1对3-NP模型大鼠避暗实验的影响

实验结果表明：腹腔注射3-NP后，模型大鼠进入暗室的潜伏期显著缩短，进入暗箱的错误次数显著增加；银杏內酯组合物干预后，银杏内酯组合物各剂量组大鼠进入暗室的潜伏期显著延长，进入暗箱的错误次数显著减少。结果见表1。

表1银杏内酯组合物对3-NP模型大鼠避暗实验的影响

注：与正常组相比较：^##p<0.01；与模型组相比较：^*p<0.05，^**p<0.01

3.2对3-NP模型大鼠Morris水迷宫实验的影响

实验结果表明：腹腔注射3-NP后，模型大鼠在水迷宫游出时间和游出距离显著延长；给予银杏內酯组合物后，与模型组大鼠相比，实验第二日银杏內酯组合物1低、中、高剂量组、银杏內酯组合物2中、高剂量组、银杏內酯组合物3、4高剂量组大鼠游泳时间显著缩短。实验第三日及实验第四日，银杏內酯组合物各剂量组大鼠游泳时间均显著缩短；实验第一日银杏内酯组合物1和2中、高剂量组，银杏内酯组合物3和4高剂量组大鼠游泳距离均显著减少，其它实验阶段银杏内酯组合物各剂量组大鼠游泳距离均显著减少。结果见表2，表3。

表2银杏内酯组合物对3-NP模型大鼠Morris水迷宫游泳时间的影响(s)

注：与正常组相比较：^##p<0.01；与模型组相比较：^*p<0.05，^**p<0.01

表3银杏内酯组合物对3-NP模型大鼠Morris水迷宫游泳距离的影响(cm)

注：与正常组相比较：^##p<0.01；与模型组相比较：*p<0.05，**p<0.01

3.3对3-NP模型大鼠脑组织中单胺类神经递质含量的影响

实验结果表明：腹腔注射3-NP，模型组大鼠纹状体中DA、DOPAC、5-HT单胺类神经递质的含量明显降低。银杏內酯各组合物各剂量组均能够显著升高模型大鼠纹状体中DA、DOPAC、5-HT单胺类神经递质的含量(P＜0.01)。结果见表4。

表4银杏内酯组合物对3-NP模型大鼠纹状体中单胺类神经递质的影响(ng/mg纹状体重)

注：与正常组相比较：^##p<0.01；与模型组相比较：*p<0.05，**p<0.01

本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种银杏内酯组合物在制备治疗或预防亨廷顿病药物中的应用,其特征在于，

所述银杏内酯组合物由银杏内酯A、B、K组成，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40)：(50～75):(0.2～5)。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35)：(50～70):(0.5～4)。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30)：(50～65):(0.8～4)。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述治疗或预防亨廷顿病药物针对的症状包括舞蹈样动作、认知功能减退和/或精神障碍。

5.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述治疗或预防亨廷顿病药物选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。