CN107922494A

CN107922494A - 抗pd‑1抗体及其应用

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Publication number: CN107922494A
Application number: CN201680044536.0A
Authority: CN
Inventors: 刘礼乐; 杨欣秀; 罗海山; 刘虎; 帅正蓉; 王健; 钟勤; 段清; 顾红专; 杨达志
Original assignee: Biological Medicine
Current assignee: Biological Medicine
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-07-27
Also published as: EP3328895A1; US20180214548A1; HK1254880A1; CN107922494B; CN106699888B; JP2018527021A; WO2017016497A1; EP3328895A4; CN106699888A; JP7032313B2; US10973915B2

Abstract

本发明提供了一种抗PD‑1抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了编码该抗体的核酸，包含该抗体的组合物，以及制备该抗体并使用该抗体治疗或预防诸如癌症和自身免疫性疾病的疾病的方法。

Description

抗PD-1抗体及其应用

相关申请的交叉引用

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发明领域

本发明涉及单克隆抗PD-1抗体，编码所述抗体的核酸和表达载体，含有所述载体的重组细胞，以及包含所述抗体的组合物。还提供了制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体治疗包括癌症和自身免疫疾病在内的疾病的方法。

发明背景

肿瘤细胞能够通过各种方式“编辑”肿瘤微环境中的宿主免疫来逃避免疫系统。肿瘤实施这种所谓的“癌症免疫逃逸”的一种方式，是通过上调作为免疫系统关键调节剂的免疫检查点蛋白的表达，从而抑制免疫应答。一种这样的免疫抑制共信号由PD-1受体及其配体PD-L1介导。

PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)是一种I型跨膜蛋白，长288个氨基酸，是主要的免疫检查点分子之一(Blank等，2005，癌症免疫疗法，54：307-314)。PD-1主要在激活的T细胞上表达，并且其与配体PD-L1和PD-L2相互作用以诱导抑制信号，从而减少T细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性(Freeman等,2000,J.Exp.Med.,192:1027-34).PD-L1在许多细胞类型上表达，包括T细胞、B细胞、内皮细胞、上皮细胞和抗原呈递细胞，以及肺、肝和心脏组织细胞和几种类型的肿瘤细胞上。相反，PD-L2仅仅在专职抗原呈递的细胞，如树突状细胞和巨噬细胞上表达。

PD-1和PD-L1之间的相互作用对于调节免疫应答是关键的，并且它是表达PD-L1的肿瘤细胞逃避免疫监视的主要机制(Zippelius等，2015，癌症免疫研究.3(3)：236-44)。T细胞PD-1的持续表达高度表征耗竭的表型，因效应功能的下降而被注意。在不同类型的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中观察到这种表型，并且与不良预后和肿瘤复发相关(Wherry，2011，Nat.Immunol.,12：492-99)。

阻断PD-1/PD-L1的相互作用可以激活免疫系统并增强抗肿瘤免疫应答，并且已经在多个同源小鼠肿瘤模型中得到证明，阻断PD-1或其配体促进抗肿瘤活性(Hirano等，2005，癌症研究，65：1089-96)。因此，PD-1和PD-L1之间的相互作用是癌症免疫治疗的有吸引力的靶点。

癌症免疫治疗是癌症治疗的最新突破，其利用患者自身的免疫系统攻击肿瘤细胞。免疫检查点蛋白的抑制剂具有治疗多种肿瘤类型(例如转移性黑素瘤，肺癌，乳腺癌，肾细胞癌等)的潜力。最近，应用癌症免疫疗法的研究已经显示出有希望的结果，特别是在转移癌方面(Weinstock和McDermott，2015，TherAdv Urol.，7(6)：365-77)。此外，癌症免疫治疗在包括霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓发育不良综合征，非霍奇金淋巴瘤等在内的血液癌症的治疗中显示出巨大的潜力(Zou和Chen L，2008，Nat Rev Immunol.，8(6)：467-77)。免疫检查点抑制剂引起的副作用是可以忽略的，可逆的和可控的，并且有效的免疫检查点抑制剂可以实质上改善癌症患者的总生存期。免疫检查点抑制剂可以与靶向治疗或传统放疗和化疗联合应用，并且此类联合治疗可以有效治疗许多类型的癌症。BMS、Merck、MedImmune和CureTech已经启动了抗PD-1单克隆抗体的临床试验，包括，例如市场阶段的三次试验；并且Roche、MedImmune、Merck Serono和BMS也已经启动了抗PD-L1mAb的临床试验，包括，例如已经撤销或终止的三次试验(clinicaltrials.gov，2015)。

BMS，Nivolumab的全人IgG4mAb已经进行了I期临床试验。这些试验中的第一次在2010年，在39名晚期实体瘤患者中进行(Brahmer等，2010，J.Clin.Oncol.,28:3167-75)。响应结果是3/39，伴有大多数的免疫相关不良反应(AE)和一例严重的AE。第二次试验在2012年，在294名患者中进行(Topalian等，2014，J.Clin.Oncol.,32:1020-30)。在16％的非小细胞肺癌患者，28％的转移性黑素瘤患者，29％的肾细胞癌患者和0％的去势难治性前列腺癌患者或结直肠癌患者中存在客观反应。在15％的患者中发生3/4级治疗相关的AE，并且有3例死亡。

因此，尽管有所进步，但是本领域需要更有效的治疗剂，其包含有效抑制PD-1/PD-L1信号传导活性，同时对人产生最小不利副作用的抗PD-1抗体。

发明概述

为满足此类需求，本发明提供了以高亲和力特异性结合PD-1并诱导免疫细胞分泌IFN-γ和IL-2的单克隆抗体，正如混合淋巴细胞反应和T淋巴细胞刺激试验中所测定的。具体而言，与纳武单抗(Nivolumab)相比，本发明的全人抗PD-1抗体对PD-1具有更高的亲和力。此外，所述抗体表现出与派姆单抗(Pembrolizumab)Merck)(一种人源化IgG4抗PD-1mAb)相当的特性，但由于其是全人的，而非简单的人源化mAb，因此预测其在人体中具有比派姆单抗(Pembrolizumab)更少的免疫原性的不利副作用。

在一个一般方面，本发明涉及结合PD-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。

根据一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：

分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；

分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；

分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；

分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；

分别为SEQ ID NOs:38、39、40、34、35、和36；

分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；或

分别为SEQ ID NOs:54、55、56、50、51、和52；

其中，所述抗体或其抗原结合片段结合PD-1，优选地特异性结合人PD-1。

根据另一具体方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。

根据一种实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人/鼠嵌合的。

根据另一种实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人的。

根据另一种实施方式，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包含一恒定区，优选一人重链IgG4恒定区，更优选具有一个或多个突变(例如S228P突变)的人重链IgG4恒定区，和一人抗体轻链κ恒定区。

在另一个一般方面，本发明涉及一种分离的编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。

在另一个一般方面，本发明涉及一种载体，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。

在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。

在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的盐。

在另一个一般方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合的方法，或一种增强IFN-γ和IL-2分泌的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。

在另一个一般方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的疾病，障碍或症状(优选感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病)的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。

在另一个一般方面，本发明涉及治疗有需要的受试者的过度增殖性疾病的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。所述过度增殖性疾病可以是非恶性疾病，包括但不限于动脉粥样硬化、良性增生、良性前列腺肥大。所述过度增殖性疾病也可以是肿瘤或恶性疾病。所述肿瘤可以选自下组：实体瘤、血液癌、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌、和甲状腺癌。

在另一个一般方面，本发明涉及一种制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。

在另一个一般方面，本发明涉及一种制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体结合以获得所述药物组合物。

根据以下公开内容，包括发明详述、及其优选实施方式以及所附权利要求，本发明的其它方面、特征和优点是显而易见的。

附图的简要说明

结合附图将更好地理解前述概述以及以下的发明详述。应理解，本发明不限于附图中所示的确切的实施方式。

在附图中：

图1显示了PD-1-hFc蛋白与生物素标记的PD-L1-hFc的结合活性；

图2显示了用PD-1蛋白稳定转染的HEK293细胞的流式细胞图谱；

图3显示了ELISA检测的PD-1蛋白免疫后的转基因小鼠的血清抗体滴度，其中1671-1675代表小鼠ID号；

图4A和图4B显示了ELISA检测的根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体与人PD-1-hFc蛋白的结合活性；

图5A和图5B显示了ELISA检测的根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体与食蟹猴PD-1-hFc蛋白的结合活性；

图6A和图6B显示了ELISA检测的根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体与其他免疫检查点蛋白的结合活性；

图7A-7C显示了流式细胞术检测的根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体与CHO-K1-hPD-1的基于细胞的结合活性；

图8A-8C显示了流式细胞术检测的根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体与CHO-K1-cPD-1的基于细胞的结合活性；

图9A-9C显示了基于蛋白的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L1的结合抑制；

图10A-10C显示了基于蛋白的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L2的结合抑制；

图11A和11B显示了基于细胞的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L1结合的抑制；

图12A和12B显示了基于细胞的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L2结合的抑制；

图13显示了在使用PBMC的T淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图14显示使用来自供体1的PBMC的混合淋巴细胞反应中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IL-2分泌的影响；

图15显示使用来自供体2的PBMC的混合淋巴细胞反应中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IL-2分泌的影响；

图16显示了在使用来自供体1的PBMC的混合淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图17显示了在使用来自供体2的PBMC的混合淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图18显示了在使用来自供体1的PBMC的混合淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图19显示了在使用来自供体2的PBMC的混合淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图20显示了在使用来自供体3的PBMC的混合淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图21显示了在使用来自供体4的PBMC的混合淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的嵌合抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图22A-22C显示了ELISA检测的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体与人PD-1-hFc蛋白的结合活性；

图23A-23C显示了ELISA检测的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体与食蟹猴PD-1-hFc蛋白的结合活性；

图24A和24B显示了流式细胞术检测的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体与CHO-K1-hPD-1的基于细胞的结合活性；

图25A和25B显示了流式细胞术检测的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体与CHO-K1-cPD-1的基于细胞的结合活性；

图26显示了流式细胞术检测的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体与激活的人PBMC的结合活性；

图27显示了流式细胞术检测的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体与激活的食蟹猴PBMC的结合活性；

图28A-28C显示了ELISA检测的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体与其他免疫检查点蛋白的结合活性；

图29A和29B显示了基于蛋白的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L1结合的抑制；

图30A和30B显示了基于蛋白的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L2结合的抑制；

图31A和31B显示了基于细胞的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L1结合的抑制；

图32A和32B显示了基于细胞的受体配体阻断试验所测定的，根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对PD-1蛋白与其配体PD-L2结合的抑制；

图33显示了在使用PBMC的T淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图34显示了在混合淋巴细胞反应中，根据本发明的实施方式的嵌合和全人抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图35显示了使用PBMC的T淋巴细胞刺激试验中，根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图36A和36B显示了在混合淋巴细胞反应中，根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对IFN-γ分泌的影响；

图37显示根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的影响；

图38显示根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体对补体依赖性细胞毒性的影响；

图39显示了通过差示扫描量热法(DSC)测定的根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体的热稳定性；

图40显示了根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体的冻/融稳定性；和

图41显示了根据本发明的实施方式的全人抗PD-1抗体的溶解度。

发明详述

在背景和整个说明书中，引用或描述了多种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一个都通过引用整体并入本文。本说明书中包含的文件、法案、材料、装置、文章等的讨论用于提供本发明的上下文的目的。对于本发明所公开或要求保护的任何内容，这样的讨论并不是承认任何或全部这些事项构成现有技术的一部分。

除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的具有相同含义。另外，本文所用的具体术语具有说明书中定义的含义。本文引用的所有专利，公开的专利申请和出版物通过引用并入本文，如同在此完全阐述一样。需要注意的是，除非上下文另有明确指示，如本文和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数形式。

除非另有说明，在所有情况下，本文所述的任何数值(例如本文所述的浓度或浓度范围)应当理解为均被术语“约”修饰。因此，某一数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，如本文所用，所用数值范围特别地包括所有可能的子范围，在该范围内的所有单个数值，包括在这样的范围内的整数以及该值的分数。

本发明通常涉及分离的抗PD-1抗体，编码所述抗体的核酸和表达载体，含有所述载体的重组细胞，以及包含所述抗体的组合物。还提供了制备所述抗体的方法，以及使用所述抗体治疗包括癌症和自身免疫疾病在内的疾病的方法。本发明的抗体具有一种或多种期望的功能特性，包括但不限于结合PD-1的高亲和力，对PD-1的高特异性，阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2结合的能力，以及刺激分泌细胞因子IFN-γ和IL-2的能力。

在一般的方面，本发明涉及结合PD-1的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。

如本文所用，术语“抗体”以广义使用，包括免疫球蛋白或抗体分子，其包括人、人源化、复合和嵌合抗体，以及单克隆或多克隆抗体片段。通常，抗体是对特定抗原表现出结合特异性的蛋白或肽链。抗体的结构是众所周知的。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五个主要类型(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和IgG被进一步细分为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以是五个主要类型或相应亚类中的任何一个。优选地，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。根据其恒定区的氨基酸序列，可以将脊椎动物物种的抗体轻链归类为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。因此，本发明的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构域。根据具体的实施方式，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域之外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，每个区含有三个结构域(即CDR1，CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域任选地称为LCDR1，LCDR2和LCRD3，重链可变区结构域任选地称为HCDR1，HCRD2和HCDR3。

如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-1的分离的抗体基本上不含不结合PD-1的抗体)。另外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能少量存在的天然的突变以外，包含种群的单个抗体是同一的。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单一淋巴细胞基因克隆技术，或通过重组DNA方法制备。例如，可以通过杂交瘤产生单克隆抗体，所述杂交瘤包含从非人转基因动物(例如转基因小鼠或大鼠)获得的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。

如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定性Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定性双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、包含一个或多个CDR的部分抗体形成的多特异性抗体、骆驼单域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体、或与抗原结合但不包含完整的抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与相同抗原(与亲本抗体或亲本抗体片段结合的相同抗原)结合。根据具体实施方式，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区、和重链恒定区的Fd区段。根据其他具体实施方式，抗原结合片段包含Fab和F(ab’)。

如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域的常规单链抗体，其包含由约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，其包含重链可变区和重链恒定区，或仅包含重链可变区。

如本文所用，术语“人抗体”是指通过人生产的抗体，或利用本领域已知的任何技术制备的氨基酸序列与通过人生产的抗体相一致的抗体。人抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指为增强其与人抗体的序列同源性而进行修饰的非人类抗体，以保留抗体的抗原结合特性，并降低其在人体中的抗原性。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两种或多种物种的抗体。通常，轻链和重链可变区都对应于衍生自一种哺乳动物(例如小鼠，大鼠，兔等)的具有期望的特异性、亲和力、和性能的抗体的可变区，而恒定区对应于衍生自另一种哺乳动物(例如人)的抗体的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。

如本文所用，术语“PD-1”是指程序性细胞死亡1蛋白，是在激活的T细胞、B细胞和骨髓系细胞上表达的50-55kDa的I型跨膜受体(Greenwald等，Annu.Rev.Immunol.23:515-48；Sharpe等,2007,Nat.Immunol.8:239-45).人PD-1的氨基酸序列记载于GenBank，登录号为NP_005009.2。已经鉴定出PD-1的两种配体，PD-L1和PD-L2。

如本文所用，“特异性结合PD-1”的抗体是指与PD-1，优选人PD-1结合的抗体，其KD值小于等于1×10^-7M，优选小于等于1×10^-8M，更优选小于等于5×10^-9M、小于等于1×10^-9M、小于等于5×10^-10M、小于等于1×10^-10M。术语“KD”指由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得的解离常数，并表示为摩尔浓度(M)。基于本发明，可以使用本领域的方法确定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振来确定，诸如通过使用生物传感器系统，例如系统，或通过使用生物膜层干涉量度分析技术，例如Octet RED96系统。

抗体的KD值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。

分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；

分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；

分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；

分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；

分别为SEQ ID NOs:38、39、40、34、35、和36；

分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；或

分别为SEQ ID NOs:54、55、56、50、51、和52；

根据另一具体方面，本发明涉及一种本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段分别地包含具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。

根据另一具体方面，本发明涉及本发明的一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

a.具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：29的多肽序列的轻链可变区；

b.具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：5的多肽序列的轻链可变区；

c.具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：13的多肽序列的轻链可变区；

d.具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：21的多肽序列的轻链可变区；

e.具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：37的多肽序列的轻链可变区；

f.具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：45的多肽序列的轻链可变区；或

g.具有SEQ ID NO：49的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：53的多肽序列的轻链可变区。

在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:6、7、8、2、3、和4的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ IDNO：1至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：5至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：5的多肽序列的轻链可变区。

在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:14、15、16、10、11、和12的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：9至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：13至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：13的多肽序列的轻链可变区。

在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:22、23、24、18、19、和20的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：17至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：21至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：21的多肽序列的轻链可变区。

在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:30、31、32、26、27、和28的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：25至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：29至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：29的多肽序列的轻链可变区。

在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:38、39、40、34、35、和36的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：33至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：37至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：37的多肽序列的轻链可变区。

在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:46、47、48、42、43、和44的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：41至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：45至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：45的多肽序列的轻链可变区。

在一种实施方式中，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别具有SEQ ID No:54、55、56、50、51、和52的多肽序列。在另一实施方式中，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO：49至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQ ID NO：53至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。优选地，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO：49的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID NO：53的多肽序列的轻链可变区。

根据另一具体方面，本发明涉及本发明的一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

根据另一具体方面，本发明涉及本发明的一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的。

根据另一具体方面，本发明涉及本发明的一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含一恒定区，优选人重链IgG4恒定区，更优选具有S228P突变的人重链IgG4恒定区(SEQ ID NO：75)，和人抗体轻链，优选人轻链κ恒定区(SEQ ID NO：77)。

在另一个一般方面，本发明涉及一种编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。本领域技术人员可以理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，改变蛋白质的编码序列(例如，替换、删除、插入等)。因此，本领域技术人员能够理解，可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下，改变编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸序列。

在另一个一般方面，本发明涉及一种载体，其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何载体，例如作为质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是重组表达载体，如质粒。所述载体可以包括用于构建常规功能的表达载体的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。本领域已知，许多表达载体能够将核酸递送至细胞，其可以在本发明中使用，用于在细胞中产生抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施方式，可以利用常规克隆技术或人工基因合成生产重组表达载体。

在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何宿主细胞，用于本发明的抗体或其抗原结合片段的重组表达。在一些实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)或CHO-K1细胞(用于表达例如全长IgG抗体)。根据具体的实施方式，通过常规方法例如化学转染，热休克或电穿孔将重组表达载体转化到宿主细胞中，其被稳定整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸得到有效表达。

在另一个一般方面，本发明涉及制备本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物(如从上清液中)中回收抗体或其抗原结合片段。可以从细胞中收获表达的抗体或其抗原结合片段，并根据本领域已知的和本文所述的常规技术进行纯化。

在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含分离的本发明单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含囊泡的脂质、微球体、脂质包封体、或本领域已知的用于药物制剂的其他物质。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特性取决于具体应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰本发明所述组合物的有效性或本发明所述组合物的生物活性的无毒物质。根据具体实施方式，鉴于本公开内容，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。

在另一个一般方面，本发明涉及在有需要的受试者中阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合，或增强IFN-γ和IL-2分泌的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。

与PD-1结合的抗体及其抗原结合片段的功能活性可以通过本领域已知的和本文所述的方法进行表征。表征与PD-1结合的抗体及其抗原结合片段的方法包括但不限于，亲和力和特异性试验，包括Biacore、ELISA和FACS分析；受体配体结合试验，以检测PD-1与PD-L1和PD-L2结合的阻断；通过阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合，对诱导淋巴细胞细胞因子产生进行检测的试验；细胞毒性试验，以检测抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的存在与否；检测小鼠肿瘤模型中肿瘤生长的抑制的实验等。根据具体的实施方式，表征与PD-1结合的抗体及其抗原结合片段的方法包括以下实施例2-12中所述的方法。

在另一个一般方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗感染性疾病或移植物抗宿主病的方法，其包括向受试者施用本发明的药物组合物。在另一个一般方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用本发明的药物组合物。

如本文所用，术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物。根据具体的实施方式，受试者是哺乳动物，包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类动物(例如猴子、黑猩猩或人)。在具体的实施方式中，所述受试者是人。

根据本发明的实施方式，所述药物组合物包含治疗有效量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起期望的生物或药物反应的活性成分或组分的量。根据所述目的，可以以经验和常规方式确定治疗有效量。

如本文所用，抗PD-1抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指在有需要的受试者中刺激免疫应答的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的量。同样地，如本文所用，抗PD-1抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指治疗疾病、障碍或病症；预防或减缓疾病、障碍或病症发展；或减轻或完全减轻与免疫疾病、障碍或病症有关的症状的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的量。

根据具体的实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是过度增殖性疾病、感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。根据更具体的实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。根据更具体的实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是非恶性过度增殖性疾病，包括但不限于动脉粥样硬化、良性增生、良性前列腺肥大。根据其他具体实施方式，待治疗的疾病、障碍或病症是肿瘤或恶性过度增殖性疾病，优选地，肿瘤选自下组：实体瘤、血液癌、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌、和甲状腺癌。

根据具体的实施方式，治疗有效量是指足以实现1、2、3、4或更多种以下效果的治疗量：(i)减轻或改善待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的严重程度、(ii)减少待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间、(iii)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展、(iv)使待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状退化、(v)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的发展或发作、(vi)预防待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的复发、(vii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗、(viii)减少患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间、(ix)增加患有待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的存活率、(xi)抑制或减轻受试者中待治疗的疾病、障碍或病症或与之相关的症状、和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，例如待治疗的疾病、障碍或病症、给药方式、靶位点、受试者的生理状态(包括，例如年龄、体重、健康状况)、受试者是人还是动物、施用的其他药物、以及该处理是预防还是治疗。优化滴定的治疗剂量，以优化安全性和有效性。

根据具体的实施方式，配制本文所述的组合物，以使其适合向受试者施用的预期途径。例如，本文所述的组合物可以配制成适合于静脉内、皮下或肌肉内施用的形式。

如本文所用，术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”均指改善或逆转至少一种与下述疾病相关的可测的生理参数，所述疾病包括：癌症，炎症性疾病、障碍或病症，免疫性疾病、障碍或病症，自身免疫性疾病、障碍或病症，或感染性疾病、障碍或病症，其在受试者中未必一定可辨别，但可以在受试者中辨别。术语“治疗”、“治疗的”和“疗法”还可指使得疾病、障碍或病症消退、阻碍其进展、或至少减缓其进展。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指减轻，预防与疾病、障碍或病症(例如肿瘤，更优选地为癌症)相关的一种或多种症状的发展或发作，或减少其持续时间。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指增加患有疾病、障碍或病症的受试者的存活率。在具体的实施方式中，“治疗”、“治疗的”和“疗法”是指治愈受试者的疾病、障碍或病症。

根据具体的实施方式，用于治疗癌症，炎症性疾病、障碍或病症，免疫性疾病、障碍或病症，自身免疫性疾病、障碍或病症，或感染性疾病、障碍或病症的组合物，可以与其他治疗联合施用，包括但不限于化疗、抗CD20mAb、抗CTLA-4抗体、抗血管生成剂、放射疗法、其他免疫肿瘤药物、靶向疗法、抗PD-L1抗体或其他抗癌药物。

如本文所用，上下文中向受试者施用两种或更多种疗法的术语“联合”是指使用多于一种的疗法。使用的术语“联合”不限制向受试者施用的治疗的顺序。例如，向受试者施用第一种疗法(例如，本文所述的组合物)可以在施用第二种疗法之前(例如，提前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)，伴随，或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)。

在另一个一般方面，本发明涉及制备包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。

实施方式

本发明还提供以下非限制性实施方式。

实施方式1是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：

分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；

分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；

分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；

分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；

分别为SEQ ID NOs:38、39、40、34、35、和36；

分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；或

分别为SEQ ID NOs:54、55、56、50、51、和52；

其中，所述的抗体或其抗原结合片段结合PD-1。

实施方式2是实施方式1的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含具有与SEQID NO：25、1、9、17、33、41或49至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ IDNO：29、5、13、21、37、45或53至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。

实施方式3是实施方式2的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含分别具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，和具有与SEQID NO：29、5、13、21、37、45或53至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。

实施方式4是实施方式3的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

具有SEQ ID NO：25的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：29的多肽序列的轻链可变区；

具有SEQ ID NO：1的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：5的多肽序列的轻链可变区；

具有SEQ ID NO：9的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：13的多肽序列的轻链可变区；

具有SEQ ID NO：17的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：21的多肽序列的轻链可变区；

具有SEQ ID NO：33的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：37的多肽序列的轻链可变区；

具有SEQ ID NO：41的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：45的多肽序列的轻链可变区；或

具有SEQ ID NO：49的多肽序列的重链可变区，和具有SEQ ID No：53的多肽序列的轻链可变区。

实施方式5是实施方式1至4中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

实施方式6是实施方式1至5中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的。

实施方式7是实施方式6的分离的抗体或抗原结合片段，其包含具有S228P突变的人重链IgG4恒定区和人抗体轻链κ恒定区。

实施方式8是实施方式1至7中任一项的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段结合K_D值小于等于5×10^-9M，优选K_D值小于等于1×10^-9M的人PD-1，其中，K_D通过表面等离子体共振分析(如使用Biacore系统)或通过生物层干涉测量技术(如使用Octet RED96系统)进行测量。

实施方式9是分离的编码实施方式1至8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段的核酸。

实施方式10是包含实施方式9的分离的核酸的载体。

实施方式11是包含实施方式10的核酸的宿主细胞。

实施方式12是一种药物组合物，其包含实施方式1至8中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。

实施方式13是一种在有需要的受试者中阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合、或增加IFN-γ和IL-2的分泌的方法，其包括向所述受试者施用实施方式12的药物组合物。。

实施方式14是一种在有需要的受试者中治疗感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的方法，其包括向所述受试者施用实施方式12的药物组合物。

实施方式15是实施方式14的方法，所述方法还包括向受试者施用额外的制剂，用于治疗有需要的受试者的传染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。

实施方式16是治疗有需要的受试者的过度增殖性疾病的方法，包括向受试者施用实施方式12的药物组合物，

实施方式17是实施方式16的方法，其中，所述的过度增殖性疾病是非恶性疾病，优选自下组：动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大。

实施方式18是实施方式16的方法，其中，所述的过度增殖性疾病是肿瘤或恶性疾病，优选地，所述肿瘤选自下组：实体瘤、血液癌、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌、和甲状腺癌。

实施方式19是实施方式16-18中任一项的方法，所述方法还包括向受试者施用额外的制剂，用于治疗有需要的受试者的过度增殖性疾病。

实施方式20是一种制备实施方式1至8中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物中回收抗体或抗原结合片段。

实施方式21是一种制备包含实施方式1至8中任一项的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体组合，以获得所述药物组合物。

实施方式22是实施方式1至8中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，用于治疗有需要的受试者的感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。

实施方式23是实施方式1至8中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，用于治疗过度增殖性疾病，如非恶性疾病(选自下组：动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大)、或肿瘤(选自下组：实体瘤、血液癌、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌、和甲状腺癌)。

实施方式24是实施方式1至8中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段在制备药物组合中的应用，所述药物组合物用于治疗有需要的受试者的感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病。

实施方式25是实施方式1至8中任一项的分离的单克隆抗体或抗原结合片段在制备药物组合中的应用，所述药物组合物用于治疗过度增殖性疾病，如非恶性疾病(选自下组：动脉粥样硬化、良性增生和良性前列腺肥大)、或肿瘤(选自下组：实体瘤、血液癌、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌、和甲状腺癌)。

实施例

本发明的以下实施例是为了进一步说明本发明。应该理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附的权利要求确定。

实施例1-抗PD-1抗体的制备

使用人PD-1蛋白作为免疫原制备抗PD-1抗体。利用人类免疫球蛋白转基因小鼠技术进行全人抗体的开发和制备，首次记载于Abgenix(Xeno小鼠和Medarex(HuMab“小鼠”)；Lonberg等,1994,自然368:856-859；Lonberg和Huszar,1995,Internal Rev.Immunol.13:65-93；Harding和Lonberg,1995,Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。

通过进行抗体生产，纯化和验证试验，获得对PD-1有高亲和力(K_D<1*10^-9)的抗体。该抗体对PD-1有特异性且不与其他免疫检查点蛋白，如B7.1，CD28，CTLA-4和ICOS交叉反应，能够阻断PD-1与PD-L1和PD-L2的结合。使用常规分子生物学方法测定产生的抗PD-1抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列，并将其概括在表1中。

表1本发明的嵌合抗PD-1抗体的重链可变区，HCDR，轻链可变区和LCDR的氨基酸序列SEQ ID NO编号

表1列出的抗PD-1抗体的重链和轻链可变区由总结于表2的核酸序列所编码。

表2本发明的嵌合抗PD-1抗体的重链和轻链可变区的核酸序列SEQ ID NO编号

制备了全人源的抗PD-1抗体。该全人抗PD-1抗体以高亲和力(K_D<1*10^-9M)结合于人PD-1的胞外结构域，并阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合。抗PD-1抗体没有表现出与人B7.1、CD28、CTLA-4、ICOS或其他类似蛋白抗原的非特异性结合。通过混合淋巴细胞和T细胞刺激试验来评估抗PD-1抗体的生物学活性，在试验中，它们增加了IFN-γ和IL-2细胞因子的分泌。尽管不希望被理论所束缚，但相信抗PD-1抗体可用于抑制PD-1介导的负调控免疫应答的信号传导途径，并因此增强肿瘤特异性免疫应答，或者用作单一疗法，或者作为癌症免疫疗法与抗PD-L1单克隆抗体或其他抗癌药物联合，特别是用于患有PD-L1阳性肿瘤的患者。抗PD-1抗体可用于治疗癌症和自身免疫性疾病。

实施例2-抗PD-1抗体的制备

(步骤1)免疫原A，PD-1^ECD-hFc蛋白(本文中也称为PD-1-hFc)的制备

利用常规分子生物学克隆技术(Sambrook和Russell，1989，分子克隆实验手册，纽约：冷泉港实验室出版社，第二版)，将对应于SEQ ID No.72的Leu25-Glu167位氨基酸的人PD-1胞外结构域的编码序列(PD-1^ECD；SEQ ID NO:71)，与人IgG Fc片段(hFc)的编码序列一起，克隆至pCpC载体(Invitrogen，#V044-50)。利用聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences)和质粒，对HEK293细胞(Invitrogen)进行瞬时转染，并在37℃在FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中进行扩增。扩增4天后，收集培养基并离心以去除细胞组分。将含有重组PD-1^ECD-hFc的培养上清液进行蛋白A层析(Mabselect，GE医疗保健)。用UV检测器监测紫外(UV)吸收(A280nm)，用PBS(pH7.2)洗涤样品，直到UV A280nm的吸收光谱回到基线水平，此时用0.1M甘氨酸盐酸盐(pH2.5)将PD-1^ECD-hFc融合蛋白从蛋白A亲和柱中洗脱出来。在4℃下,将样品用PBS磷酸盐缓冲液(pH7.2)透析过夜。透析后，用0.22微米的无菌过滤器过滤纯化的PD-1免疫原，分装并储存在-80℃。

以上述制备PD-1^ECD-hFc重组蛋白的相同方式，制备与hFc融合的重组人PD-L1胞外结构域(PD-L1^ECD)(对应于Uniprot数据库的蛋白Q9NZQ7.1的Phe19-Thr239位氨基酸)。通过将蛋白与生物素(Sigma S3295)混合并孵育，将纯化的PD-L1^ECD-hFc(在本文中也称为PD-L1-hFc)生物素化。

为了表征PD-1^ECD-hFc免疫原，测定样品的蛋白质浓度和纯度，并测定免疫原的分子量和生物活性。

通过配体结合试验测定PD-1^ECD-hFc免疫原的生物学活性。用PBS将重组PD-1^ECD-hFc蛋白稀释至1μg/mL的浓度，并将100μL稀释的PD-1^ECD-hFc蛋白样品添加至微量滴定板的每个孔，在4℃下过夜孵育，以便用重组蛋白包被该板。随后，用封闭溶液(含有1％BSA，pH7.4的PBS缓冲液，w/v)在37℃封闭该板2小时，然后用连续稀释的生物素化的PD-L1^ECD-hFc蛋白或对照蛋白(生物素化的非PD-L1^ECD-hFc)在37℃孵育1小时。添加链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶(HRP)(Sigma B2438)，并将板在室温下孵育30分钟。加入100μL四甲基联苯胺(TMB)，并将板在室温下孵育15分钟。加入50uL的1N HCl终止反应，用微孔板读数仪测定OD450nm。图1和表3显示了浓度依赖的生物素化的PD-L1^ECD-hFc蛋白质或对照蛋白与纯化的PD-1^ECD-hFc融合蛋白的结合。观察到生物素化的PD-L1^ECD-hFc与PD-1^ECD-hFc的结合，但不包含PD-L1^ECD序列的对照蛋白未观察到结合。

表3PD-1^ECD-hFc与生物素化的PD-L1^ECD-hFc的结合活性

(步骤2)免疫原B，过表达hPD-1的HEK293细胞的制备

将编码人PD-1的核苷酸序列(SEQ ID NO：73)亚克隆到pIRES载体(Clontech)中，并制备该质粒。利用PEI和该质粒对HEK293和CHO-K1细胞(Invitrogen)进行瞬时转染，在含有0.5μg/mL抗生素和10％(w/w)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养2周并挑选转化子。有限稀释至一96孔培养板，将该板在37℃，5％(v/v)CO₂下孵育约2周。挑选后，将单克隆在6孔板中进行扩增，使用市售的抗PD-1抗体(R&D Systems)，通过流式细胞术筛选扩增的克隆。通过FACS测定，将表现出更高生长速率和更高荧光强度的克隆进一步扩增，并在液氮中冷冻保存。

图2显示了稳定转染重组hPD-1蛋白的HEK293细胞的流式细胞术图谱。表4显示了作为hPD-1蛋白表达水平的指标的FACS阳性细胞的百分比。

表4FACS测定的重组HEK293克隆的hPD-1表达水平

(步骤3)免疫原C，hPD-1表达构建载体的制备

将人PD-1全长蛋白(SEQ ID No.73)的编码序列亚克隆到pcDNA3.1载体(Invitrogen)中，将所得质粒包被至1.0um胶体金子弹(Bio-RAD)，随后根据Helios基因枪说明书，利用Helios基因枪(Bio-rad No.165-2431)进行免疫。

(步骤4)杂交瘤细胞融合和抗体筛选

由于人Ig Fc与小鼠宿主Fc受体不匹配，因此含有hFc的免疫原在小鼠中引发的免疫反应很弱，导致单克隆抗体制备的效率很低。通过在小鼠基因组引入编码人免疫球蛋白(Ig)可变区的基因和编码大鼠Ig恒定区的基因，从而制备Harbour H2L2转基因小鼠，使得小鼠含有包含hV-rC的嵌合Ig，同时小鼠Ig的表达被灭活(WO2010/070263A1)。HarbourH2L2转基因小鼠能够产生与野生型小鼠(例如Balb/c)相当的免疫应答和抗体效价。

(4A部分)用免疫原A免疫6-8周龄的Harbour H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，并将小鼠在无特定病原体(SPF)的条件下饲养。初次免疫时，将50ug的免疫原A与0.25mL完全弗氏佐剂(CFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中。为增强免疫应答，在初次免疫两周后，将50ug的免疫原A与0.25mL不完全弗氏佐剂(IFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中，随后间隔3周给予加强免疫。免疫后一周收集血液样品。通过ELISA和FACS分析检测血清中的抗体效价和特异性，结果如图3和表5所示。表5说明PD-1^ECD-hFc免疫小鼠的血清表现出结合免疫原A的不同的水平。最高的血清稀释度约为一百万。空白对照是1％(w/w)BSA。表5所示OD450nm值是ELISA测定的第三次加强免疫后7天的血清效价值。

表5.ELISA测定的hPD-1^ECD-hFc融合蛋白免疫的Harbour H2L2转基因小鼠的血清效价

(4B部分)用免疫原B免疫6-8周龄的Harbour H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，将小鼠在SPF条件下饲养。使用X-treme基因HP DNA转染试剂(Roche，#06 366 236 001)，用编码全长hPD-1的pIRES质粒稳定转染HEK293细胞(参见实施例2，步骤2)。T-75培养瓶中培养细胞。当细胞达到90％汇合时，吸出培养基，用DMEM培养基(Invitrogen)洗涤细胞两次，并在37℃用无酶细胞解离液(Invitrogen)处理，直到细胞从培养瓶上分离。收集细胞并用DMEM培养基洗涤两次，进行细胞计数并用PBS缓冲液(pH7.2)调整至2×10⁷个细胞/mL。小鼠每次免疫注射0.5mL细胞悬液。首次免疫后两周，给予加强免疫，随后间隔3周给予加强免疫。免疫后一周收集血液样品。流式细胞仪检测血清抗体效价和特异性。第二次加强免疫后，血清效价用流式细胞术检测超过1：1000，用ELISA检测超过1：10,000。

(4C部分)用免疫原C免疫6-8周龄的Harbour H2L2转基因小鼠(北京维通利华)，并将小鼠在SPF条件下饲养。所有小鼠用Helios基因枪免疫4次，每次免疫4枪。每枪含有1ugcDNA。首次免疫后两周，给予加强免疫，随后间隔3周给予加强免疫。免疫一周后收集血液样品，用ELISA和FACS检测血清效价。第二次加强免疫后的血清效价用流式细胞术检测为1：1000，用ELISA检测超过1：10,000。

上述步骤4A-C完成之前，选择具有针对hPD-1的特异性免疫应答的小鼠进行融合，并通过腹膜内注射100μg纯化的PD-1^ECD-hFc(针对免疫原A或免疫原C免疫的小鼠)或稳定转染hPD-1的HKE293细胞(针对免疫原B免疫的小鼠)，给予最后一次加强免疫。5天后，处死小鼠，收集其脾细胞。将NH₄OH加入到脾细胞样品中至终浓度为1％(w/w)，以裂解样品中的红细胞。1000rpm离心样品，并用DMEM培养基洗涤三次。检测脾细胞的活力，随后采用高效电融合方法(参见酶学方法，Vol.220)，将存活的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC)以5：1的比例进行融合。

将融合细胞重悬于含有20％FBS和1x次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基(w/w)的DMEM培养基中，并将浓度调节至10⁵个细胞/200μL。将200uL的融合细胞加入到96孔板的每个孔中，在37℃，5％CO₂下孵育。细胞融合14天后，收集杂交瘤上清液并用ELISA和Acumen(微孔板细胞试验)进行筛选。在37℃，5％(v/v)CO₂条件下,在含有DMEM，10％(w/w)热失活的FBS的24孔板中，对ELISA中OD450nm大于1.0和Acumen中MFI值大于100的克隆进行扩增。培养3天后收集上清液。检测抗体的亚型，并用ELISA和流式细胞术(参见实施例3)检测其对重组PD-1^ECD蛋白和PD-1阳性细胞的结合活性。进行受体配体结合试验，以确定杂交瘤上清液的封闭活性(参见实施例4-5)。

基于24孔板的筛选结果，挑选ELISA结合试验中OD450nm值大于1.0、FACS结合试验中MFI值大于50和受体配体结合试验中抑制率大于60％的克隆，并且进行亚克隆。在37℃和5％(v/v)CO₂条件下，用含有10％(v/v)FBS的DMEM培养基在96孔板中通过有限稀释进行亚克隆。培养10天后，收集上清液并采用ELISA和Acumen进行初步筛选。阳性克隆在24孔板中扩增并培养3天。收集上清液。进行ELISA和FACS结合试验以检测结合活性，并进行受体配体结合试验以评估生物活性。挑选标准如下：ELISA中OD450nm>1.0，FACS中MFI值>50，受体配体结合试验中抑制率>60％。将符合选择标准的克隆在含有10％(w/w)FBS的DMEM培养基中37℃，5％(v/v)CO₂条件下进行扩增，并在液氮中冷冻，以便杂交瘤细胞可用于随后的抗体产生和纯化。

(步骤5)先导候选抗体的生产和纯化

来自杂交瘤细胞的抗体浓度低，约为1-10ug/mL，并且抗体浓度变化很大。另外，FBS和培养基的组分可能会干扰分析。因此，有必要进行小规模的抗体生产和纯化(1-5毫克)。

在T-75培养瓶中，用杂交瘤无血清培养基(Invitrogen)培养实施例2中的杂交瘤细胞(第4部分)，并传代3代。当杂交瘤细胞处于良好状态时，将细胞转移到2L培养瓶中。向每个培养瓶中加入500mL生产培养基，并将细胞密度调节至10⁵个细胞/mL。将培养瓶置于37℃旋转培养箱中，转速3转/分钟。将杂交瘤细胞培养14天，之后收集上清液并除去细胞。随后，用0.45微米的过滤器过滤上清液。随后，培养上清液可用于纯化或储存于-30℃。

将杂交瘤培养上清液流过2mL蛋白G柱(GE医疗保健)来纯化单克隆抗体。首先用PBS缓冲液(pH7.2)平衡蛋白G柱，然后将杂交瘤培养上清液以3mL/分钟的恒定流速上样至平衡的蛋白G柱。然后用4倍体积的PBS缓冲液洗涤柱子。然后用洗脱缓冲液(0.1M乙酸盐缓冲液，pH2.5)洗脱抗PD-1抗体，用UV检测器监测洗脱液的UV吸光度(A280紫外吸收峰)。向洗脱液中加入10％的1.0M Tris-HCL缓冲液以中和pH，将样品通过0.22微米过滤器进行无菌过滤。获得无菌过滤的纯化的抗PD-1抗体。

采用UV吸光度(A280/1.4)检测纯化的抗PD-1抗体的浓度，并检测纯度和内毒素水平(Lonza试剂盒)。分析结果如表6所示。纯化的抗PD-1抗体的内毒素浓度小于1.0EU/mg。

表6来自杂交瘤的纯化嵌合PD-1mAb的质量控制分析

实施例3-先导候选抗体的表征

(A部分)ELISA检测抗PD-1抗体与重组PD-1^ECD-hFc蛋白的结合

ELISA分析实施例2所得纯化的抗PD-1抗体与重组人PD-1^ECD-hFc蛋白、食蟹猴PD-1^ECD-hFc蛋白和其他PD-1家族相关免疫检查点蛋白的结合，以确定抗体的特异性。

将实施例2所得纯化的免疫原A(hPD-1^ECD-hFc蛋白)、食蟹猴PD-1^ECD-hFc蛋白(用制备免疫原A的方法制备(参见实施例2，步骤1)，包含食蟹猴PD-1胞外结构域的氨基酸序列，其对应于Uniprot数据库B0LAJ3蛋白的Leu25-Gln167位氨基酸)和其他免疫检查点蛋白(CD28、B7-1、ICOS、CTLA4和NC-Fc)(R&D Systems)在PBS中稀释至1ug/mL。将100uL稀释的重组蛋白加入到96孔板的每个孔中。用塑料膜密封该板，4℃孵育过夜。用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)Tween20)洗板两次，并用封闭缓冲液(PBS+0.01％(v/v)Tween20+1％(w/w)BSA)室温孵育2小时。吸去封闭缓冲液，每孔加入100uL纯化的抗PD-1抗体，37℃孵育2小时。用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)Tween20)洗板三次。每孔加入HRP标记的二抗(Sigma)，37℃孵育2小时。用洗涤缓冲液洗板三次后，将100uL TMB底物加入到各孔中，室温孵育30分钟。每孔加入100uL终止液(0.1N HCl)，终止反应。用ELISA读板器(384plus SpectraMax，Molecular Devices)测量450nm处的吸光值。结果如图4-6和表7-9所示。IgG对照为人IgG。

表7ELISA检测嵌合抗PD-1mAb与人PD-1^ECD-hFc的结合活性

表8ELISA检测嵌合抗PD-1mAb与食蟹猴PD-1^ECD-hFc的结合活性

表9ELISA检测嵌合抗PD-1mAb与其他免疫检查点蛋白的结合活性

(B部分)流式细胞术检测抗PD-1抗体与PD-1表达细胞的结合

用含编码人PD-1全长的核酸序列的pIRES质粒(参见实施例2步骤2)稳定转染CHO-K1细胞，以产生稳定表达人PD-1的CHO-K1细胞(本文称为CHO-K1-hPD-1细胞)。用含编码食蟹猴PD-1全长的核酸序列的pIRES质粒稳定转染另一CHO-K1，以产生稳定表达食蟹猴PD-1的CHO-K1细胞(本文称为CHO-K1-cPD-1细胞)。培养CHO-K1-hPD-1和CHO-K1-cPD-1细胞，T-75培养瓶中扩增至90％汇合度(confluence)。吸出培养基，用HBSS(Hanks平衡盐溶液，Invitrogen)洗涤细胞两次。用无酶细胞解离液(Versene溶液，Invitrogen)处理细胞并收集。然后用HBSS洗涤细胞两次，进行细胞计数，并用HBSS重悬细胞至2×10⁶个细胞/mL。细胞悬浮液中加入山羊血清至最终浓度为1％，将细胞在冰上封闭30分钟，然后用HBSS洗涤两次。离心后收集细胞，用FACS缓冲液(HBSS+1％BSA，v/v)重悬至2x10⁶个细胞/mL。然后将100uL细胞悬液加入到96孔板的每个孔中。将100uL实施例2所得纯化的抗PD-1抗体加入到96孔板的每个孔中，在冰上孵育2小时。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并将100uL Alexa 488标记的二抗(Invitrogen)加入到96孔板中，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤样品三次，每孔加入100uL固定缓冲液(4％多聚甲醛v/v)，温育10分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬于100μL FACS缓冲液中。用FACS Calibur(BD)检测平均荧光强度(MFI)，结果如图7-8和表10-11所示。IgG对照为人IgG，表中的值为细胞群的平均荧光强度。

表10FACS检测嵌合抗PD-1mAb与CHO-K1-hPD-1的结合活性

表11FACS检测嵌合抗PD-1mAb与CHO-K1-cPD-1的结合活性

(C部分)抗PD-1抗体的结合亲和力和解离常数

解离常数通过Octed red 96(Fortiebio)测定。详细的操作和方法按照制造商提供的仪器说明书进行。简言之，使用链亲和素传感器(SA传感器，Fortiebio)进行亲和力测定。将生物素化的PD-1^ECD-hFc(免疫原A)在含有0.1％(w/w)BSA和0.02％(v/v)Tween20的PBS缓冲液(pH7.4)中稀释至10ug/mL，并用链霉素亲和素传感器温育。将五种不同浓度的抗PD-1抗体与装载免疫原A的链霉素亲和素传感器30℃温育3分钟。进一步将反应混合物在含有0.1％(v/w)BSA和0.02％(v/v)Tween20的PBS缓冲液(pH7.4)中30℃温育5分钟。用OctetRed 96实时记录抗PD-1抗体与免疫原A的结合和解离信号。用Octet User软件确定亲和力、结合常数和解离常数，结果如表12所示。

表12Octet Red 96检测的抗PD-1嵌合mAb与人PD-1^ECD-hFc蛋白的结合动力学和亲和力

克隆ID	K_D(nM)	k_a(1/Ms)	k_d(1/s)
				9B2C6C9	0.269	9.01x10⁴	2.43x10^-5
76G5B3	0.032	4.08x10⁵	1.30x10^-5
				32B5C7	0.045	2.12x10⁵	9.64x10^-6

实施例4-测定抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2结合的能力

进行基于蛋白和细胞的受体配体结合试验，以检测抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2结合的能力。

如实施例2制备生物素化的重组PD-1^ECD-hFc所述，制备生物素化的重组PD-L1^ECD和PD-L2^ECD蛋白。PD-L1的胞外结构域对应于Uniprot数据库Q9NZQ7.1蛋白的Phe19-THr239位氨基酸，PD-L2的胞外结构域对应于Uniprot数据库Q9BQ51蛋白的Leu20-Pro219位氨基酸。

用PBS稀释纯化的PD-1^ECD-hFc(实施例2)至终浓度为1.0ug/mL，将100uL稀释的PD-1^ECD-hFc加入到96孔板的每个孔中，然后用塑料膜封闭，4℃过夜孵育。用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)Tween20)洗板两次，并用封闭缓冲液(PBS+0.01％(v/v)BSA+1％Tween20(w/w)室温孵育2小时。吸出封闭缓冲液，将50uL实施例2所得纯化的抗PD-1抗体加入到96孔板的每个孔中。每孔加入100uL生物素化的重组PD-L1^ECD或PD-L2^ECD蛋白，混合，37℃孵育2小时。用洗涤缓冲液(PBS+0.01％(v/v)Tween20)洗板三次。然后，每孔加入100uLHRP标记的链霉亲和素(Sigma)，37℃孵育2小时。然后用洗涤缓冲液洗板三次，并将100uL TMB底物加入到各孔中。室温孵育30分钟后，加入100uL终止液(0.1N HCl)终止反应。用ELISA读板器(384plus SpectraMax，Molecular Devices)检测OD450nm处的吸光值。图9-10所示结果表明，抗PD-1抗体可以阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合。

在T-75培养瓶中，将CHO-K1-hPD-1细胞培养并扩增至60-80％汇合度。吸出培养基，并用PBS洗涤细胞两次。用TrypLE TM Express(Invitrogen)处理细胞并收集。加入8mL培养基中和胰蛋白酶，进行细胞计数。将细胞300g离心5分钟，并以1x10⁶个细胞/mL重悬于封闭缓冲液中。细胞在37℃封闭15分钟。同时，将96孔圆底板的孔用200uL封闭缓冲液在37℃封闭1小时。弃去封闭缓冲液，并将200uL细胞分配到96孔板的每个孔(2×10⁵个细胞/孔)中。将板在500g下离心5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于100uL预先制备于封闭缓冲液的抗体中。将100uL生物素化的PD-L1-Fc或生物素化的PD-L2-Fc(封闭缓冲液中，60ug/mL)加入到96孔板的每个孔中，轻轻振荡混合。将板在4℃孵育90分钟，并用200uL封闭缓冲液洗涤两次。弃去封闭缓冲液，将细胞重悬于100uL链霉亲和素-Alexa 488溶液(封闭缓冲液中，1：500，Invitrogen)中，4℃孵育1小时。用封闭缓冲液洗板三次，并重悬于200uL封闭缓冲液中。用FACS Calibur(BD)检测平均荧光强度(MFI)。图11-12所示结果表明，抗PD-1抗体可以阻断细胞表达的PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合。

实施例5-淋巴细胞刺激试验检测抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2结合的能力

(A)进行T细胞刺激试验，检测抗-PD-1抗体通过阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合而产生的对T细胞刺激的影响。

(步骤1)通过Ficoll梯度从全血分离外周血单核细胞(PBMC)。

将全血用PBS以1：1(v/v)的比例稀释，用无菌吸管轻轻地加到Ficoll溶液(GEHealthcare)的上面。Ficoll与稀释全血的体积比为3：4。将样品在20℃，400g下离心30分钟。离心后形成三层溶液，上层为血浆，中间乳白色层为单核细胞。使用无菌吸管从中间层收集单核细胞并将其转移到新的离心管中。加入三倍样本体积的PBS，并将样本在室温下100g离心10分钟。弃去上清液，用10mL PBS缓冲液重悬淋巴细胞。用PBS洗涤淋巴细胞三次以除去血小板。然后用10mL含有10％FBS的RPMI1640培养基(Invitrogen)重悬淋巴细胞悬液。

(步骤2)PBMC刺激实验

将PD-L1核苷酸序列亚克隆到pIRES质粒(pIRES-puro-PD-L1)，以产生编码PD-L1全长蛋白的构建体。为了将抗CD3抗体(OKT3)(参见Kipriyanov等，1997，Peds.10：445-453)锚定到细胞表面，将OKT3scFv融合到小鼠CD8a(NCBI登录号No：NP-1074579.1，113-220位氨基酸)的C端，并亚克隆到pIRES-OS8中(参见Sambrook和Russell，Id.)。按照实施例2中的制备方法，将pIRES-puro-PD-L1和pIRES-OS8共转染到CHO-K1和293F细胞中，以产生稳定的CHO-K1-PD-L1/OS8和293F-PD-L1/OS8细胞系。该细胞用于刺激T淋巴细胞。在实验前，用10ug/mL丝裂霉素在37℃处理CHO-K1-PD-L1/OS8和293F-PD-L1/OS8细胞3小时。

向96孔板的孔中加入100μL PBMC(含有5×10⁴个细胞)，然后将测试抗体溶液加入到96孔板中，室温孵育15分钟。每孔加入50uL 5×10³CHO-K1-PD-L1/OS8或293F-PD-L1/OS8，37℃，5％CO₂下培养72小时。收集上清液，并在分析前收集并储存于-20℃。

(步骤3)ELISA检测干扰素γ(IFN-γ)或白细胞介素IL-2的分泌

分别使用人IFN-γQuantikine ELISA试剂盒(R&D Systems SIF50)和人IL-2Quantikine ELISA试剂盒D2050(R&D Systems S2050)，根据制造商提供的操作说明书和试剂盒试剂，对培养上清液中IFN-γ或IL-水平进行定量。简言之，将IFN-γ和IL-2多克隆抗体包被到ELISA微量培养板上，每孔加入400uL培养上清液和标准品，室温孵育2小时。洗涤缓冲液洗板4次，然后加入HRP标记的抗人IFN-γ和IL-2抗体，室温孵育2小时。洗涤后，加入生色底物，室温避光孵育30分钟，加入终止液终止反应。使用ELISA读板器测定450nm处的吸光度，图13和表13所示结果表明，PBMC淋巴细胞刺激实验分析的抗PD-1抗体可使IFN-γ分泌增强。IgG对照为人IgG，表中列出的值是培养上清液中的IFN-γ浓度(pg/mL)。

表13嵌合抗-PD-1mAb诱导激活的PBMC释放IFN-γ

(B)进行混合淋巴细胞反应，检测抗PD-1抗体通过阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合而产生的对T细胞刺激的影响。

(步骤1)从人CD14+细胞中分离和培养树突状细胞

根据制造商提供的说明书，用FicollPaque Plus(GE医疗保健)从全血中分离PBMC。该方案与实施例5A步骤1所述相同。

将PBMC重悬于含有10％FBS的RPMI 1640完全培养基中，将细胞浓度调节至1×10⁵个细胞/mL。将细胞在37℃，5％(v/v)CO₂的T-75培养瓶中培养2小时。将培养上清液和未附着细胞转移到新的T-75培养瓶中，原始T-75培养瓶中补充加入新的RPMI 1640完全培养基(补充有10％FBS)，37℃5％(v/v)CO₂孵育2小时。弃去培养上清液和未附着细胞，将含有10％FBS的RPMI 1640培养基补充至贴壁细胞，37℃5％(v/v)CO₂条件下培养18小时。弃去培养上清液和未附着细胞，将添加有500U/mL重组人GM-CSF(PEPROTECH)和500U/mL重组人白细胞介素IL-4(PEPROTECH)的RPMI 1640完全培养基补充至贴壁细胞，培养4天。4天后，培养基中补充添加有GM-CSF和IL-4的RPMI 1640完全培养基，并将细胞再培养2天。然后用含有1ug/mL LPS的RPMI 1640完全培养基替代该培养基，孵育18小时。然后加入含有EDTA的PBS并在300g离心5分钟，收集树突细胞。吸出上清液，再用PBS洗涤细胞一次。将收集的人CD14+树突细胞重悬于RPMI 1640完全培养基中，进行细胞计数。

(步骤2)人CD4+T细胞的分离和纯化

根据制造商提供的说明书，用MagCellect^TM人CD4+T细胞分离试剂盒(R&DSystems)，从PBMC中分离和纯化人CD4+T细胞。

(步骤3)混合淋巴细胞反应

将来自不同健康志愿者的纯化的CD4+细胞与树突细胞在96孔板中共培养。细胞密度调整至10⁵个细胞每80uL。将10⁵个纯化的CD4+T细胞和2×10⁴个树突细胞加入到96孔板的每个孔中，将实施例2所得纯化的抗PD-1抗体加入到板的合适孔中，并将板在37℃5％CO²的培养箱中孵育6天。收集上清液，测定细胞因子水平。

(步骤4)ELISA检测上清液中的IFN-γ和IL-2水平

分别使用人IFN-γQuantikine ELISA试剂盒(R&D Systems SIF50)和人IL-2Quantikine ELISA试剂盒D2050(R&D Systems S2050)，根据制造商提供的操作说明书和试剂盒试剂，对前述步骤收集的上清液中IFN-γ或IL-水平进行定量。

IL-2结果如图14-15和表14-15所示，显示IL-2水平随抗PD-1抗体浓度的增加而增加。IgG对照为人IgG，表14-15中列出的值为培养上清液中IL-2的浓度(pg/mL)。PBMC供体-1和PBMC供体-2指献血者ID。

表14混合淋巴细胞反应试验检测嵌合抗PD-1mAb诱导的IL-2释放(PBMC供体-1)

表15混合淋巴细胞反应试验检测嵌合抗PD-1mAb诱导的IL-2释放(PBMC供体-2)

IFN-γ结果如图16-21和表16-19所示，显示IFN-γ水平随抗PD-1抗体浓度的增加而增加。IgG对照为人IgG，表16-19中列出的值是培养上清液中的IFN-γ浓度(pg/mL)。PBMC供体-1和PBMC供体-2指献血者ID。

表16混合淋巴细胞反应试验检测嵌合PD-1mAb诱导的IFN-γ释放(PBMC供体-1)

表17混合淋巴细胞反应试验检测嵌合PD-1mAb诱导的IFN-γ释放(PBMC供体-2)

表18混合淋巴细胞反应试验检测嵌合PD-1mAb诱导的IFN-γ释放(PBMC供体-1)

表19混合淋巴细胞反应试验检测嵌合PD-1mAb诱导的IFN-γ释放(PBMC供体-2)

实施例6-确定抗PD-1抗体可变区中的氨基酸序列

总RNA分离：对实施例2所得杂交瘤亚克隆的上清液进行表征(即生物活性的验证和测定，实施例3-5)后，离心收集5×10⁷个杂交瘤细胞。将1mL Trizol加入到细胞沉淀中，混合并转移到1.5mL离心管中，室温孵育5分钟。向样品中加入0.2mL氯仿，涡旋15秒。放置2分钟后，将混合物4℃，12000g离心5分钟。收集上清液，转移到新的1.5mL离心管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混合，将样品在室温下孵育10分钟。样品4℃，12000g离心15分钟。吸出上清液，沉淀物用1mL 75％(v/v)乙醇洗涤。将混合物4℃，12000g离心5分钟，弃去上清液，风干沉淀物。向沉淀物中加入DEPC处理的水(55℃水浴10分钟)，获得总RNA。

逆转录和PCR：将1ug RNA和逆转录酶加入到终体积为20uL的反应混合物中，将混合物42℃温育60分钟，然后70℃温育10分钟以终止反应。制备50uL PCR反应混合物，其含有1uL cDNA，25pmol各引物，1uL DNA聚合酶，250umol dNTPs和缓冲系统。PCR程序设置如下：95℃变性3分钟，35个循环的变性(95℃30秒)、退火(55℃30秒)和延伸(72℃35秒)，随后72℃最后延伸5分钟，以获得PCR产物。使用的市售逆转录试剂盒是PrimeScript RT MasterMix(Takara，RR036)，市售的Q5超保真聚合酶PCR试剂盒来自NEB(M0492)。

克隆和测序：琼脂糖凝胶电泳检测5uL的PCR产物，用NucleoSpin Gel&PCR纯化试剂盒(MACHEREY-NAGEL，740609)从琼脂糖凝胶中回收样品。连接反应：向50ng样品中加入50ng T载体，0.5uL连接酶和1uL缓冲液，用水调整终体积至10uL。使用T4DNA连接酶(NEB，M0402)，将反应混合物16℃温育30分钟。向冰上孵育5分钟的100uL感受态细胞(Ecos 101感受态细胞，Yeastern，FYE607)中加入5uL连接产物，42℃热休克1分钟，并再次在冰上孵育1分钟。加入650uL不含抗生素的SOC培养基回收细胞，振荡培养箱中37℃，200rpm孵育30分钟。将200uL的各细菌培养物涂布于含有抗生素的LB琼脂平板上，37℃过夜。第二天，用T载体引物M13F和M13R进行PCR反应。使用移液枪头挑取细菌菌落浸入PCR反应混合物中，并上下吸取。将一半反应混合物转移到含有100nM氨苄青霉素的LB琼脂平板上。PCR反应结束后，取5uL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品送去进行测序分析(Kabat，1991，“目的蛋白质序列”，NIH,Bethesda,MD)。测序结果如表1-2所示。

实施例7-全人抗PD-1抗体的转化，表达和纯化

(步骤1)质粒的构建和制备：实施例6获得抗PD-1抗体重链和轻链可变区的序列。将抗PD-1抗体的重链可变区序列亚克隆到含有信号肽和人重链IgG4恒定区(具有S228P突变)的表达载体中。将抗PD-1抗体的轻链可变区序列亚克隆到含有信号肽和人抗体轻链κ恒定区的表达载体中。测序验证和确认重组质粒(测序方法与实施例6相同)。用试剂盒(MACHEREY-NAGEL)进行碱裂解，以提高重组质粒的纯度和质量，并用0.22uM过滤器(Millpore)过滤质粒。将纯化的质粒用于转染。

(步骤2)转染：在37℃，130RPM，8％CO²(v/v)条件下，在FreeStyle 293培养基(Invitrogen)中培养HEK293E细胞(Invitrogen)。将HEK293E细胞的细胞密度调整至1-1.5x10 ⁶/mL，用于进行转染。将10％(v/v)F68(Invitrogen)加入到FreeStyle 293培养基中，终浓度为0.1％(v/v)，作为培养基A。将5mL培养基A和200ug/mL PEI(Sigma)混合，以产生培养基B。将5mL培养基A和100ug/mL步骤1所得重组质粒混合，以产生培养基C。温育5分钟后，将培养基B和培养基C混合并温育15分钟，以产生混合物D。将10mL混合物D缓慢加入到100mL HEK293E细胞中，连续搅拌以避免PEI的局部积聚。HEK293E细胞振荡孵育过夜。第二天，加入蛋白胨至终浓度为0.5％(w/v)。约第5-7天，检测抗体效价。约第6-7天，对HEK293E培养物离心(30分钟，3500RPM)，收集上清液并用0.22uM过滤器过滤以纯化。

(步骤3)抗体纯化：蛋白A柱(GE)用0.1M NaOH洗涤30分钟，或用5倍床体积的0.5MNaOH洗脱内毒素。长时间未使用的柱要在1M NaOH中浸泡至少1小时，用不含内毒素的水洗涤至中性pH，并用10倍床体积的1％Triton X100洗涤。随后，用5倍床体积的PBS(PBS磷酸盐缓冲液，pH7.2)平衡柱子。将步骤2所得过滤上清液加载到柱子上，如果需要，收集流出物。用5倍床体积的PBS洗涤柱子，然后用5倍床体积的0.1M甘氨酸-HCl pH3.0洗脱。用0.5倍床体积的1M Tris-HCl(NaCl 1.5M)pH8.5中和含抗PD-1抗体的洗脱液。将人抗PD-1抗体在1XPBS中透析4小时，以避免内毒素污染。透析后，分光光度法或试剂盒测定抗PD-1抗体浓度，用HPLC-SEC测定抗体的纯度，用内毒素检测试剂盒(Lonza)测定内毒素的含量。对全人抗PD-1抗体进行表征，结果如图22-41和表20-25所示。

表20ELISA检测的全人抗PD-1mAb与人PD-1^ECD-hFc的结合活性

表21ELISA检测的全人抗PD-1mAb与食蟹猴PD-1^ECD-hFc的结合活性

表22ELISA检测的全人抗PD-1mAb与其他免疫检查点蛋白的结合活性

表23FACS检测的全人抗PD-1mAb与CHO-K1-hPD-1的结合活性

表24FACS检测的全人抗PD-1mAb与CHO-K1-cPD-1的结合活性

表25Biacore检测的全人抗PD-1mAb与His-标记的人PD-1ECD蛋白的结合动力学和亲和力

实施例8-Biacore检测结合和解离常数

将抗人Fc IgG固定于流动池1和2：使用HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mMEDTA，0.05％P2O，pH 7.4)作为流动缓冲液，并使用固定化指南进行抗人Fc IgG的固定化。用新鲜混合的50mmol/L NHS和200mmol/L EDC活化S系列CM5传感器芯片的流动池1和2。将稀释于10mM NaAC(pH4.5)的20μg/mL的抗人Fc IgG注射到活化的流动池1和2中。剩余的活性偶联位点用1M乙醇胺封闭。

将重组His标记的hPD-1ECD蛋白质稀释至50nM，然后用HBS-EP+缓冲液进行4次2倍连续稀释。His-标记的hPD-1ECD蛋白的浓度为0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM和50nM。用HBS-EP+作为流动缓冲液进行K_D的测量。将每种抗体以10uL/min的流速注射到CM5传感器流动池2中，以达到230RU响应。然后将制备的His-标记的hPD-1ECD蛋白质以30uL/min的流速注射到流动池1和2中，持续180秒。缓冲液流动维持400秒(30uL/min)用于解离测量。为了从表面去除测试的抗体，将pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl注射20秒(30uL/min)。流动池1用作参考流动池。对于连续稀释的每个浓度的His-标记的PD-1^ECD蛋白，重复上述步骤。使用Biacore T200评估软件1.0评估每种抗体的K_D值，用1：1结合模型拟合数据。结果如表25所示。

实施例9-ADCC和CDC效应功能分析

为了证实推测的全人抗PD-1抗体的效应功能的缺失，进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验和补体依赖性细胞毒性(CDC)试验。

对于ADCC试验，用ADCC培养基(无酚红)将表达PD-1的Jurkat T细胞样品的浓度调整至12.5×10⁴个细胞/mL。将40uL细胞悬浮液(1×10⁴个活细胞)加入到V底96孔板的每个孔中。用ADCC培养基(无酚红)连续稀释20uL抗体，一式三份地加入各孔中。最终的抗体浓度为：1.4ng/mL、4.1ng/mL、12.3ng/mL、0.037ug/mL、0.111ug/mL、0.333ug/mL和1ug/mL。将板在22-25℃孵育30分钟。用ADCC培养基(无酚红)调节稳定转染FcγRⅢ158V的NK92细胞，以便通过向靶细胞中加入40μL稳定转染FcγRⅢ158V的NK92细胞，使得效应细胞与靶细胞的比值为1：1。然后将板在37℃孵育4小时。孵育4小时后，每孔加入100uL来自CytoTox 96试剂盒(Promega)的底物。作为细胞裂解的最大释放量的对照在加入100uL来自CytoTox 96试剂盒的底物前10分钟，加入2uL裂解液(CytoTox-ONETM试剂盒，Promega)。将板在室温下孵育10分钟，然后每孔加入50uL终止液，混合30秒。测量560/590nm处的吸光度，使用GraphPadPrism 5.0计算1％裂解值。图37所示结果显示抗-HLA抗体在表达PD-1的JurkatT细胞中诱导ADCC，但全人抗PD-1抗体对表达PD-1的Jurkat T细胞没有ADCC作用。

对于CDC试验，收获PBMC并使用CD4+T细胞分离试剂盒(Stemcell，No.19052)分离CD4+T细胞。CD4+细胞与抗CD3抗体(克隆：OKT3)一起温育48小时，以诱导PD-1的表达。收集细胞，用细胞培养基将细胞浓度调整至1.25×10⁶个细胞/mL。向平底的96孔白色板中加入40uL/孔的细胞。每孔加入40μL/孔的全人抗PD-1抗体，用CDC培养基连续稀释，一式两份地加入各孔中。最终的抗体浓度为：0ng/mL、16ng/mL、80ng/mL、0.4ug/mL、2ug/mL和10ug/mL。将板在通风橱中孵育30分钟。将市售的纯化人补体(Quidel,cat#042637)以20uL/孔加入到含有细胞的板中，至终浓度为20％。将板在37℃孵育20小时。根据制造商提供的方案，使用Celltiter-glo细胞活力发光试剂盒(Promega，No.G7573)检测细胞活力。将板在微板振荡器上以200的速度振摇2分钟，然后室温孵育10分钟。用Envision读取发光信号。为了进行数据分析，使用GraphPad Prism 5.0计算细胞毒性％。图38所示结果显示，抗HLA抗体在活化的CD4+T细胞中诱导了CDC，但是全人抗PD-1抗体对活化的CD4+T细胞没有CDC效应。

实施例10-差示扫描量热法(DSC)检测的抗体热稳定性

用样品缓冲液将全人抗PD-1抗体调整至1mg/mL，终体积为约700uL。参数设置如下(VP-DSC)：起始温度30℃；最终温度100℃；扫描速度50℃/小时；重扫描次数为0；预扫描(prescan)恒温3分钟；扫描后(PostScan)恒温0分钟；后循环恒温25℃；过滤时间25秒；反馈模式/收益为无；流动池重置参数35℃。得到的蛋白质-缓冲液热分析图结果，通过抵消相应的缓冲液-缓冲液扫描值，然后将基线拟合至踪迹线。用Origin TM 7.0软件记录在热分析图中观察到的每个峰最大值处的Tms。结果如图39所示。

实施例11-抗体的冻/融稳定性

全人抗PD-1抗体的冻融稳定性如下表征。将100uL各抗PD-1抗体的小份冷冻原液在室温下解冻。一旦完全解冻，将样品在-80℃冷冻箱中快速冷冻，并在-80℃保持至少2小时，然后再在室温下解冻。对样品进行三次相同的冷冻/解冻循环。用目测检查沉淀情况。在三次冷冻/解冻循环之后，从样品中取出20uL小份试样进行尺寸排阻色谱(SEC)分析。通过HPLC-SEC表征，分析冷冻/解冻循环之前和之后的全人抗PD-1抗体的稳定性。图40所示结果表明，在三次冷冻/解冻循环后，单体IgG占所测试的各抗PD-1抗体的95％以上。

实施例12-抗体溶解度

4℃下，将10mg IgG用14000g离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL 30K)浓缩至＞100mg/mL，以表征全人抗PD-1抗体的溶解度。将2mL或更多的IgG加入到离心过滤器中，4℃下14000g浓缩。离心的设置时间为2min、3min、5min、8min、15min和20min，每次将20uL分装到收集管中，用分光光度计在A280处检测浓度。浓度达到100mg/mL时，结束离心。对于HPLC-SEC表征，将6uL浓缩样品注射到HPLC-SEC柱中，基于峰面积确定单体和聚集体的百分比。图41所示结果表明，测试的全部全人抗PD-1抗体具有超过100mg/mL的溶解度，并且对于测试的全部抗PD-1抗体，单体IgG高于95％。

在详细描述本发明的情况下，参照其具体实施方式，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明主题和范围的情况下，进行各种变化和修饰是显而易见的。

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序列表

<110> 钜川生物医药

<120> 抗PD-1抗体及其应用

<130> P2017-2091

<150> CN201510451773.6

<151> 2015-07-28

<160> 77

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Thr Ser

20 25 30

Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

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Gly Gly Ser Ile Ser Thr Ser Asn Trp Trp Ser

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

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1 5

<210> 9

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<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Gly Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

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Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Phe His

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Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys

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Gly

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn His Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

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Leu Ala Ala Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Gly Gly

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Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Ala Ala Ser Thr Leu Leu Ser

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Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Tyr Thr

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Leu Thr Gly Asp Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

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Gly

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Thr Gly Asp Pro Asp Tyr

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

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Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr

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Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Leu Thr

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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Arg Gly Ser

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Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp

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Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Thr Asn Pro Ser Leu

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Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

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Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Asp Ile Ala Thr Thr Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 30

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 31

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 32

Gln Gln Leu Asp Ser Tyr Pro Arg Thr

1 5

<210> 33

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 33

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Leu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Asn Arg Ile Pro Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 34

Thr Tyr Leu Met His

1 5

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 35

Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 36

Glu Asn Arg Ile Pro Val Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Ser Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 38

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Ser Trp Thr

1 5

<210> 41

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 41

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Gly Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Gly

50 55 60

Ile Ser Val Gln Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

His Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Phe

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

Ser Asn Ser Gly Ala Trp Asn

1 5

<210> 43

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Gly Ile Ser Val

1 5 10 15

Gln Ser

<210> 44

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 44

Asp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 45

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 45

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Leu Ser Val Asn Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Tyr Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 46

Arg Ala Ser Leu Ser Val Asn Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 47

Tyr Asp Thr Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 48

Gln Gln Tyr His Tyr Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 49

<211> 127

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Ile Thr Leu Val Arg Gly Ala Asp Tyr Tyr Tyr Asn Tyr

100 105 110

Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 50

Tyr Tyr Gly Met His

1 5

<210> 51

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 51

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 52

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 52

Gly Ile Thr Leu Val Arg Gly Ala Asp Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Asp Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 53

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 53

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 54

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 54

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 55

Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 56

Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 57

<211> 369

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 57

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc actagtaatt ggtggagttg ggtccgccag 120

cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc acagtgggag catcaactac 180

aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca ggtccaagaa ccagttctcc 240

ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcac 300

tatggttcgg ggagttatta taacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360

gtctcttca 369

<210> 58

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 58

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg tatagtgatg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgacaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctcg acaaactccg 300

tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 59

<211> 342

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 59

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt gactatggct ttcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg gtctggagtg ggtggcagtt atttggtatg atggaagtaa tgaatactat 180

acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggat acggctatgt atttctgtgt ggttaatcct 300

tttgactatt ggggccaggg aaccctggtc actgtctcct ca 342

<210> 60

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 60

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ttgttggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca gggcattaac cattatttag cctggtatca acaaaaacca 120

gggaaagctc caaacctcct catccttgct gcatctactt tgctatcagg ggtcccatct 180

cggttcggtg gcagaggatc tgggacagat ttcactctca tcatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttacta ctgtcaaaaa tatgacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 61

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 61

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ttgttggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcgagtca gggcattaac cattatttag cctggtatca acaaaaacca 120

gggaaagctc caaacctcct catccttgct gcatctactt tgctatcagg ggtcccatct 180

cggttcggtg gcagaggatc tgggacagat ttcactctca tcatcagcag cctgcagcct 240

gaagatgttg caacttacta ctgtcaaaaa tatgacagtg ccccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 62

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 62

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaga gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtaacaact ggccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 63

<211> 357

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 63

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcgctg tctctggtca ctccatcaga ggtagttact tctggggctg gatccggcag 120

cccccaggga ggggcctgga gtggattggg agtatctatc atagtgggag tacctacaca 180

aatccgtccc tcaagagtcg agccaccata tcagtagaca cgtccaagaa tcagttctcc 240

ctgaagctga actctgtgac cgccgcagac acggccgtgt attactgtgc gagagatctg 300

gatatagcga ctacgcgaga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 64

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 64

gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcatttgtc gggccagtca gggcattaac aattatttag cctggtatca gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag cttgatagtt accctcggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 65

<211> 360

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 65

gaggtgcaac tgttggagtc tgggggaggc ttggcacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt ctcctttaac acctatctca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggtg gtggtggtaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgttt attactgtgc gaaagaaaac 300

cgtatcccag tggccccctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

<210> 66

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 66

gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggccagtca gagtattagt acctggttgg cctggtatca acagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gatgatcttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt tttcgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 67

<211> 375

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 67

caagtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaacc cctcgcagac cctctcactc 60

acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg gtgcttggaa ctggatcagg 120

cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180

aatgattatg gaatatctgt gcaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240

cacttctccc tgcagctgaa ttctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300

agagatccct attactatgg ttcggggagt tactttgact actggggcca gggaaccctg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 68

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 68

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtat ctccagggga aagagtcacc 60

ctctcctgca gggccagtct gagtgttaac agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat acatccacca gggccactgg tgtcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tatcattact ggccgctcac tttcggcggc 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 69

<211> 381

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 69

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt cagtttcagt tactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagtggtatt 300

actctggttc ggggagccga ttactattac aactacgata tggacgtctg gggccaaggg 360

accacggtca ccgtctcctc a 381

<210> 70

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 70

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca gagcctcctg catagtaatg gatacaacta tttggattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180

tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaactccc 300

ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336

<210> 71

<211> 143

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 71

Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala

1 5 10 15

Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe

20 25 30

Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro

35 40 45

Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln

50 55 60

Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr

85 90 95

Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu

100 105 110

Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro

115 120 125

Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

<210> 72

<211> 288

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 72

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 73

<211> 948

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 73

gcctgagcag tggagaaggc ggcactctgg tggggctgct ccaggcatgc agatcccaca 60

ggcgccctgg ccagtcgtct gggcggtgct acaactgggc tggcggccag gatggttctt 120

agactcccca gacaggccct ggaacccccc caccttctcc ccagccctgc tcgtggtgac 180

cgaaggggac aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga gcttcgtgct 240

aaactggtac cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgctt tccccgagga 300

ccgcagccag cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca caactgccca acgggcgtga 360

cttccacatg agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc ggcacctacc tctgtggggc 420

catctccctg gcccccaagg cgcagatcaa agagagcctg cgggcagagc tcagggtgac 480

agagagaagg gcagaagtgc ccacagccca ccccagcccc tcacccaggc cagccggcca 540

gttccaaacc ctggtggttg gtgtcgtggg cggcctgctg ggcagcctgg tgctgctagt 600

ctgggtcctg gccgtcatct gctcccgggc cgcacgaggg acaataggag ccaggcgcac 660

cggccagccc ctgaaggagg acccctcagc cgtgcctgtg ttctctgtgg actatgggga 720

gctggatttc cagtggcgag agaagacccc ggagcccccc gtgccctgtg tccctgagca 780

gacggagtat gccaccattg tctttcctag cggaatgggc acctcatccc ccgcccgcag 840

gggctcagcc gacggccctc ggagtgccca gccactgagg cctgaggatg gacactgctc 900

ttggcccctc tgaccggctt ccttggccac cagtgttctg cagaccct 948

<210> 74

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

gctagcacca agggcccttc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 60

tccaccgccg ctctgggctg tctggtgaag gactacttcc ctgagcctgt gaccgtgagc 120

tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 180

ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccttcct cctccctggg caccaagacc 240

tacacctgca acgtggacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagtcc 300

aagtacggcc ctccttgccc tccctgccct gcccctgagt tcctgggcgg accctccgtg 360

ttcctgttcc ctcctaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacccc tgaggtgacc 420

tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat cctgaggtcc agttcaattg gtacgtggat 480

ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cctcgggagg aacagttcaa ctccacctac 540

cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggaatacaag 600

tgcaaggtca gcaacaaggg cctgccctcc tccatcgaga aaaccatctc caaggccaag 660

ggccagcctc gcgagcctca ggtgtacacc ctgcctccta gccaggaaga gatgaccaag 720

aatcaggtgt ccctgacatg cctggtgaag ggcttctacc cttccgatat cgccgtggag 780

tgggagagca acggccagcc agagaacaac tacaagacca cccctcctgt gctggactcc 840

gacggctcct tcttcctgta ctccaggctg accgtggaca agtcccggtg gcaggaaggc 900

aacgtctttt cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 960

ctgtccctgt ctctgggcaa gtga 984

<210> 75

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 76

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttga 324

<210> 77

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

Claims

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有以下多肽序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3：

(1)分别为SEQ ID NOs:30、31、32、26、27、和28；

(2)分别为SEQ ID NOs:6、7、8、2、3、和4；

(3)分别为SEQ ID NOs:14、15、16、10、11、和12；

(4)分别为SEQ ID NOs:22、23、24、18、19、和20；

(5)分别为SEQ ID NOs:38、39、40、34、35、和36；

(6)分别为SEQ ID NOs:46、47、48、42、43、和44；或

(7)分别为SEQ ID NOs:54、55、56、50、51、和52；

其中，所述的抗体或其抗原结合片段结合PD-1。

2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO：25、1、9、17、33、41或49至少95％同源性的多肽序列的重链可变区，或具有与SEQ ID NO：29、5、13、21、37、45或53至少95％同源性的多肽序列的轻链可变区。

3.如权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含：

4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是嵌合的。

5.如权利要求1至3中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段是人的。

6.如权利要求5所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，其包含具有S228P突变的人重链IgG4恒定区和人抗体轻链κ恒定区恒定区。

7.一种分离的编码权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的核酸。

8.一种包含权利要求7所述的分离的核酸的载体。

9.一种包含权利要求8所述的核酸的宿主细胞。

10.一种药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的分离的单克隆抗体或抗原结合片段，和药学上可接受的载体。

11.一种在其需要的受试者中阻断PD-1与PD-L1或PD-L2的结合、或增加IFN-γ和IL-2的分泌的方法，其包括向所述受试者施用权利要求10所述的药物组合物。

12.一种在其需要的受试者中治疗感染性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的方法，其包括向所述受试者施用权利要求10所述的药物组合物。

13.一种在其需要的受试者中治疗肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用权利要求10所述的药物组合物，其中，所述的肿瘤选自下组：实体瘤、血液癌、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌、和甲状腺癌。

14.一种制备权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以产生所述单克隆抗体或抗原结合片段，并从细胞或细胞培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。

15.一种制备包含权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将所述单克隆抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体组合，以获得所述药物组合物。