CN107921151A

CN107921151A - 降低成像后胰腺炎风险的组合物和方法

Info

Publication number: CN107921151A
Application number: CN201680043076.XA
Authority: CN
Inventors: S·胡赛恩
Original assignee: Intrexon Corp
Current assignee: Precigen Inc
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2018-04-17
Also published as: HK1249035A1; EP3302580A1; JP2018524287A; US10898592B2; EP3302580A4; US20180110885A1; EP3302580B1; WO2016191743A1

Abstract

本发明涉及用于降低采用放射性造影介质的手术，特别是对胰腺、胆囊和/或胆道系统进行选择性成像的手术成像后胰腺炎风险的组合物和方法。在非限制性的实施方式中，本发明提供了一种放射性造影介质，其包括：(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂，以及其在进行胰腺和相关结构成像中的应用，所述应用相对于缺少成分(ii)和(iii)的传统放射性造影剂具有降低的继发胰腺炎风险。

Description

降低成像后胰腺炎风险的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本发明要求2015年5月27日提交的美国临时专利申请系列第62/167,143号的优先权，其通过引用全文纳入本文。

资助信息

本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号DK083327和DK03002的资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

1.发明概述

本发明涉及应用于胰腺和相关结构成像研究中降低成像后胰腺炎风险的组合物，以及应用的相应方法。

2.背景技术

内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)是一种常见的胃肠道手术，其中将内窥镜插入十二指肠并且对肝胰管壶腹(Ampulla of Vater)进行插管¹。放射性造影物质(RC)通过导管注射，从而以放射学方式观察胰胆道系统。ERCP是一种常见手术，其年发生率在美国是每100,000人中60至75例²。其在清除胆总管(CBD)中嵌入的胆结石以及各种其它治疗性干预中是必不可少的。然而，ERCP最为常见的医源性并发症是急性胰腺炎，这是胰腺炎的一种疼痛、炎性病症。ERCP后胰腺炎(PEP)的发生率在1％至15％之间，其总体平均值是3.5％^3,4。PEP被认为是由于胰腺管中的静水压力和胰脏暴露于RC联合导致。在高风险情况下，人们已经使用放置胰腺管支架或直肠给予抗炎药吲哚美辛^5-9。然而，广泛接受的预防PEP的策略，如使用直肠吲哚美辛进行预处理²的功效受到了挑战^3,4。对PEP预防的研究需要揭示RC诱导导致胰腺炎的胰腺损伤的这一至今尚未被阐述的基本机制。

3.发明内容

本发明涉及用于降低采用放射性造影介质的手术，特别是对胰腺、胆囊和/或胆道系统进行选择性成像的手术成像后胰腺炎风险的组合物和方法。

在非限制性实施方式中，本发明提供了一种放射性造影介质，其包含：(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂。在相关的非限制性实施方式中，所述放射性造影介质可以用于以相对于缺少成分(ii)和(iii)的传统放射性造影剂降低的后续胰腺炎风险进行胰腺和相关结构的成像。

在某些非限制性实施方式中，本发明的所述放射性造影介质可以用于内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)，其中它降低了ERCP后胰腺炎(PEP)的风险。

在相关的非限制性实施方式中，所述放射性造影介质可以用于胰腺和相关结构的成像以降低随后可能发生的任何胰腺炎的程度。

在相关的非限制性实施方式中，可以将放射性造影介质直接地(例如，引入胆胰导管)或间接地(例如，通过静脉内给予)引入胆道系统。

在其它非限制性实施方式中，本发明提供了用于胰腺炎体外试验的高通量筛选，所述胰腺炎体外试验使用病毒介导的报告系统以测量腺细胞系中炎性变化和/或损伤，以及分析通过病毒载体接受荧光素酶报告基因的小鼠胰腺NF-kB的体内方法。

在其它非限制性实施方式中，本发明提供了胰腺炎症的调节剂，使用病毒介导的报告系统以测量腺细胞系中炎性变化和/或损伤的胰腺炎体外试验，以及分析通过病毒载体接受荧光素酶报告基因的小鼠胰腺NFAT的体内方法。

4.附图的简要说明

图1A-1F。RC输注在小鼠胰腺腺泡细胞中引起体内胰腺炎并诱导Ca²⁺信号。(A)使用灌注泵将RC输注到胆总管下端(箭头处)的原理图(P，胰腺；D，十二指肠)。(B)来自NS伪对照和灌注RC(以20μl/分钟，100μl体积)的小鼠的代表性HE切片。导管内RC以及增加的速率和体积的组合诱导了更大的组织学严重程度和更高的血清淀粉酶水平。(n＝各条件5只动物)。*，相对NS伪，P<0.05。(C)将小鼠胰腺腺泡细胞上样至定制的灌流室并使用共焦显微镜成像。(D)载有Ca²⁺染料Fluo-4AM的腺泡在基线、在Ca²⁺荧光初始上升期间和使用RC灌流期间的峰值荧光的相衬图像和伪彩色图像。以白色虚线勾勒出单个的腺泡细胞，红色箭头表示Ca²⁺信号从细胞的顶端到基底区域的发展。(E)具有升高浓度的RC的Ca²⁺通量的全细胞示踪总和。(F)Ca²⁺信号测量值的振幅和曲线下面积。使用RC(25％)在存在或不存在含有Ca²⁺介质的情况下灌注腺泡细胞。*，与17％RC相比，P<0.05。

图2A-2F。使用碘海醇(欧乃派克Omnipaque300)输注后的组织学亚评分(subscore)，以及碘帕醇(Isovue 300)也诱导胰腺炎的证据。(A)外科手术24小时后收集胰脏头部的HE染色切片。胰腺炎的组织组织学严重程度通过水肿、炎性浸润和坏死的存在分级。(n＝各组5只动物)。*，相对NS伪，P<0.05。(B)来自输注NS伪、碘帕醇和碘海醇小鼠的代表性HE切片。外科手术24小时后测量(C、E)组织学严重程度，(D)血清淀粉酶水平，和(F)血清IL-6。(n＝各组5只动物)。*，相对NS伪，P<0.05。

图3A-3E。RC在人胰腺腺泡细胞中诱导的Ca²⁺信号和钙调磷酸酶活化，但无法在非胰腺细胞系中诱导相当大的Ca²⁺信号。(A)载有Fluo-4AM并用RC(10％-50％)灌注的人腺泡细胞的全细胞示踪总和。(B)振幅和曲线下面积的定量。(n＝各条件20-30个细胞)。*，相对于10％RC，P<0.05。(C)使用Ad-NFAT-荧光素酶感染人腺泡细胞，并以浓度渐增的RC刺激。RC(25％)诱导的NFAT-荧光素酶活性被细胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA所抑制。(n＝3)。*，#，P<0.05，分别相对于对照或单独的RC。来自载有Fluo-4AM并用RC(25％-75％)灌注的(D)HEK293或(E)COS7细胞的全细胞示踪总和。在这些图中，显示了实验的终止部分，其中灌注卡巴胆碱(1mM)以确认细胞调动Ca²⁺的能力(各条件n＝20-30个细胞)。

图4A-4D。RC通过Ca²⁺调动和IP3R诱导腺泡细胞钙调磷酸酶活化。使用Ad-NFAT-荧光素酶感染小鼠腺泡细胞并用RC(A)以各种时间段(25％RC)刺激或(B)以渐增的浓度刺激5小时。RC(9％)诱导的NFAT-荧光素酶活性被(C)30分钟使用钙调磷酸酶抑制剂K506(24μM)和环孢菌素(CsA；16μM)的预处理或(D)30分钟使用IP3R抑制剂2-APB(100μM)或细胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM(64μM)的预处理所抑制。(n＝3)。*，#，P<0.05，分别相对于对照或单独的RC。

图5。RC碘帕醇(Isovue-300)在AR42J细胞中诱导钙调磷酸酶活化。使用Ad-NFAT-荧光素酶感染AR42J细胞，并以不同浓度的RC碘帕醇刺激(n＝3)。*，P<0.05，相对于对照。

图6A-6E。由于RC，钙调磷酸酶是诱导腺泡细胞NF-κB(κ轻链增强子B的核因子)活化所必须的，并且也足以诱导其活化。来自使用(A)20％RC或各种浓度的RC刺激15分钟或30分钟的原代小鼠腺泡细胞的蛋白质印迹，探测磷酸化IκBα或p65。其下显示各印迹的光密度。(B)使用Ad-NF-κB-荧光素酶过夜感染腺泡分化的AR42J细胞，并使用浓度渐增的RC孵育6小时。将AR42J细胞以各种时间(实线)暴露于RC(25％)，然后用缓冲液洗去(虚线)，并孵育总共6小时。(C)NF-κB-荧光素酶活性在AR42J细胞使用U73122(5μM)、2-APB(100μM)、BAPTA(64μM)，(D)FK506(24μM)和CsA(16μM)的预处理抑制。(n＝3)。*，#，P<0.05，分别相对于对照或单独的RC。(E)使用渐增滴定量的携带催化钙调磷酸酶A亚基的组成型活化形式的腺病毒(Ad-ΔCn)感染，或使用Ad-EGFP(阴性对照)感染AR42J细胞。测量NFAT-和NF-κB-荧光素酶活性。大于4x10⁵感染单位(IFU)量的Ad-EGFP不能增加荧光素酶水平。AR42J细胞中NFAT-荧光素酶和NF-κB-荧光素酶活性之间的关联性(R²＝0.9185；P＝0.0002)。(n＝3)。*，P<0.05，相对于单独的Ad-EGFP。

图7A-7H。RC在AR4fu2J细胞中诱导Ca²⁺信号和钙调磷酸酶活化。(A)载有Fluo-4AM并用RC(碘海醇；10％-25％)灌注的AR42J细胞的全细胞示踪总和。(B、D)振幅和曲线下面积的定量。(C)RC(25％)-诱导的腺泡细胞Ca²⁺信号被PLC抑制剂U73122(5μM)和IP3R抑制剂2-APB(100μM)抑制。(n＝各条件20-30细胞)。*，#P<0.05，分别相对于10％RC或单独的RC。使用Ad-NFAT-荧光素酶感染AR42J细胞，并以浓度渐增的RC刺激(E)。RC(6％)诱导的NFAT-荧光素酶活性被(F)使用钙调磷酸酶抑制剂FK506(24μM)的预处理，(G)使用CsA(16μM)的预处理或(H)使用U73122(5μM)、2-APB(100μM)或细胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA(64μM)的预处理所抑制。(n＝3)。*，#，P<0.05，分别相对于对照或单独的RC。

图8A-8F。RC碘帕醇(Isovue-300)也在AR42J细胞中诱导NF-κB活化，并且RC诱导的NF-kB活化不是由高渗状态、氧化应激或未酯化脂肪酸所引起的。(A)使用Ad-NF-κB-荧光素酶感染AR42J细胞，并以不同浓度的碘帕醇刺激。(n＝3)。*，P<0.05，相对于对照。(B)通过用冻融渗透压计(R²＝0.9832)测量渗透压(osmolality)来验证计算的碘海醇的渗透压(来自产品插页)。(C)使用Ad-NF-κB-荧光素酶感染AR42J细胞，并以暴露于渗透浓度渐增的碘海醇或甘露醇(对照)。(D)以模拟全强度放射性造影物质渗透压(osmolarity)的浓度向小鼠输注甘露醇(672mOsmol)。输注24小时后对胰组织切片进行分级.测量在存在或不存在(E)ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC；2-8mM)或(F)脂肪酶抑制剂奥利司他(Orlistat)(50-100μM)的情况下经RC(16％)刺激的AR42J细胞的NF-kB-荧光素酶。(n＝3)。*，P<0.05，相对于对照。

图9A-9F。RC通过Ca²⁺/钙调磷酸酶依赖性途径导致腺泡细胞坏死。(A)使用浓度渐增的RC处理腺泡细胞6小时，并且测量碘化丙锭摄取。RC(12％)-诱导的腺泡细胞损伤(6小时孵育)被(B)U73122(5μM)，2-APB(100μM)，BAPTA(64μM)，或(C)NF-κB抑制剂IKK-2(20μM)抑制。(D)钙调磷酸酶的抑制(FK506；24μM，CsA；16μM)或(E)调节性钙调磷酸酶Aβ亚基(CnAβ)的基因缺失的抑制。(F)由使用RC(12％)处理3.5小时±FK506的腺泡细胞测量ATP水平。(n＝3)。*，#，P<0.05，分别相对于对照或单独的RC。

图10A-10C。AR42J细胞中RC-诱导的细胞坏死取决于钙调磷酸酶，以及来自PEP模型的组织学亚评分。(A)RC(12％)-诱导的腺泡细胞坏死被FK506(24μM)或CsA(16μM)抑制。(n＝3)。*，#，P<0.05，分别相对于对照或单独的RC。RC输注24小时后，(B)在存在或不存在药理学上的()钙调磷酸酶抑制的情况下或(C)通过将野生型小鼠(WT)与CnAβ敲除小鼠进行比较收集胰脏头部的HE-染色的切片。胰腺炎的组织组织学严重程度通过水肿、炎性浸润和坏死的存在分级。(n＝各组5只动物)。*，相对NS伪P<0.05。

图11A-11F。PEP依赖于钙调磷酸酶。(A)相对于RC输注，给予FK506(1mg/kg)的原理图。(B&F)胰脏头部的代表性H&E切片。(C&F)总体严重程度评分(左)，和血清淀粉酶测量值(右)。(n＝各组5只动物)。(D)来自已经接受AAV6-NF-κB-荧光素酶导管内输注的小鼠胰腺的生物发光。36小时内胰腺NF-κB-生物发光信号(n＝各组3只动物)定量。(F)来自胰脏头部的IL-6、GADD45B和IL-1β的基因表达(n＝3)。*，#，P<0.05，分别相对于NS伪或单独的RC。

图12A-12C。FK506预处理在RC-诱导的胰腺炎期间与NSAID预处理一样有效。(A)RC输注后给予吲哚美辛(7mg/kg；IP)的原理图。RC±吲哚美辛后，(B)总体严重程度评分和亚评分(C)。*，#，P<0.05，分别与NS伪或单独的RC对比。

图13A-13D。PEP诱导后给予的FK506减少了胰腺炎症。(A)RC输注后给予FK506(1mg/kg)的原理图。(B)RC±FK506之后，胰脏头部的代表性H&E切片。RC±FK506之后(C)总体严重程度评分(左)和亚评分(右)。(D)RC输注±FK506后24小时测量的血清淀粉酶(左)和IL-6(右)。(n＝各组5只动物)。*，#，P<0.05，分别相与NS伪或单独的RC比较。

图14A-14C。RC-诱导的腺泡细胞Ca²⁺信号不被钙调磷酸酶调节。来自(A)小鼠原代腺泡细胞，(B)人原代腺泡细胞或(C)载有Fluo-4AM并用RC(25％-50％)灌注的AR42J细胞的全细胞示踪总和。振幅和曲线下面积的定量在右边示出。(n＝各条件20-30个细胞)。

图15。设想图。RC暴露引起腺泡细胞：(1)PLC的活化；(2)IP3的产生导致IP3R-诱导的Ca²⁺释放；(3)钙调磷酸酶的下游活化；(4)NF-κB向细胞核的移位，导致(5)腺泡细胞损伤和胰腺炎。抑制方案以红色示出。PIP2、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯；DAG，甘油二酯。

图16A-16C。使用Cre-lox重组的Cn的腺泡细胞特异性缺失可以防止小鼠中的PEP。(A)通过使Ela-CreERT2小鼠与CnB1^f/f小鼠杂交诱导腺泡细胞Cn敲除系(Cn^Δ/Δ)，然后给予他莫昔芬(tamoxifen)。(B)来自假手术、导管操纵(DM)和ERCP后胰腺炎(PEP)模型化条件的代表性胰脏头部HE切片，以及组织学严重程度评分。(C)左侧是通过图像阈值评估水肿，右侧是MPO染色。

图17A-17F。Ela-CreERT2/CnB1^f/f基因型和CnB1缺失的确认。(A)包含loxP位点的CnB1敲入等位基因的原理图，和(B)Ela-CreERT2转基因的原理图。红色箭头表示设计为分别产生575和289bp的5'和3'loxP位点PCR产物的正向和反向引物。蓝色箭头表示2803bp的CnB1跨越区域。(C)显示获得预期大小的PCR产物的琼脂糖凝胶，以验证loxP位点和Ela-CreERT2转基因的存在。(D)包含loxP位点的CnB1基因的示意图。红色箭头表示设计成鉴定产生168bp片段的CnB1^Δ/Δ的正向和反向引物。(E)显示在胰腺中鉴定CnB1缺失的PCR产物的2％琼脂糖凝胶。(F)响应放射性造影物质(RC)，NFAT荧光素酶活性在来自CnB1^Δ/Δ的胰腺细胞中显著减少，但并不在来自CnB1^f/f对照的胰腺细胞中减少。*，#，P<0.05，分别相对于阴性和阳性对照。

图18A-18E。他莫昔芬诱导的Ela-CreERT2/CnB1^f/f小鼠中Cn的腺泡细胞特异性缺失可以防止限定PEP的胰腺损伤的组分。(A)整个胰腺和邻近器官，包括十二指肠(D)和脾脏(Sp)的图像。白色虚线围绕着十二指肠旁的胰腺区域，用于盲式组织学分级。来自假手术、导管操纵(DM)和ERCP后胰腺炎(PEP)模型化条件的胰脏头部HE切片的(B)水肿、(C)炎症和(D)坏死评分。(E)来自IHC染色的组织切片的MPO评分。(n＝各条件5只动物)。*，#，P<0.05，分别相对于非floxed敲除伪对照(non-floxed out control sham)和各阳性对照。

图19A-19D。Cn的腺泡细胞特异性缺失可以在小鼠中防止胆汁酸输注性胰腺炎。(A)左侧，代表性的HE切片，以及右侧，总体组织学严重程度。(B)水肿、(C)炎症和(D)坏死的组织学亚评分。(n＝各条件5只动物)。*，#，P<0.05，分别相对于非floxed敲除伪对照和各阳性对照。

图20A-20C。使用导管内输注AAV6-Ela-iCre的腺泡细胞特异性Cn缺失可以防止在小鼠中的PEP。(A)在CnB1^f/f小鼠系中导管内输注AAV6-Ela-iCre(腺泡细胞特异性)或AAV6-CMV-ZsGreen(AAV6对照)的原理图。(B)来自伪对照和PEP条件的代表性HE切片，以及组织学严重程度评分。(n＝各条件5只动物)。(C)水肿和MPO。(n＝各条件5只动物)。*，#，P<0.05，分别相对于伪对照和各阳性对照。

图21A-21F。新型AAV6-Ela-iCre构建体的导管内输注靶向胰腺腺泡细胞并且防止PEP。(A)AAV6-Ela-iCre质粒的原理图。(B)向Lox-Stop-Lox td番茄红报告小鼠输注AAV6-Ela-iCre以测试病毒载物递送的特异性。在胰腺中观察到红色荧光，并且从邻近器官，如小肠(SI)、肝脏(L)和脾脏(Sp)排除。在该组织切片中，白色虚线将胰腺(左)与十二指肠(右)分离。来自假手术和ERCP后胰腺炎(PEP)模型化条件的胰脏头部的(C)水肿、(D)炎症和(E)坏死评分。(F)MPO评分。(n＝各条件5只动物)。*，#，P<0.05，分别相对于阴性和阳性对照。

图22A-22B。导管内(ID)给予Cn抑制剂以及输注放射性造影防止了PEP。(A)来自假手术、导管操纵(DM)和ERCP后胰腺炎(PEP)模型化条件的代表性胰脏头部HE切片。将Cn抑制剂FK506(1μM)或CsA(10μM)与放射性造影溶液递送到胰腺内导管。(B)组织学严重程度评分。(n＝各条件5只动物)。*，#，P<0.05，分别相对于伪对照和各阳性对照。

图23A-23D。Cn抑制剂的导管内输注减少限定PEP的胰腺损伤组分。(A)水肿、(B)炎症和(C)坏死的组织学亚评分。(D)PEP输注后6小时的血清淀粉酶(n＝各条件5只动物)。*，#，P<0.05，分别相对于阴性和阳性对照。

5.具体实施方式

为了清楚说明而非限制本公开，将具体实施方式分为以下小章节详细描述。

(a)放射性造影剂；

(b)钙调磷酸酶抑制剂；

(c)抗氧化剂；

(d)放射性造影介质组合物和试剂盒；

(e)治疗的方法；和

(f)试验系统。

根据本发明使用的放射性造影介质包括如下三个成分：(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂。

5.1放射性造影剂

根据本发明使用的放射性造影介质包括的一个要件是放射性造影剂。放射性造影剂是一种改善内部身体结构在基于X射线的成像技术(例如但不限于计算机断层摄影术和射线照相术)中的可见性的组合物。作为一个具体的、非限制性示例，用于本发明的放射性造影介质中的放射性造影剂是适合在内镜逆行胰胆管造影术(“ERCP”)中进行成像的试剂。

在本发明的非限制性实施方式中，放射性造影剂的量足以在成像研究中促进成像。

在本发明的非限制性实施方式中，放射性造影剂是水溶性的。

在本发明的非限制性实施方式中，放射性造影剂是非离子的。

在本发明的非限制性实施方式中，放射性造影剂是非离子的单体，例如，低渗透压造影剂，如但不限于，碘帕醇碘海醇碘佛醇(Optiray^TM)、碘普罗胺碘昔兰或碘喷托(Imagopaque)。

在本发明的非限制性实施方式中，放射性造影剂是非离子的二聚体，例如，低渗透压造影剂，如但不限于，碘美罗(Iotrol)或碘克沙酸(Visipaque^TM)。

在本发明的非限制性实施方式中，放射性造影剂是离子放射性造影剂。

在本发明的非限制性实施方式中，放射性造影剂是碘化的放射性造影剂。

5.2钙调磷酸酶抑制剂

本发明的放射性造影介质的第二个组分是一种或多种钙调磷酸酶抑制剂，其可以直接或间接地抑制钙调磷酸酶的作用。在一具体的非限制性实施方式中，被抑制的钙调磷酸酶是人钙调磷酸酶。

在本发明的非限制性实施方式中，本发明的放射性造影介质中存在的钙调磷酸酶抑制剂的量为与抗氧化剂一起有效降低对象胰腺炎的风险。

在本发明的非限制性实施方式中，本发明的放射性造影介质中存在的钙调磷酸酶抑制剂的量为与抗氧化剂一起有效降低对象ERCP后胰腺炎的风险。

在本发明的非限制性实施方式中，存在的钙调磷酸酶抑制剂的量在胰腺产生一局部浓度，其降低放射性造影介导的NF-κB(κ轻链增强子B的核因子)和/或NFAT的活性增长，至少约20％或至少约30％在腺泡细胞培养中导致的增长。

在某些非限制性实施方式中，钙调磷酸酶抑制剂是环孢菌素A。

在某些非限制性实施方式中，钙调磷酸酶抑制剂是FK506(他克莫司)。

在本发明的非限制性实施方式中，其中钙调磷酸酶抑制剂是环孢菌素A，本发明的放射性造影介质包括的环孢菌素A的量可以是产生至少5μM，或至少10μM，或至少16μM，或至少10μM，或约16μM，或约5μM至10μM之间，或约5至20μM之间，或约10至20μM之间和/或至多20μM或至多30μM局部浓度的量。

在本发明的非限制性实施方式中，其中钙调磷酸酶抑制剂是FK506，本发明的放射性造影介质包括的FK506的量可以是产生至少10μM，或至少20μM，或至少30μM或约20μM，或约24μM，或约10至40μM之间，或约20至30μM之间和/或至多30μM或至多40μM局部浓度的量。

5.3抗氧化剂

本发明的放射性造影介质的第三个组分是抗氧化剂。

在本发明一具体的非限制性的实施方式中，抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸。

在本发明一具体的非限制性的实施方式中，抗氧化剂是亚硒酸钠。

在本发明一具体的非限制性的实施方式中，抗氧化剂是维他命E。

在本发明一具体的非限制性的实施方式中，抗氧化剂是β-胡萝卜素。

在本发明的非限制性实施方式中，本发明的放射性造影介质中存在的抗氧化剂的量与钙调磷酸酶抑制剂一起有效降低对象胰腺炎的风险。

在本发明的非限制性实施方式中，本发明的放射性造影介质中存在的抗氧化剂的量与钙调磷酸酶抑制剂一起有效降低对象ERCP后胰腺炎的风险。

在本发明的非限制性实施方式中，其中抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸，本发明的放射性造影介质包括的N-乙酰半胱氨酸的量可以是至少2nM或约1至3nM之间。

5.4放射性造影介质组合物和试剂盒；

在非限制性实施方式中，本发明提供了根据本发明使用的一种放射性造影介质，其包括在对象中进行放射成像有效量的下述三个成分：(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂，由此相对于不与钙调磷酸酶抑制剂和抗氧化剂一起给予的放射性造影剂降低成像后胰腺炎风险。合适的放射性造影剂、钙调磷酸酶抑制剂和抗氧化剂组分的非限制性示例在上述部分中示出。

在某些非限制性实施方式中，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的放射性造影介质，还包括生理上合适的溶剂，如水。所述药物组合物可以还包括一种或多种配制剂，如但不限于缓冲液和/或防腐剂。

在某些非显著性实施方式中，可以将钙调磷酸酶抑制剂和/或抗氧化剂加入放射性造影剂的市售制剂中。

在某些非限制性的实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，其包括治疗量的(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和/或(iii)抗氧化剂，可以在使用前将其合并。

在某些非限制性的实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，其包括治疗量的(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和/或(iii)抗氧化剂，可以将其分开给予，或以亚组合给予正在治疗的对象。

5.5治疗的方法

根据本发明，可以在成像手术中使用根据本发明的放射性造影介质，而不是传统的成像介质，用以相对于使用传统成像介质进行成像手术的对照对象，降低术后胰腺炎的风险。例如，对照对象可以具有和治疗对象相似的临床表现。

在非限制性实施方式中，本发明提供了一种对象体内胰腺、胆囊和/或胆道系统放射成像的方法，其包括将如上所述包括(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂的放射性造影介质引入对象的胰腺、胆囊和/或胆道系统，由此相对于接受没有钙调磷酸酶抑制剂和没有抗氧化剂的放射性造影剂的对象，所述对象将会具有降低的成像后胰腺炎发病风险的优势。

在非限制性实施方式中，对象可以是人对象或非人对象，如狗、猫、马、猪、牛、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或兔。

在非限制性实施方式中，可以在EPCP手术中使用根据本发明的放射性造影介质，而不是传统的成像介质，用以相对于使用传统成像介质进行成像手术的对照对象，降低EPCP后胰腺炎的风险。

例如但不限于，在手术后超过24小时进行测量，如果对象表现出新的或加剧的腹痛以及血清淀粉酶的增加，例如达到被视为正常的上限的至少两倍或至少三倍的水平，那么可以认为对象患有胰腺炎。

尤其受益于本发明的对象是那些处于发生术后胰腺炎风险的对象，包括但不限于，具有一种或多种如下特征的患者：Oddi括约肌功能障碍，年龄年轻，女性和/或胰腺炎的既往史，和/或在成像手术期间插管困难，进行了向胰腺管内的多次注射，进行了预切的括约肌切开术或胰腺括约肌切开术的情况。

可以将本发明的放射性造影介质在成像手术之前或过程中给予对象。其可以通过注射或输注或局部滴注给予。例如但不限于，其可以通过胆胰导管或静脉内给予。放射性造影介质的全部三种组分或各种组合可以共同或分开给予，以实现在患者中的组合。

进一步使用本发明的放射性造影介质，可以采用下述方法中的一种或多种以进一步降低胰腺炎的风险和/或限制胰腺炎的损伤：(i)使用一种或多种胰腺酶(促胰液素)抑制药物治疗，如阿托品、降血钙素、生长抑素、胰高血糖素和/或氟尿嘧啶；(ii)使用一种或多种蛋白酶抑制药物的治疗，如抑肽酶、加贝酯甲磺酸(mesylate)、卡莫司他和/或磷脂酶A2；(iii)使用一种或多种抗炎剂的治疗，如非甾体抗炎药(例如，吲哚美辛)、别嘌呤醇、前列腺素抑制剂、血小板活化因子拮抗剂、血小板激活因子乙酰水解酶或来昔帕泛(Lexipant)；(iv)通过硝酸甘油、硝苯地平或利多卡因减轻Oddi括约肌压力；(v)使用抗生素治疗；(vi)在胰腺管内放置支架；和/或(vii)使用如5-氟尿嘧啶的抗代谢药的治疗。

在某些非限制性实施方式中，本发明提供了一种在需要降低成像后胰腺炎风险治疗的对象中降低成像后胰腺炎风险的方法，其包括以降低对象成像后胰腺炎风险的量使用放射性造影介质(如本文所述)，作为对对象的胰腺和相关结构进行成像的试剂，所述放射性造影介质包括(i)放射性造影剂；(ii)钙调神经磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂。

5.6试验系统

在某些非限制性实施方式中，本发明提供了可以用于鉴定降低成像后胰腺炎风险的试剂的试验系统。所述试验系统可以是体外或体内试验。

在某些非限制性实施方式中，试验是体外试验，其包括原代腺泡细胞或胰腺细胞品系的细胞，其中已经引入了以可表达的形式(例如，可操作地连接炎性诱导启动子，如IL-4启动子)编码NF-κB或NFAT的核酸，所述NF-κB或NFAT融合至报告基因，例如，NF-κB-荧光素酶或NFAT-荧光素酶。例如，可以以裸露DNA或通过病毒载体(例如但不限于，腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体)引入所述核酸。当使用胰腺细胞系的时候，可以在促进腺泡细胞类型表型的条件下培养。这样的培养系统的一个具体示例在下述第6部分的工作实施例中列出，其特征通过引用纳入本说明书。

相应地，在非限制性的实施方式中，本发明提供了一种确定测试化合物是否可以用于降低成像后胰腺炎风险的方法，其包括(i)提供原代腺泡细胞或胰腺细胞系细胞，其中已经引入编码与可检测的报告物融合的NFκB或与可检测的报告物融合的NFAT的核酸，该核酸可操作地连接炎症诱导型启动子；(ii)将细胞暴露于放射性造影剂和测试化合物，并且确定NFκB-报告物的量或NFAT-报告物的量；和(iii)将(ii)中确定的NFκB-报告物的量或NFAT-报告物的量与存在于对照细胞中的NFκB-报告物的量或NFAT-报告物的量比较，所述对照细胞在不含测试化合物的相当条件下暴露于放射性造影剂；其中如果(ii)中确定的NFκB-报告物的量或NFAT-报告物的量小于(iii)中确定的NFκB-报告物的量或NFAT-报告物的量，该测试化合物可以用于降低成像后胰腺炎的风险。

在非限制性的实施方式中，本发明提供了体内试验，其中将如上所述的NFκB-报告物构建体或NFAT-报告物构建体引入动物体内的胰腺细胞，例如通过直接滴注至胰腺。一个具体的非限制性示例是携带可操作地连接启动子的编码NFκB-荧光素酶融合体核酸的AAV载体，这可以用于将融合构建体引入体内胰腺细胞。参见第6部分中的工作实施例。可以类似地将该体内试验用于体外试验以评估测试化合物在NFκB-报告物或NFAT-报告物中降低放射性造影诱导的增长的能力。

在某些非限制性实施方式中，本发明提供了体内试验，其中将测试化合物引入动物体内的胰腺细胞，例如，通过将其直接滴注至胰腺，以及类似的体外试验，其可以用于评估测试化合物降低成像后胰腺炎或其标志物风险的能力，所述标志物例如但不限于，血清淀粉酶中放射性造影诱导的增加；总体组织学严重程度，包括但不限于，水肿、炎性浸润、坏死；和/或髓过氧化物酶(MPO)中的增加。

6.实施例：实施例：放射性造影暴露通过触发钙和钙调磷酸酶诱导胰腺NF-κβ和胰腺炎

6.1.材料和方法

试剂和动物。RC主要表示碘海醇(欧乃派克300；GE医疗公司(GE Healthcare)；新泽西州普林斯顿)，其被归类为低渗透压(672mOsm/kg水)、非离子、碘化(300mg/碘/ml)造影介质。使用与碘海醇是同一类的第二RC碘帕醇(Isovue 300；博莱科诊断公司(BraccoDiagnostics),新泽西州普林斯顿)验证研究的主要发现，并其用途在文中指定。如前所述构建NFAT-荧光素酶(凯杰公司(Qiagen)；加利福尼亚州巴伦西亚)、NF-κB-荧光素酶(维克多生物实验室公司(Vector Biolabs)；宾夕法尼亚州费城)和组成型活性钙调磷酸酶(ΔCn)腺病毒^10-12。除非另外说明，全部其它试剂购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯)。以标准实验室饲料喂养体重为22-28g的Swiss Webster小鼠(杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories)，缅因州巴港)，不禁水。CnAβ-/-小鼠属于B6129J/F1品系¹³。年龄、性别和品系匹配的对照小鼠用作野生型(WT)对照。所用动物实验使用匹兹堡大学动物护理和使用委员会(University of Pittsburgh Institutional Animal Careand Use Committee)批准的方案进行。

小鼠中导管内RC输注。用于向CBD和胰腺管逆行输注的方法已经在之前描述¹⁴。简言之，用异氟烷麻醉麻醉Swiss Webster小鼠。沿中线切开以使腹腔裸露。翻转十二指肠以显示其远侧，并通过结扎固定。30G针头通过十二指肠的抗-肠系膜方向插入以插管到CBD。将小动脉夹夹在CBD下端(近十二指肠)以防止输注液回流到十二指肠腔内且将插管固定到位。将较大的动脉夹夹在CBD上端(近肝脏)以防止输注流到肝脏并因此引导液体流向胰腺管。使用P33灌注泵(哈佛设备公司(Harvard Apparatus)，马萨诸塞州霍利斯顿)，将总体积为50-100μl的碘海醇、碘帕醇或生理盐水(NS)以每分钟10-20μl输注5分钟。在输注完成后，取下动脉夹。使用7mm伤口夹闭合外腹部伤口，并且在手术后立即给予丁丙诺啡的单次注射(0.075mg/kg)。该步骤后，小鼠在加热垫上恢复30分钟。手术后让其自由进食和饮水。

检测和分析小鼠和人腺泡的细胞Ca²⁺信号。室温下，将用高亲和力Ca²⁺-感应染料Fluo-4AM(K_d＝300nM；英杰公司)加到腺泡细胞。将腺泡细胞上样至酸洗涤的玻璃盖玻片，然后安装在灌注室。然后，在室温下以不同浓度的稀释在HEPES缓冲液中的RC(17-50％)刺激它们。在各实验结束时给予卡巴胆碱(1mM)以确认细胞是完整的，并且可以调动细胞内Ca²⁺存储。以20X、1.4数值孔径物镜使用蔡司LSM710激光扫描共聚焦显微镜。染料在488nm波长下激发，并每2秒收集>515nm的发射信号。记录来自单个腺泡细胞的荧光。记录的分析使用ImageJ软件(NIH，马里兰州贝塞斯达)进行，并且绘制各区域中平均荧光随时间的变化。

NFAT-荧光素酶活性试验。按照之前所述步骤使用Ad-NFAT-荧光素酶感染腺泡细胞^10,15,16。该构建体包括置于IL-4启动子下游的荧光素酶基因，所述IL-4启动子包括9个串联的NFAT结合位点¹⁰。在刺激之前，腺泡细胞与NFAT-驱动的荧光素酶腺病毒孵育1.5小时。将所有陈述的抑制剂加入30分钟，然后使用RC刺激。使用荧光素酶试验系统测量NFAT-荧光素酶。简言之，以1,000rpm对细胞进行5分钟离析，使用PBS洗涤，然后使用报告物裂解5X缓冲液(普洛麦格公司(Promega)#E397A，威斯康辛州麦迪逊)裂解。将样品涡旋，并以12,000g离心2分钟。将上清液铺板，并且使用Synergy H1读板器(伯腾仪器公司(BioTek)，佛蒙特州威努斯基)测量发光，并标准化至总蛋白质。

NF-κB-荧光素酶活性试验。通过给予地塞米松(100nM)48-72小时，AR42J细胞向腺泡表型分化¹⁷。在刺激之前，使用之前所述方法，使用Ad-NF-κB荧光素酶感染AR42J细胞。使用DMEM/F12培养基洗涤后，将腺泡细胞平均地分布在48孔板中，并在37℃孵育30分钟。它们与RC以不同浓度和时间孵育。使用商业上可得的荧光素酶试验(普罗麦格，威斯康星州麦迪逊)测量NF-κB-荧光素酶。简言之，以1,000rpm对细胞进行5分钟离析，使用PBS洗涤，然后使用报告物裂解5X缓冲液(普洛麦格公司，目录好E397A)裂解。将样品涡旋，并以12,000x g离心2分钟。将上清液铺板，并且使用Synergy H1读板器(伯腾仪器公司，佛蒙特州威努斯基)测量发光，并标准化至总DNA。

体内胰腺NF-κB生物发光的成像。构建AAV6-NF-κB-荧光素酶报告体，在HEK293细胞中扩增，并如之前所述进行纯化^18-20,39。使用如上所述和最近出版的文献的RC输注相同的技术，将100μl体积的病毒(10¹²GCP/ml)以10μl/分钟的速率输注到胰胆管^21,39。手术后恢复5周后，使用或不使用FK506处理对小鼠进行PEP诱导。在手术后的不同时间点，从2至36小时的范围内，通过在开始成像前15分钟首先在脖颈的颈背给予荧光素(150μg/g体重)的皮下注射获得生物发光信号。使用异氟烷简单地麻醉小鼠，并将其以仰卧位放置在生物发光成像室(IVIS光谱成像仪；帕金埃尔默公司(Perkin Elmer)，马萨诸塞州沃森姆)中3-10分钟。由感兴趣的胰腺区域(在上腹部)测量平均像素强度。各小鼠的原始时间点被标准化至其在零点时间的个体基线强度。

胰腺组织制备、组织学分级和血清淀粉酶。将胰腺、十二指肠和脾脏在4％多聚甲醛中室温固定24小时。使用苏木精和伊红(HE)对石蜡包埋的切片进行染色，并使用20X物镜对超过10个独立视野以盲测的方式进行分级。如Wildi等所述，对胰腺组织的水肿、炎症浸润和坏死进行分级⁶⁷。全血样品以1500x g在4℃离心5分钟。如之前所述，使用Phadebas试剂盒(安玛西亚制药公司(Amersham Pharmacia)，新泽西州皮斯卡塔韦)测量血清淀粉酶⁶⁸。

制备用于Ca²⁺成像的小鼠胰腺腺泡。如之前所述，稍作修改，分离胰腺腺泡细胞的组^26,69。简言之，移除胰腺，然后在缓冲液中将其切碎5分钟，所述缓冲液包括20mM HEPES(pH7.4)、95mM NaCl、4.7mM KCl、0.6mM MgCl₂、1.3mM CaCl₂＝、10mM葡萄糖和2mM谷氨酰胺，以及加入了1％BSA、1XMEM非必需氨基酸(GIBCO/BRL)、200单位/ml 4型胶原酶(沃明顿公司(Worthington)，新泽西州雷克伍德)和1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂。将组织在37℃以90rpm振荡孵育30分钟。将消化物转移至15mL锥形管，并使用无胶原酶缓冲液洗涤。将悬浮液剧烈震荡15-20秒以使细胞分离成更小的簇。

磷酸-IκBα和p65移位的蛋白质印迹。使用2mg/ml胶原酶在加1％丙酮酸钠和1％BSA的F12/DMEM培养基中分离小鼠胰腺腺泡。洗涤3次后，将腺泡细胞培养在加0.1％BSA的F12/DMEM培养基中。使用RC处理细胞，并在不同时间点收集细胞。使用1X PBS洗涤细胞，并在1X SDS样品缓冲液中裂解。为了检验p65的核移位，使用NE-PER核和细胞溶质提取试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，伊利诺州洛克福德)提取核和细胞溶质部分。40微克的蛋白质在4-20％梯度PAGE凝胶上跑样。所有的抗体均购自细胞信号公司(CellSignaling)(马萨诸塞州贝弗利)。通过蛋白质印迹使用磷酸-IκBα-特异性抗体(#2859)检验IκBα在Ser32上的磷酸化。肌动蛋白(#4967)作为加样对照。使用细胞信号公司抗体(#4764)在核和细胞溶质部分上对p65进行印迹。GAPDH(#2118)和组蛋白3(#9715)分别用作细胞溶质和核的标志物。使用Image J软件(NIH)进行光密度分析。

细胞坏死试验。在RC添加之前，胰腺细胞在48孔板与50μg/ml的碘化丙啶(PI)孵育30分钟。以536nm激发波长和617nm发射波长测量荧光在上至6小时时间周期的随时间变化。使用0.5％Triton-X 100裂解细胞后测量荧光，其被用于对结果进行相对于总DNA的标准化。

ATP水平测量。分离后，将胰腺腺泡细胞以37℃水浴培养在DMEM/F12培养基(48孔板0.5ml/孔)中，并使用RC±FK506处理。在指定时间点收集细胞，并在100μl裂解缓冲液(100mM Tris pH 7.75；4mM EDTA)中裂解。使用ENLITEN荧光素酶/荧光素试剂(普洛麦格公司目录号FF2021)，由20μl等分的腺泡细胞裂解物测量ATP水平。

全胰腺的RNA提取和实时PCR。通过将40mg的组织在2ml的TRIzol试剂(生命科技公司(Life Technologies)，纽约州格兰德岛)以4℃匀浆由胰脏头部获得总RNA，并立即快速冷冻在液氮中。将样品在冰上溶解，并以12,000x g在4℃离心10分钟。使用200μl的氯仿稀释上清液，并以12,000x g在4℃离心15分钟。使用0.5ml的异丙醇处理上层水相，并以10,000x g在4℃离心10分钟。使用150μl的75％乙醇重悬沉淀，并以7500x g在4℃离心5分钟。将沉淀风干，并溶于100μl不含核酸酶的水中。使用iScript高级cDNA合成试剂盒(伯乐公司(Bio Rad)；加利福尼亚州赫拉克勒斯)利用总RNA样品生成cDNA。

进行定量实时PCR(rtPCR)以确定细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达，以及细胞生长阻滞和DNA-损伤诱导型基因GADD45B。各自的引物对以及GAPDH对照作为PrimePCR-PreAMP SYBR Green试验(伯乐公司；唯一试验ID号qMmuCEP0054186、qMmuCID0005641、qMmuCEP0039581)一部分获得。rtPCR反应使用SsoAdvanced通用型超混物SYBR Green系统(伯乐公司)在20μl反应体积中进行。该反应包括1X SsoAdvanced通用型SYBR Green超混物、300nM正向引物、300nM反向引物和100ng cDNA。rtPCR条件为在伯乐Bio Rad CFX96触控热循环仪上以95℃进行10秒，然后以60℃进行30秒35个循环(伯乐公司)。mRNA表达的结果标准化至18S rRNA的表达，并且以相对于针对各对照组的表达水平表示。

统计学分析。数据以平均值±标准偏差表示，除非另有说明。使用未配对的T检验确定统计学显著性并定义为P值≤0.05。

6.2.结果

RC的导管内输注在小鼠中诱导胰腺损伤。如在方法中详述，小鼠中PEP模型通过经十二指肠的CDB插管形成(图1A)。通过夹紧近端CBD将输注引入胰腺管，并因此防止倒流进肝脏。

通过出现水肿、炎症浸润和坏死分级，由手术过程24小时后的胰腺头部评估胰腺炎的组织学严重程度(图1B和图2A)。血清淀粉酶在术后6小时测量。

临床报告已经表明，ERCP后胰腺炎是由于胰腺的压力和暴露于造影剂联合导致³。因为当前可用的恒定压力泵不能以小鼠胰胆管所需的足够低的速率(10-20μl/分钟)输注，压力的改变通过变化输注的速率和体积进行模拟。

生理盐水(NS)输注速率和体积的加倍使得组织学严重程度增长33％(P<0.05)，但其并不引起血清淀粉酶的升高，这表明胰腺炎并未达到阈值水平。然而，将NS替换为RC后，似乎对组织学严重程度具有累加效果，导致比导管内NS伪对照高59％的增长(P<0.05)。血清淀粉酶增长至少50％，并且在几个批次的试验中以1.5倍至3.5倍范围增长。基于这些发现，增加的压力和RC暴露导致了PEP模型中的损伤。

已经证明酸性造影剂将在大鼠中调解胰腺炎的严重程度²².当使用10mMHEPES缓冲RC时，pH被固定在6，然而，相较于pH为7时，小鼠中胰腺炎的严重程度没有增长。大部分的实验使用碘海醇(欧乃派克300)进行，这是在ERCP中常用的RC²³。然而，使用另外一种低渗透压、非离子的、碘化的RC，即碘帕醇(Isovue 300)的发现也是相似的(图2B-2F)。

RC在小鼠胰腺腺泡细胞中诱导高振幅的Ca²⁺信号。RC暴露是PEP的主要作用因子，因此检验了RC在分离的胰腺细胞中启动离体胰腺炎的机制。尽管管细胞排列在胰腺管和小管，但是胰腺超过85％的部分是由胰腺腺泡细胞组成的²⁴。胰腺炎在腺泡细胞内开始，并在大多数实验模型中最早、关键的因素之一是大振幅、峰值平台的(或持续的)Ca²⁺信号^25-27。为了测试RC是否诱导了腺泡细胞Ca²⁺信号，新鲜分离5至15个原代腺泡细胞的小簇(其组成腺泡)。在其上添加高亲和力Ca²⁺-染料Fluo-4AM，并使用延时共聚焦成像在灌注室中成像(图1C-1F)。在ERCP期间，即使使用小心地将RC滴注到胰腺管的专用胰造影术，我们仍然估计腺泡腔暴露在从10％至50％浓度范围的RC，这是因为来自胰液的大量稀释。出于这个原因，使用上述RC的稀释物灌注腺泡。

浓度为17％至20％的RC在100秒内引起低振幅的Ca²⁺瞬态，然后立即恢复到基线。当RC增加到25％，然后增加到33％，出现了峰值平台Ca²⁺波，其从顶端传播到大多数细胞的基底外侧区域。这些信号的特征是高振幅(超过基线400％)以及持续的平台。Ca²⁺信号甚至在无Ca²⁺培养基中以同样的方式开始，这表明RC首先引发Ca²⁺从细胞内储存释放。

为了确定细胞调动Ca²⁺的能力，在所有这些实验5分钟后灌注毒蕈碱激动剂卡巴胆碱(1mM)。RC还在从尸体供体获得的存活的人腺泡细胞中诱导Ca²⁺信号和钙调磷酸酶活化(图3A-3C)。在胰腺腺泡细胞中所见的强Ca²⁺信号并没有在HEK293或COS7细胞系中观测到，这表明RC诱导的Ca²⁺信号对腺泡细胞一定水平的选择性(图3D-3E)。

RC诱导腺泡细胞钙调磷酸酶活化。由于RC诱导Ca²⁺信号，本实施例检验了作为胰腺炎中假定的Ca²⁺靶标的钙调磷酸酶是否被活化。为了检验钙调磷酸酶活化，使用腺病毒NFAT(活化T细胞核因子)-荧光素酶，其包括来自IL-4启动子的9个串联的NFAT结合基序¹⁰。细胞溶质中NFAT的钙调磷酸酶脱磷酸作用导致向细胞核的移位，并因此驱动荧光素酶。

在原代腺泡细胞中，RC在NFAT-荧光素酶中导致浓度依赖性增长，并且该增长是由于钙调磷酸酶活化，因为钙调磷酸酶抑制剂FK506(24μM)和环孢菌素(CsA；16μM)很大程度上防止了由于RC的上升(图4)。RC的钙调磷酸酶活化部分依赖于肌醇1,4,5-三磷酸受体(IP3R)活化，因为2-APB(100μM)将荧光素酶的上升降低了47％(P<0.05)。然而，钙调磷酸酶活化由于BAPTA-AM(64μM)完全下降。RC碘帕醇同样以浓度依赖性的方式诱导NFAT活化(图5)。这些数据表明RC通过细胞溶质Ca²⁺的上升诱导钙调磷酸酶在腺泡细胞中的活化。

RC通过Ca²⁺/钙调磷酸酶依赖性途径导致NF-κB活化。胰腺炎中炎症的主要调节物是转录因子NF-κB，其可以诱导几种炎性基因，包括IL-6、Spi2a、TGF-β和IL-1β^28-31。在原代腺泡细胞中，渐增浓度的RC诱导IκBα在丝氨酸32的磷酸化作用(这是早期降解信号³²)以及p65的核移位(图6A)。为了确定RC是否在报告物系统中诱导NF-κB，我们使用了腺病毒NF-κB荧光素酶，其需要过夜感染以及6-8小时的RC给予¹²。由于在对于本试验的长期培养中使用原代腺泡细胞的局限性，我们转向AR42J胰腺细胞系，其在使用地塞米松(100nM)致敏48-72小时时诱导腺泡细胞表型¹⁷。RC诱导的Ca²⁺信号和钙调磷酸酶在该细胞系中被活化，并且也在原代腺泡细胞中被活化(图7)。RC在NF-κB-荧光素酶中导致浓度依赖性和时间依赖性增长(图6B)。甚至RC的短暂暴露(即，以25％给予10分钟，然后洗出)导致LE在NF-κB-荧光素酶中高于基线5倍的增长，所述RC的短暂暴露更加接近地模拟了ERCP期间的暴露条件。然而，在60、90和120分钟观察到统计学显著的增长，分别导致高于基线58倍、59倍和112倍的增长。RC碘帕醇同样以浓度依赖性的方式诱导NF-κB活化(图8A)。

归因于RC的NF-κB活化依赖于磷脂酶C(PLC)、IP3R和细胞溶质Ca²⁺，因为荧光素酶水平被它们分别的抑制剂U73122(5μM)、2-APB(100μM)和BAPTA(64μM；图6C)所降低。一个关键的发现是钙调磷酸酶抑制剂FK506(24μM)和CsA(16μM)分别降低73％和79％的NF-κB(P<0.05；图6D)。总之，RC通过Ca²⁺依赖性途径和钙调磷酸酶依赖性途径导致NF-κB活化。

使用的碘海醇制剂(欧乃派克300)所具有的渗透压在全强度是672mOsm/kg，将其归类为低渗透压造影介质²³(表1)。

表1.计算的碘海醇渗透压与使用渗透压计测量的本实施例中使用的浓度的比较。

放射性造影物质(％)	计算值(mOsm/kg)	测量值(mOsm/kg)
			0	330	330
5	347	356
			10	364	396
15	381	409
			25	416	459

十二个随机、对照的整合分析研究无法证明低渗透压或高渗透压RC之间在诱导临床PEP中的显著差异³³。尽管如此，使用甘露醇检验了渗透压在NF-κB活化上是否有任何贡献(图8B-8C)。虽然RC在350mOsm/L诱导了300倍的NF-κB升高，但等摩尔浓度的甘露醇却无法引起增长。对于氧化应激在介导RC肾病中的作用存在相矛盾的数据^34,35。然而，在腺泡细胞系中，使用活性氧物质(ROS)清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC；2-12毫摩尔)的预处理对NF-κB活化没有影响(图5D)。根据最近的研究报道^36,37，另一个需要考虑的因素是RC是否可能包含甘油三酸酯脂质乳液，其可以在ERCP期间通过暴露于胰腺分泌物中的脂肪酶释放毒性非酯化的脂肪酸(图8E)。然而，RC的制造商否认添了了任何乳液。此外，使用脂肪酶抑制剂奥利司他的预处理没有显著减少RC对NF-κB的活化。该结果表明，RC诱导的NF-κB活化独立于渗透压、氧化应激或脂肪酸毒性。

钙调磷酸酶活化足以诱导腺泡细胞NF-κB活化。为了确定钙调磷酸酶是否足以诱导NF-κB活化，使用含有组成型活性钙调磷酸酶的腺病毒感染AR42J细胞，所述组成型活性钙调磷酸酶是缺少自抑制结构域的截短的催化钙调磷酸酶A亚基¹¹(Ad-ΔCn；图6E)。

NFAT-荧光素酶活性在使用Ad-ΔCn以大于1x10⁵功能性病毒感染单元(IFU)感染后达到最大。甚至更高滴度的Ad-EGFP(阴性对照)无法诱导NFAT-荧光素酶。有趣的是，使用Ad-ΔCn的NF-κB活化中存在浓度依赖性增长。这些数据表明，在腺泡细胞系中，钙调磷酸酶活化足以诱导NF-κB。

RC通过Ca²⁺/钙调磷酸酶依赖性途径引起腺泡细胞坏死。分离的原代腺泡细胞中碘化丙啶(PI)的吸收是胰腺炎期间体内腺泡受损和坏死的替代。6小时的RC暴露在PI摄取中引起浓度依赖性增长，根据它们各自的抑制剂或螯合剂，其依赖于PLC、IP3RCa²⁺释放和细胞溶质Ca²⁺上升(图9)。AR42J腺泡细胞系中观察到相似的结果(图10A)。此外，RC以两种浓度依赖性方式引起ATP水平的耗竭(图9F)。然而，FK506无法防止ATP耗竭，这表明在体外，导致ATP耗竭的线粒体病变并不需要钙调磷酸酶。

如同钙调磷酸酶抑制剂的作用，使用IKK-2抑制NF-κB移位很大程度上防止了PI摄取(图9C-9D)。钙调磷酸酶的应激响应性亚基是钙调磷酸酶A的β同种型(CnAβ)¹³。分离自CnAβ敲除小鼠的腺泡细胞防止了由于RC导致的PI摄取(图9E)。总之，这些数据表明RC通过Ca²⁺/钙调磷酸酶依和NF-κB-赖性途径诱导腺泡细胞坏死。

钙调磷酸酶的药物和基因抑制使小鼠中RC诱导的胰腺炎减弱。本实施例还检验了钙调磷酸酶是否在小鼠体内介导PEP(图11)。在导管内RC输注前1小时给予FK506(1mg/kg)的腹膜内注射，然后在手术后2.5、5.5和12小时，根据之前在小鼠中最大程度抑制钙调磷酸酶的方案给予FK506^16,38。手术后24小时测量胰腺炎后胰腺的组织学严重程度，该组织学严重程度被阻止并且血清淀粉酶降至NS伪状态的水平(图11A-11C和图10B-10C；P<0.05)。该作用与吲哚美辛的治疗性给药同样稳健，所述吲哚美辛是针对PEP通常给予的NSAID(图12)。

胰腺NF-κB的实时、动态成像是通过新型AAV6-介导的基因递送实现的，其通过将AAV6-NF-κB-荧光素酶输注到胰腺管将NF-Kb-荧光素酶递送到小鼠胰腺，如在方法中所述³⁹。与导管内接受生理盐水的假手术小鼠相比，RC输注的小鼠在手术4小时后，在胰腺的区域具有13倍峰值的NF-κB荧光素酶(图11D)。FK506处理显著地减弱了NF-κB。此外，在RC暴露期间，IL-6、GADD45B和IL-1β的表达上调(图11E)。使用FK506的预处理引起IL-6和GADD45B基因表达显著地减少，以及IL-1β减少的趋势。这些结果暗示钙调磷酸酶在体内诱导NF-κB炎症信号。相似地，CnAβ敲除小鼠具有减弱的PEP组织学严重程度，尽管相较于野生型小鼠，血清淀粉酶水平并未改变(图11F)。重要的是，PEP诱导后的钙调磷酸酶抑制剂的治疗性给药同样保护免受RC诱导的胰腺炎(图13)。总之，这些结果表明钙调磷酸酶是小鼠中胰腺NF-κB和PE的介导物。尽管钙调磷酸酶是Ca²⁺的靶标，但是其也可以通过使介导Ca²⁺体内平衡的蛋白质去磷酸化来调节Ca²⁺⁴⁰。然而，在原代腺泡细胞中，钙调磷酸酶抑制并不影响RC诱导的异常Ca²⁺信号(图14)。

6.3.讨论

当前的研究首次证明在胰腺损伤的情况下，RC暴露引起NF-κB活化并通过诱导异常的Ca²⁺信号以及活化钙调磷酸酶导致上皮细胞和器官损伤(图15)。

研发了一种新型小鼠PEP模型。之前在大型动物(如狗)中的模型使用胆胰管的内窥镜插管^41,42。通过进行腹腔手术并实现经十二指肠可及性，已经向最近小型动物模型实现了滴注RC ^22,43。当前在小鼠中的体内研究的主要益处是钙调磷酸酶敲除的使用以及钙调磷酸酶的补体药物抑制的能力。

示出的数据显示PEP是由胰腺管压力和RC暴露的组合所导致的，因为其各自叠加地使PEP结果恶化。这些发现与临床数据相一致，临床数据证明PEP可以通过插入释放导管压力的胰腺管支架以及通过在ERCP手术期间滴注最小必要剂量RC减轻^5-7,9。

本实施例主要关注RC暴露对胰腺以及胰腺腺泡细胞的主要实质细胞的影响。已知RC在高危患者中通过诱导血液动力学不稳定导致急性肾损伤，并且据称其通过生成活性氧物质(ROS)^34,44以及NF-κB的核移位³⁵对肾细胞有直接毒性作用。在腺泡细胞系中，N-乙酰半胱氨酸对NF-κB没有影响。该结果表明取决于细胞类型，RC具有不同的影响。RC已经显示将会在肾细胞中导致NF-κB活化，但是尚未确定活化的机制^45,46。当前的研究是首次证明RC通过异常的Ca²⁺信号和钙调磷酸酶活化导致NF-κB活化(图15)。体内胰腺NF-κB信号以实时、动态的方式成像，所述方式通过AAV介导的导管内基因递送将NF-κB荧光素酶进行递送。这一新型技术可以主要关注胰腺信号，避免来自所有表达NF-κB荧光素酶报告物的转基因小鼠所固有的邻近器官中荧光素酶表达的噪声。

RC暴露后不久(在1-2分钟之内)，小鼠和人腺泡细胞中都出现Ca²⁺瞬变。此外，Ca²⁺信号的形状在大多数细胞中模仿高振幅峰值平台，而这是腺泡细胞损伤和胰腺炎之前的特征性病理信号^25,26,48-53，并且其将有利于钙调磷酸酶活化⁵⁴。最近一项研究证明，使用碘佛醇(一种与我们所使用的碘海醇和碘帕醇相似的RC)的长孵育(4小时)导致NRK-52肾细胞系中基线细胞溶质Ca²⁺水平的慢性、整体增长，⁵⁵。这表明RC引起电压门控的Ca²⁺通道或导致质膜Na⁺/Ca²⁺交换体(NCX)的逆转，从而有利于Ca²⁺流入。之前关于Ca²⁺通道阻断剂在大鼠中改善了RC诱导的急性肾损伤的报道支持了该发现⁵⁶。然而，在RC诱导的胰腺损伤的情况中，NCX似乎并不是胰腺腺泡细胞的功能性组分²⁵,⁵⁷。因此，RC的腺泡细胞Ca²⁺信号不同于NRK-52E细胞系以及来自我们所测试的非胰腺细胞系中描述的微弱的Ca²⁺信号。

在包括MPTP和激酶的胰腺炎中Ca²⁺的假定靶标中，Ca²⁺-活化的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调磷酸酶被认为是腺泡损伤和胰腺炎症的关键介导物^16,38^,53^,58,⁵⁹。钙调磷酸酶是由催化亚基A(CnA)和调控亚基B(CnB)形成的二聚体^60-62。CnA具有3个亚型(α，β和γ)，而CnB具有两个亚型(B1和B2)。钙调磷酸酶是高度保守的并且普遍存在于身体的大多数细胞中，尽管其亚型存在差异性分布。胰腺腺泡细胞主要表达CnAβ和CnB1 ⁵⁹。钙调磷酸酶显示出能够介导与异常Ca²⁺相似的事件，包括腺泡内蛋白酶活化⁵⁸、NF-kB ^53,63和细胞损伤⁵⁹。在体内，钙调磷酸酶由于雨蛙素过度刺激³⁸和胆汁酸输注¹⁶介导胰腺炎。

不太可能存在碘分子对细胞或其进入(例如，通过钠碘同向转运体⁶⁴)的直接作用，因为碘溶解在妥善保藏的RC中是极少的，并且向肾细胞单独给予钠碘并不导致细胞损伤^35,65。钙调磷酸酶抑制剂在临床上作为免疫抑制剂使用，因为其抑制T细胞⁶⁶。然而，本实施例显示，腺泡细胞中的钙调磷酸酶导致腺泡病变，并且腺泡钙调磷酸酶自身可能导致体内胰腺炎。该研究为进行临床试验以检测钙调磷酸酶抑制剂在预防PEP中的作用提供了预临床原动力。更广泛的说，这也是第一次证明，在任何器官或细胞类型中，RC通过异常的Ca²⁺信号诱导NF-κB和细胞坏死，并且主要的Ca²⁺介导物是钙调磷酸酶。

7.实施例：胰腺腺泡细胞钙调磷酸酶的靶向抑制是防止ERCP后胰腺炎的新型策略

7.1.材料和方法

内镜逆行胰胆管造影(ERCP)是一种常见的胃肠道手术，经确认其将带来范围在1％至15％的急性胰腺炎风险⁷⁰。广泛接受的预防ERCP后胰腺炎(PEP)的策略，如使用直肠吲哚美辛进行预治疗⁸的功效近来受到了挑战^71,72。对PEP预防的研究需要揭示引发PEP的核心机理。通过使用衍生自分离的原代小鼠和人胰腺腺泡细胞的离体的PEP替代模型，我们证明在ERCP期间使用的常见放射性造影剂通过激活钙活化的磷酸酶钙调磷酸酶(Cn)诱导了腺泡细胞炎症信号转导和损伤⁷³。在小鼠PEP体内模型中，我们发现整体Cn敲除的小鼠(缺少CnAβ)或使用Cn抑制剂FK506或环孢菌素A(CsA)的频繁预防性剂量进行的Cn全身抑制防止了PEP。因为Cn是普遍表达的，一个未解答的关键问题是腺泡细胞Cn阻断自身是否足以在体内预防PEP。

试剂和动物。除非另外说明，全部试剂购自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)。携带loxP-侧接(“floxed”)的CnB1等位基因的小鼠(CnB1f/f；与C57BL/6品系回交)来自Gerald Crabtree博士的友情馈赠⁷⁴，而Ela-CreERT2转基因系来自Craig Logsdon博士的友情馈赠75。Lox-Stop-Lox td番茄红(tdTomato Red)报告小鼠获得自杰克逊实验室公司(Jackson Lab)⁷⁶。经基因工程改造的雄性和雌性小鼠同等的用于体内研究。将8至10周龄、体重为25g的野生型雄性和雌性Swiss Webster小鼠用于评估导管内给予FK506和CsA的效率。将所有小鼠在22℃、12小时明-暗周期中安置，并且以标准实验室饲料喂养，自由获取食物和水所用动物实验使用匹兹堡大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。

条件胰腺腺泡特异性CnB1敲除的生成。CnB1f/f小鼠与Ela-CreERT2小鼠杂交以生成纯合子Ela-CreERT2/CnB1f/f品系。为了在胰腺腺泡细胞中删除CnB1(CnB1Δ/Δ)，CreERT2/CnB1f/f小鼠每天或每隔一天接受腹腔内给予的5-6mg累积剂量的他莫昔芬，总持续时间为5-6天。在最后一次注射他莫昔芬后一周诱导PEP(图16A)。缺少Ela-CreERT2插入的CnB1f/f系作为对照，并且它们同样接受他莫昔芬。

CnB1^Δ/Δ基因分型。如所述由新鲜分离的小鼠胰腺和肝脏组织制备基因组DNA⁷⁷。简言之，将组织在冰上切碎并在含有蛋白酶K的氯化钠Tris-EDTA(STE)缓冲液中匀化。将匀浆在55℃孵育3小时并进行间歇涡旋。在蛋白酶K灭活后，匀浆在4℃离心，然后使用异丙醇对包含基因组DNA的上清液进行沉淀。沉淀的基因组DNA在4℃成团，使用70％乙醇洗涤，风干，然后溶解在200μL的1xTris-EDTA缓冲液之中，用于PCR反应。预期扩增子位置和尺寸的原理图在图17中提供。引物序列如下：

表2.引物序列

如同预期，由CnB1Δ/Δ胰腺组织扩增了168bp的片段，而在肝脏组织中可以忽略不计(图17D-17E)。同样由输注AAV6-Ela-iCre的CnB1f/f小鼠的胰腺组织中扩增了168bp的片段。PCR退火温度是61℃，并且模板量是100pg总基因组DNA。PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离并成像。将168bp的DNA条带切出、纯化并且测序。将所有序列与NCBI数据库进行比对并手动验证，从而确认CnB1缺失以及各组分(弹性蛋白酶启动子、Cre、ERT2)都在框内。

NFAT-荧光素酶活性试验：使用NFAT-荧光素酶腺病毒如之前所述感染分离的胰腺腺泡细胞¹⁶。简言之，细胞与NFAT-荧光素酶腺病毒(效价，2x 10⁹IFU)孵育30分钟，然后将其暴露于放射性造影物质6小时。在该刺激后，收集细胞，使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，使用1X裂解缓冲液(普罗麦格#E397A，威斯康星州麦迪逊)裂解，然后以12,000g在4℃离心5分钟。在Synergy H1读板器(伯腾仪器公司，佛蒙特州威努斯基)中使用荧光素酶测试系统(普洛麦格#E1483)测量上清液发光，并将通过BCA方法(赛默飞世尔科技公司，伊利诺州洛克福德)确定的总蛋白质用于标准化数据。

构建腺病毒相关病毒(AAV)6。如之前所述，通过将pEla-iCre或pCMV-ZsGreen克隆到pAAV-MCS质粒(细胞生物实验室公司(Cell Biolabs)#VPK-410；加利福尼亚州圣地亚哥)中生成AAV6质粒19,39。克隆后，将AAV6质粒以及两个辅助质粒转染至HEK293细胞中，所述两个辅助质粒是：(1)pAAV-RepCap(Applied Viromics公司；目录号0912-06；加利福尼亚州菲蒙市)，其是携带血清型6rep和cap基因的包装质粒；和(2)pHelper(Applied Viromics公司；目录号0913；加利福尼亚州菲蒙市)，其是携带辅助基因的质粒。转染72小时后收集细胞，并在含有50mM Tris、150mM NaCl和2mM MgCl2的裂解缓冲液中悬浮。

纯化AAV6用于体内给予。如之前所述对AAV6进行纯化21,39。简言之，将转染的HEK293细胞冻融3次以释放AAV6病毒。使用全能核酸酶(benzonase)(0.05单位)在37℃处理细胞裂解物30分钟，然后使用1％脱氧胆酸钠在37℃处理30分钟。裂解物以2500x g进行10分钟离心，然后回收上清液。使用1：4混合的40％聚乙二醇(PEG-800)和2.5M氯化钠在0℃对AAV6进行2小时的沉淀。溶液以2500x g进行20分钟离心，然后回收PEG团块。将团块在HEPES缓冲液(50mM)中重悬，使用等体积的100％氯仿处理，以2500x g进行10分钟离心，然后风干30分钟。使用50％硫酸铵和40％PEG-800进行二相分配，并以2500x g进行15分钟离心。收集硫酸铵相，并使用10kDa分子量截留Slide-A-Lyser透析盒(Slide-A-Lyser DialysisCassette)(赛默飞世尔科技公司#66810)进行4小时透析。重复第二次进行16小时的透析。使用50kDa离心过滤器单元(密理博公司(Millipore)#UFC905024；马萨诸塞州比尔里卡)浓缩AAV，并储存于-80℃。使用QuickTiter AAV定量试剂盒(细胞生物实验室公司#VPK-145，加利福尼亚州圣地亚哥)测量病毒浓度。

胰腺导管输注AAV6至CnB1^f/f小鼠。用于逆行胰腺导管输注AAV6的手术方法如先前所述⁷³。简言之，使用P33蠕动注射泵(哈佛设备公司(Harvard Apparatus)，马萨诸塞州霍利斯顿)，将100μl纯化的AAV6(效价2X 10¹²PFU)以10μl/分钟的速率向胆胰管输注10分钟。手术麻醉是由吸入异氟烷和氧气来实现的。手术后立即给予镇痛剂丁丙诺啡的单次注射(0.075mg/kg)。小鼠在加热垫上恢复30分钟，并在PEP诱导前饲养4-6周，自由取用水和食物。为了验证AAV6输注的效应，使用了Lox-Stop-Lox td番茄红报告小鼠。如上所述将100微升纯化的AAV6Ela-iCre(效价2X 10¹²PFU)输注到胰腺管。手术后5周，使用荧光解剖显微镜对胰腺组织以及腹部器官整体进行成像，并进行切片。

ERCP后胰腺炎的诱导。如先前所述诱导PEP⁷³。简言之，将100μl碘海醇(欧乃派克，GE医疗公司；新泽西州普林斯顿)以20μl/分钟的速率向胆胰管逆行输注5分钟。来自导管操纵(DM)组的小鼠接受以10μl/分钟的低速率向胆胰管逆行输注5分钟的50μl生理盐水。PEP诱导后24小鼠通过吸入CO₂对小鼠和后颈脱位法进行安乐死。来自伪组的小鼠仅接受腹部手术。

血清淀粉酶测量。PEP诱导后6小时通过眼球后放血收集血液。血清通过在4℃以1,500x g离心10分钟制备。按照生产商说明，使用Phadebas试剂盒(安玛西亚制药公司(Amersham Pharmacia)，新泽西州皮斯卡塔韦)测量血清淀粉酶。

胰腺组织病例学和图像分析。为了维持解剖定位，胰腺、十二指肠和脾脏被整体置于盒中(图18A)。将组织在4％多聚甲醛中以室温固定24小时。使用苏木精和伊红(HE)对石蜡包埋的切片进行染色。对10个系统选择的区域在200X放大倍数下以盲测的方式从胰腺头部开始进行分级，所述胰腺头部通过其与十二指肠的并列被识别。如所述，分级评分对水肿、炎症浸润和坏死给予相等的权重(从0至3)⁵。通过使用ImageJ软件(NIH，马里兰州贝塞斯达)进行强度阈值处理对水肿指数进行进一步客观描绘。从各载玻片选择至少5幅图像用于分析。将各图像设置成相同的颜色阈值。将实质内标记的区域标记为水肿，并将其表面面积计算成总实质区域的百分比。

免疫组化。使用莱卡Bond-Max全自动IHC和ISH染色系统(莱卡公司，利诺斯州野牛林)以半自动的方式由石蜡包埋的组织切片进行对髓过氧化物酶(MPO)的免疫组化(IHC)。用于MPO的IHC的所有产品都购自莱卡公司，包括一抗。将载玻片装载到Bond系统，并将程序设置如下：使用Bond Dewax溶液(AR9222)去石蜡化，使用乙醇脱水，与MPO(PA0491)一抗孵育15分钟，与Bond聚合物精制检测试剂盒(DS9800)孵育，该试剂盒包含包含辣根过氧化物酶(HRP)接头，淬灭内源性过氧化物酶活性的过氧化氢阻断物，无生物素系统。3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐水合物(DAB)以及用于复染的苏木精。使用Bond洗涤溶液(AR9590)或蒸馏水在进行下一步之前自动洗涤载玻片。在使用阳性和阴性对照组织的抗体的系统性优化后，发现了对于MPO的理想条件是MPO BRTU(Bond即用型)溶液，不需要预处理，15分钟抗体孵育时间，以及8分钟一抗后和8分钟DAB孵育时间。对5个系统选择的区域在50X放大倍数下以盲测的方式从胰腺头部开始进行分级。使用从0至3的评分对各区域内棕色的程度精细分级。

统计学分析。数据以平均值±SEM表达。统计学分析使用GraphPad Prism 6(LaJolla，加利福尼亚州)进行。使用未配对的T检验进行比较。P值<0.05时认为有显著性。

7.2.结果

为了在腺泡细胞中选择性删除Cn，包含关键调控亚基B1(CnB1)的floxed等位基因的小鼠系与全长腺泡特异性鼠胰腺弹性蛋白酶启动子驱动的他莫昔芬诱导的Cre系杂交75(图16A和图17)。甚至在被称为导管操纵(DM)的通过低压力生理盐水导管输注诱导的PEP温和模型中，组织学损伤在腺泡细胞特异性CnB1缺陷小鼠中存在近乎完全的减弱(CnB1Δ/Δ；图16B)。此外，在通过高压力(通过加倍的速率和体积)输注放射性造影物质模拟PEP的更为严重的损伤模型中，CnB1Δ/Δ小鼠同样具有组织学损伤的显著减弱，其相对于伪操作的阴性对照组的水平下降了75％。整个组织学评分的各参数都被减弱，包括水肿、炎症浸润(另外通过MPO染色检验)和坏死(图16C和图18)。这些发现表明腺泡细胞Cn在体内介导PEP。除了PEP轻微和中度模型，腺泡细胞特异性Cn删除还保护避免由胆汁酸牛磺胆酸盐输注诱导的急性胰腺炎的不同模型(图19)。这些结果显示了腺泡细胞Cn在介导胰腺损伤中广泛的重要性。

腺泡细胞Cn敲除的育种策略通过生成容纳增强型的Cre(iCre)⁷⁸的腺相关病毒血清型6载体(AAV6)进行补充，所述iCre被一种更短的、独立构建的鼠胰腺弹性蛋白酶启动子驱动⁷⁹(图20A和图21A)。在所有血清型中，AAV6以及AAV8提供对腺泡细胞最高的感染效率^39,80。Lox-Stop-Lox td番茄红报告小鼠中AAV6-Ela-iCre诱导的腺泡细胞荧光是主要靶向腺泡细胞的证明(图21B)。AAV6-Ela-iCre向CnB1^f/f小鼠胰腺的导管输注导致了CnB1的腺泡细胞特异性缺失，并且在从导管手术过程恢复后，由PEP诱导的胰腺损伤相对于对照水平降低了90％(图20B-20C和图21C-21F)。

在PEP诱导之前和之后通过给予多剂量的Cn抑制剂对Cn的全身抑制在之前的研究中显示出了针对PEP的保护⁷³。然而，当前通过两个遗传Cn缺失模型所发现的体内腺泡细胞Cn是PEP所必须的这一发现促使我们探求在放射性造影物质输注的同时通过给予单一、急性剂量的Cn抑制剂选择性靶向腺泡Cn细胞活性是否可以缓解PEP。这一递送少量药物的独特的区分方法还将避免抑制剂的毒性特征。FK506(1μM)和CsA(10μM)各自都易溶解在即用型碘海醇制剂中。虽然导管内FK506或CsA疗法不影响出现在DM的轻微组织学损伤，但是这一干预在PEP中度模型中分别将严重程度相对于伪水平减弱61％和37％(图22A-22B和图23A-23C)。输注6小时后，观察到血清淀粉酶高度也同样降低(图23D)。

7.3.讨论

总之，通过使用两种互补的遗传方法在体内和在两种小鼠PEP严重模型，以及胰腺炎的胆汁输注模型中删除腺泡细胞Cn，我们发现PEP和胰腺炎可以通过腺泡细胞Cn缺失在很大程度上被抑制。对于这些重要发现的平移推论是Cn抑制剂在体内针对腺泡细胞Cn的导管内递送也表现出减弱PEP。这些新发现可以解释Cn抑制剂的慢性和全身给予可能易发生胰腺炎和胰腺纤维化，而向胰腺急性并且靶向的递送保护免于胰腺炎的悖论^81,82。该研究为开展临床试验以测试包含Cn抑制剂的新型ERCP输注制剂防止PEP的功效提供了动力。

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通过引用，将本文引用的各种发表物的全部内容纳入本文。

Claims

1.一种放射性造影介质，其包括在对象中放射成像有效量的(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂，其相对于给予不具有所述钙调磷酸酶抑制剂和所述抗氧化剂的放射性造影剂，具有降低的成像后胰腺炎风险。

2.如权利要求1所述的放射性造影介质，其中，所述放射性造影剂是水溶性非离子放射性造影剂。

3.如权利要求1所述的放射性造影介质，其中，所述钙调磷酸酶抑制剂是环孢菌素。

4.如权利要求1所述的放射性造影介质，其中，所述抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸。

5.一种用于制造如权利要求1所述的放射性造影介质的试剂盒，其包括(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其中，所述放射性造影剂是水溶性非离子放射性造影剂。

7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其中，所述钙调磷酸酶抑制剂是环孢菌素。

8.如权利要求5、6或7中任一项所述的试剂盒，其中，所述抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸。

9.一种对象体内胰腺、胆囊和/或胆道系统放射成像的方法，其包括将上述包括有效量的(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂的放射性造影介质引入对象的胰腺、胆囊和/或胆道系统。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述放射性造影剂是水溶性非离子放射性造影剂。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中，所述钙调磷酸酶抑制剂是环孢菌素。

12.如权利要求9、10或11中任一项所述的方法，其中，所述抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸。

13.一种确定测试化合物能否用于降低成像后胰腺炎风险的方法，其包括(i)提供原代腺泡细胞或胰腺细胞系细胞，所述细胞中已引入编码与可检测报告物融合的NFκB的核酸，所述核酸可操作地连接炎症诱导型启动子；(ii)将所述细胞暴露于放射性造影剂和所述测试化合物，并且确定NFκB-报告物的量；和(iii)将(ii)中确定的NFκB-报告物的量与存在于对照细胞中NFκB-报告物的量比较，所述对照细胞在不含测试化合物的相当条件下暴露于放射性造影剂；如果(ii)中确定的NFκB-报告物量小于(iii)中确定的NFκB-报告物，所述测试化合物能够用于降低成像后胰腺炎的风险。

14.一种确定测试化合物能否用于降低成像后胰腺炎风险的方法，其包括(i)提供原代腺泡细胞或胰腺细胞系细胞，所述细胞中已引入编码与可检测报告物融合的NFAT的核酸，所述核酸可操作地连接炎症诱导型启动子；(ii)将所述细胞暴露于放射性造影剂和所述测试化合物，并且确定NFAT报告物的量；和(iii)将(ii)中确定的NFAT报告物的量与存在于对照细胞中NFAT报告物的量比较，所述对照细胞在不含测试化合物的相当条件下暴露于放射性造影剂；如果(ii)中确定的NFAT-报告物量小于(iii)中确定的NFAT-报告物，所述测试化合物能够用于降低成像后胰腺炎的风险。

15.一种用于权利要求14所述方法的试验系统，其包括原代细胞或胰腺细胞系细胞，所述细胞中已经引入编码与可检测报告物融合的NFκB的核酸，所述核酸可操作地连接炎症诱导型启动子。

16.一种用于权利要求14所述方法的试验系统，其包括原代细胞或胰腺细胞系细胞，其中已经引入编码与可检测报告物融合的NFAT的核酸，所述核酸可操作地连接炎症诱导型启动子。

17.一种在需要降低成像后胰腺炎风险治疗的对象中降低成像后胰腺炎风险的方法，其包括使用作为对对象的胰腺和相关结构成像的试剂的一种放射性造影介质，所述放射性造影介质包括(i)放射性造影剂；(ii)钙调磷酸酶抑制剂；和(iii)抗氧化剂，从而降低对象成像后胰腺炎的风险。