CN107889457B - 具有IgG Fc结构域的融合蛋白的稳定液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域的融合蛋白(特别是其中人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域和血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域融合的蛋白质(例如阿柏西普))的稳定液体制剂。另外，本发明涉及用于使其中IgG的Fc结构域与VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合的蛋白质稳定的组合物、以及用于使其中IgG的Fc结构域与VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合的蛋白质稳定的方法。本发明改善了由异常血管生成引起的各种眼科疾病(例如视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、脉络膜新生血管形成和湿性年龄相关性黄斑变性等)的治疗效果，同时通过适用于玻璃体内注射包含阿柏西普的抗VEGF‑Fc融合蛋白的稳定液体制剂来追求生物活性的稳定。

Description

具有IgG Fc结构域的融合蛋白的稳定液体制剂
技术领域
本发明涉及具有人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域的融合蛋白的稳定液体制剂。更具体地，本发明涉及一种液体制剂，其具有稳定的蛋白质(其中人IgG的Fc结构域和血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域融合)，例如阿柏西普，涉及用于使其中IgG的Fc结构域和VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合的蛋白质稳定的组合物，以及涉及使其中IgG的Fc结构域和VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合的蛋白质稳定的方法。
背景技术
已经鉴定了一类对血管内皮细胞具有选择性的诱导细胞的二聚体促分裂原，并称为血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是增加血管生成和血管通透性的重要因素。
已知VEGF激活作为跨膜酪氨酸激酶受体的VEGF受体(即VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)。在VEGF受体中，VEGFR-1和VEGFR-2在细胞外结构域中依次具有7个Ig样序列、单个跨膜区域和共有的酪氨酸激酶区域以结合VEGF。这些特征应用为抗VEGF剂的序列。作为眼科治疗剂的阿柏西普(Aflibercept)是约115kDa的可溶性诱饵受体(包括糖基化)，其具有其中VEGFR-1的第二结合结构域和VEGFR-2的第三结合结构域与人IgG1的Fc区域融合的结构(参见[Drug Design Development and Therapy(2013),3(7),711-722])。
在通过VEGF的机制中，异常的血管生成与眼科疾病例如湿性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿和视网膜静脉阻塞中的黄斑水肿等有关(参见[J.KoreanMed.Assoc.(2014),57(7),614-623])。
用于这些眼科疾病的治疗剂的实例包括哌加他尼(商品名：Macugen)、雷珠单抗(商品名：Lucentis)、贝伐单抗(商品名：Avastin)和阿柏西普(商品名：Eylea)。2011年已批准阿柏西普用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性(参见[Biol.Ther.(2012),2(3)1-22]和[Drug Design Development and Therapy(2013),3(7),711-722]等)。在上述治疗剂中，已报到阿柏西普对具有提前弱视的糖尿病性黄斑水肿患者具有最好的治疗效果(参见[NEJM(2015),372(13)1193-1203])。阿柏西普已商品化为对转移性结直肠癌的治疗剂(商品名：Zaltrap)和对视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、脉络膜新生血管化和湿性年龄相关性黄斑变性的治疗剂(商品名：Eylea)。
在非最佳条件下，包括抗体药物的蛋白质药物中发生物理化学修饰。特别地，诸如温度、pH值、盐浓度、与空气接触、蛋白质浓度和缓冲剂类型等因素显著影响蛋白质的氧化、脱酰胺、异构化和聚合。这些修饰引起聚集，并产生蛋白质的片段、异构体，使得可能降低生物活性。这些性质在蛋白质中不同。特别地，对于Fc融合蛋白，由于折叠问题，在疏水相互作用色谱中出现单独的3个峰(参见[Antibodies(2013),2,452-500])。
以下的现有专利文献1(国际公开WO2007/149334)公开了“包含1-100mg/ml的阿柏西普、0.01-5％的有机共溶剂(例如聚山梨酯、聚乙二醇、丙二醇等)、30-150mM的等渗剂(例如NaCl、KCl等)、5-40mM的磷酸钠缓冲剂和1.0-7.5％的稳定剂(例如蔗糖、山梨醇、甘油、海藻糖和甘露醇等)的眼科制剂”和“包含5-50mg/ml的阿柏西普、5-25mM的磷酸钠缓冲剂、0.01-0.15％的有机共溶剂、1-10％的稳定剂和20-150mM的等渗剂的可冻干制剂”。在下面现有专利文献1中公开的制剂可以应用于适于玻璃体内施用的预填充注射器。
对于在下面现有专利文献1中公开的眼科制剂和可冻干制剂，报道了抑制由于阿柏西普的聚集、断裂和异构化而产生杂质和副产物的效果。但是，现有专利文献1中的制剂存在如下问题：在苛刻条件例如40℃以上的高温条件或振荡条件下，稳定阿柏西普的效果显著降低。
因此，本发明人通过开发液体制剂而完成了本发明，该液体制剂在苛刻条件下具有增强的稳定性，并且在长时间的贮存条件下稳定地保持具有IgG Fc结构域例如阿柏西普的融合蛋白。
[现有技术文献]
[专利文献]
现有专利文献1：国际公开WO 2007/149334
发明内容
技术问题
本发明是为了解决上述问题而提出的，提供一种具有稳定的蛋白质的制剂，该蛋白质中人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域和血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域融合。
本发明的另一个目的是提供一种用于稳定蛋白质的组合物，该蛋白质中IgG的Fc结构域和VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合。
本发明的另一个目的是提供一种液体制剂，其包含：用于稳定蛋白质的组合物，该蛋白质中IgG的Fc结构域和VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合；和阿柏西普。
问题的解决方案
本发明提供一种液体制剂，其包含：蛋白质，其中血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域和人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域融合；以及缓冲剂，其包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH值。
根据本发明的优选实施方式，VEGF受体的可溶性细胞外结构域可以包括第一VEGF受体的免疫球蛋白样结构域2和第二VEGF受体的免疫球蛋白样结构域3。
根据本发明的另一个优选实施方式，融合蛋白可以以10至40mg/ml的量存在。
根据本发明的又一个优选实施方式，组氨酸盐可以是组氨酸-HCl或组氨酸-乙酸盐。
根据本发明的另一个优选实施方式，其中组氨酸盐的浓度可以是10mM至50mM。
根据本发明的又一个优选实施方式，液体制剂还可以包含选自由糖和表面活性剂组成的组中的一种或多种稳定剂。
根据本发明的另一个优选实施方式，糖可以是选自由2.5％至10％的蔗糖、海藻糖、甘露醇和葡萄糖组成的组中的至少一种。
根据本发明的又一个优选实施方式，糖可以是5％至10％的蔗糖。
根据本发明的另一个优选的实施方式，表面活性剂可以是0％至0.03％的聚山梨酯20或聚山梨酯80，例如0％或0.01％至0.03％。
此外，本发明提供一种用于稳定蛋白质的组合物，该蛋白质中VEGF受体的可溶性细胞外结构域和IgG的Fc结构域融合，所述组合物包括：包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH值的缓冲剂；以及选自由糖和表面活性剂组成的组中的一种或多种稳定剂，其中，组氨酸盐为10mM至50mM的组氨酸-HCl或组氨酸-乙酸盐；糖为选自由2.5％至10％的蔗糖、海藻糖、甘露醇和葡萄糖组成的组中的至少一种；并且表面活性剂为0％至0.03％的聚山梨酯20或聚山梨酯80，例如0％或0.01％至0.03％。
此外，本发明提供一种用于稳定蛋白质的方法，其中通过使用包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH值的缓冲剂来使人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域和血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域融合。
根据本发明的优选实施方式，缓冲剂还可以包含选自由糖和表面活性剂组成的组中的一种或多种稳定剂。
此外，本发明提供了一种液体制剂，其包括：包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH值的缓冲剂；选自由糖和表面活性剂组成的组中的一种或多种稳定剂；以及阿柏西普；其中组氨酸盐为10mM至50mM的组氨酸-HCl或组氨酸-乙酸盐，糖为选自由2.5％至10％的蔗糖、海藻糖、甘露醇和葡萄糖组成的组中的至少一种，并且表面活性剂为0％至0.03％的聚山梨酯20或聚山梨酯80，例如0％或0.01％至0.03％。
根据本发明的优选实施方式，液体制剂可适用于玻璃体内注射。
本发明的有益效果
在由本发明提供的液体制剂中，起因于具有人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域的融合蛋白(特别是其中人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域和血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域融合的蛋白质(例如阿柏西普))在诸如40℃以上的高温条件或振荡条件的苛刻条件下以及一般储存条件下的聚集、断裂和异构化的杂质和副产物的产生显著减少，因此可以提高长期储存的稳定性。
而且，本发明改善了对由异常血管生成引起的各种眼科疾病(例如视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、脉络膜新生血管形成和湿性年龄相关性黄斑变性等)的治疗效果，同时通过适于玻璃体内注射包含阿柏西普的抗-VEGF-Fc融合蛋白的稳定液体制剂来追求生物活性的稳定。
附图说明
图1是通过改变包含阿柏西普的组氨酸盐缓冲剂的pH值来测量在40℃下储存7天的样品的片段和聚集体含量的变化的图。
图2是通过改变包含阿柏西普的组氨酸盐缓冲剂的pH值来测量在40℃下储存7天的样品的疏水相互作用高效液相色谱(HI-HPLC)中的峰1、2和3含量(％)的变化的图。
图3显示了在40℃下储存21天后包含阿柏西普的各种缓冲剂(磷酸钠、琥珀酸盐、组氨酸-HCl、组氨酸-乙酸盐和乙酸钠)的SDS-PAGE分析结果。
图4显示了在50℃下储存8天后在包含阿柏西普的组氨酸盐缓冲剂中包含各种糖(海藻糖、蔗糖、甘露醇和葡萄糖)的制剂的SDS-PAGE分析结果。
图5是通过改变包含阿柏西普的组氨酸盐缓冲剂中的蔗糖浓度来测量在45℃下储存7天的样品的片段和聚集体含量(％)的变化的图。
图6是测量在45℃下储存7天的样品的片段和聚集体含量(％)的变化的图，其中样品是在包含阿柏西普的组氨酸盐缓冲剂中包含各种盐(氯化钠、氯化铵、硫酸铵和氯化钾)的制剂。
图7显示包含阿柏西普的组氨酸盐缓冲剂的制剂在含或不含聚山梨酯时的SDS-PAGE结果，其中制剂在25℃下以200rpm振荡地储存7天。
图8是测量在45℃下储存7天的样品的片段和聚集体含量(％)的变化的图，其中样品是在包含阿柏西普的组氨酸盐缓冲剂中包含各种浓度的聚山梨酯20(0％、0.01％、0.03％、0.05％和0.1％)的制剂。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本发明。
如上所述，其中使诸如具有IgG Fc结构域的阿柏西普的融合蛋白稳定的先前提供的制剂的问题在于，在苛刻条件下稳定性显著降低，因此需要开发能够在除了一般储存条件之外的苛刻条件下保持融合蛋白的制剂。
因此，本发明已发现通过提供一种液体制剂来解决上述问题的方案，所述液体制剂包括：蛋白质，其中人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域和血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域融合；以及包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH值的缓冲剂。由于本发明的液体制剂在一般储存条件下长时间稳定地保持融合蛋白，并且在苛刻条件下也显著减少杂质和副产物的产生，所以能够提供在不能提供最佳贮存条件的不可避免条件下相对于已知的融合蛋白制剂具有显著改善的稳定性的制剂。
本发明提供一种液体制剂，其包含：蛋白质，其中人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域和血管内皮生长因子(VEGF)的可溶性细胞外结构域融合；以及包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH值的缓冲剂。
在作为液体制剂的活性成分的融合蛋白中，VEGF的可溶性细胞外结构域可以包括第一VEGF受体的免疫球蛋白样结构域2和第二VEGF受体的免疫球蛋白样结构域3，人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，优选IgG1的Fc结构域。Fc区包括中枢-CH1-CH2-CH3，并且CH1可以被删除。
在本发明的液体制剂中，融合蛋白的含量可以为约10-100mg/ml，优选约10-80mg/ml，更优选约10-40mg/ml。
在根据本发明的液体制剂中，“缓冲剂”是指由于缓冲剂的酸碱共轭成分的作用而经历pH值变化的缓冲溶液。在本发明的一个实施方式中，使用包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH值的缓冲剂，其中组氨酸盐优选为组氨酸-HCl或组氨酸-乙酸盐，并且组氨酸盐浓度可以为10mM至50mM。
如图1和2中所示，对于使用具有5.7至6.2的pH值的组氨酸盐缓冲剂的制剂，与对照制剂(2)相比，抑制片段和聚集体产生的效果显著增加。具体而言，制剂在pH 6.0下的稳定性是最优异的。
当缓冲剂的pH降低到小于5.7时，如图1和2中所示，制剂的稳定性显著降低。对于高于6.5的pH，可能发生由目标蛋白质的破坏或聚集引起的杂质增加的问题。
此外，如图3中所示，已经发现当在各种缓冲条件下使用组氨酸-HCl或组氨酸-乙酸盐缓冲剂时，抑制杂质和聚集体产生的效果是最优异的。
此外，图5的制剂(3)是测定具有pH 6.0的10mM组氨酸盐缓冲剂中的阿柏西普的稳定性，并且已经发现在缓冲条件下保持与对照制剂(2)相似的阿柏西普稳定性。
除了作为液体制剂的活性成分的融合蛋白和组氨酸盐缓冲剂之外，本发明的液体制剂还可以包含选自由糖和表面活性剂组成的组中的一种或多种稳定剂。
在本发明的液体制剂中，糖是选自由海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、乳糖、木糖醇、肌醇、甘油和羟丙基环糊精组成的组中的任一种，并且优选选自由海藻糖、蔗糖、甘露醇和葡萄糖组成的组中的任一种。糖浓度可以是2.5-10％(w/v)。
如图4中所示，在组氨酸盐缓冲剂中分别含有海藻糖、蔗糖、甘露醇和葡萄糖的所有制剂(3)至(6)与对照制剂(2)相比，显示出提高的阿柏西普稳定性。特别是在糖为蔗糖的情况下，阿柏西普稳定性最优异。
此外，如图5中所示，不含蔗糖的制剂(3)表现出与对照制剂(2)相似的制剂稳定性。随着蔗糖浓度增加，抑制聚集体和杂质产生的效果相对于对照(2)增加。
在本发明的液体制剂中，表面活性剂可用于眼部药物递送。表面活性剂的类型不受限制，并且包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性离子表面活性剂等。表面活性剂浓度可以为约0-0.3％(w/v)，例如0％或0.01％至0.03％。
阴离子表面活性剂的实例可以包括硫酸盐、磺酸盐、磷酸盐和羧酸盐，但不限于此。
阳离子表面活性剂的实例可以包括奥替尼啶二盐酸盐、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、十六烷基氯化吡啶鎓(CPC)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、二甲基二(十八烷基)氯化铵、西曲溴铵、双十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)等。
非离子表面活性剂的实例可以包括聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧丙烯二醇烷基醚、聚氧乙烯二醇辛基酚醚(例如Triton X-100等)、聚氧乙烯二醇烷基酚醚、甘油烷基酯、聚氧乙烯二醇山梨糖醇酐烷基酯(例如聚山梨酯20、聚山梨酯80等)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、十二烷基二甲基氧化胺、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、聚乙氧基牛脂胺(POEA)等。
两性离子表面活性剂的实例可以包括CHAPS(3-[(3-椰油酰氨基丙基)二甲基氨基]-1-丙烷硫酸盐)、椰油酰氨丙基羟基磺基甜菜碱等。
此外，作为表面活性剂，可以使用烷基硫酸盐例如月桂基硫酸铵、月桂基硫酸钠(SLS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基醚硫酸钠(SLES)、硫酸氢钠；多库酯例如钠磺基琥珀酸二辛酯、全氟辛磺酸盐(PFOS)、全氟丁磺酸盐、直链烷基苯磺酸盐(LAB)；磷脂例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱；以及鞘磷脂。
在本发明的一个实施方式中，为了根据是否加入除上述液体制剂中包含的成分之外的附加盐成分来评价制剂的稳定性，制备分别包含各种盐的制剂和不含盐的制剂。因此，如图6中所示，已经观察到抑制杂质和聚集体产生的效果在没有附加盐成分的制剂中是最优异的。
根据本发明的液体制剂在一般储存条件下长时间保持融合蛋白的稳定性，并且在苛刻条件下具有抑制融合蛋白的杂质和副产物产生的优异效果，因此融合蛋白的稳定性比典型的液体制剂更强。在此，术语“苛刻条件”是指在化学和物理上不利于融合蛋白的环境，并导致不可接受的蛋白质稳定性。苛刻条件包括例如高温或振荡条件。
在此，术语“稳定的”表示蛋白质在储存期间基本上保持其物理和/或化学稳定性和/或生物学活性。本领域中可利用用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术。可以在选定的温度和选定的时间段测量稳定性。
在用肉眼观察颜色和/或透明度、UV光散射测量(即测量到显著的聚集体)或尺寸排除色谱(SEC)测量期间，当蛋白质的聚集、沉淀和/或修饰显示较少或没有变化时，可以认为蛋白质“保持其物理稳定性”。
如图1至图6和图8中所示，本发明的各种条件的液体制剂与对照制剂(2)相比显示出显著抑制的杂质和聚集体的产生，从而在40至50℃的温度范围内相对稳定7至21天。
将本发明的各种条件的液体制剂在25℃下在以200rpm振荡下保存7天，然后对各制剂进行SE-HPLC和HI-HPLC。结果无论是否存在聚山梨酯20，聚集体和修饰的产生都受到抑制。类似地，在SDS-PAGE(非还原)(图7)和SE-HPLC结果中，已经观察到聚集体和蛋白质片段的产生被抑制得比对照(1)的多，不论是否在25℃下振荡条件下存在聚山梨酯7天。特别地，对于不含聚山梨酯的制剂，抑制聚集体和蛋白质片段产生的效果略好。
本发明提供通过使用包含组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH的缓冲剂从而使其中人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域和血管内皮生长因子VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合的蛋白质稳定的方法。
由于关于缓冲剂和融合蛋白的特征的描述与上述相同，所以为了避免本说明书的过度复杂化，不对重叠内容进行描述。
在稳定本发明的融合蛋白的方法中，缓冲剂还可以包含选自由糖和表面活性剂组成的组中的一种或多种稳定剂。
由于关于另外添加的糖和表面活性剂的描述与上述相同，因此不描述这些特征。
本发明还提供用于稳定融合蛋白的组合物，该融合蛋白中IgG的Fc结构域和VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合，所述组合物包含：包括组氨酸盐并且具有5.7至6.2的pH的缓冲剂；以及选自由糖和表面活性剂组成的组中的一种或多种稳定剂，其中组氨酸盐为10mM至50mM组氨酸-HCl或组氨酸乙酸盐；糖为选自由2.5％～10％的蔗糖、海藻糖、甘露醇和葡萄糖组成的组中的任一种；并且表面活性剂是选自0％至0.03％的聚山梨酯20或聚山梨酯80组成的组中的任一种，例如0％或0.01％至0.03％。
关于稳定组合物的特征的描述与上述相同，因此为了避免本说明书的过度复杂化，没有描述重叠内容。
本发明还提供一种液体制剂，其包含：用于稳定蛋白质的组合物，该蛋白质中IgG的Fc结构域和VEGF受体的可溶性细胞外结构域融合；和阿伯西普。
只要能够用阿柏西普治疗来治疗疾病，液体制剂可以用于医学用途以用于预防或治疗各种疾病而没有限制。优选地，所述制剂可用于治疗或预防各种眼科疾病，例如视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、脉络膜新生血管形成和湿性年龄相关性黄斑变性等。
根据本发明的液体制剂还可以包含药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂等。
药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。
除了上述成分之外，本发明的液体制剂还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences(第19版，1995)中具体描述。
本发明的液体制剂可以根据目的以各种途径施用。该制剂优选通过玻璃体内注射施用以治疗眼科疾病。而且，该制剂可以被施加到适用于玻璃体内注射的预填充注射器。
本发明的液体制剂的合适给药量可以根据诸如制剂方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别和疾病状态、食物、给药时间、给药途径、排泄速率和反应灵敏度等因素而变化。具有普通技能的医生可以容易地确定和规定对于期望的治疗或预防有效的给药量。
应该理解的是，本发明的范围不限于以下实施例，说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员(“本领域技术人员”)通常所理解的相同的含义。
实施例
[实施例1]
评估制剂的最佳pH条件
在实施例1和接下来的实施例2至5中，将现有技术文献国际公开WO2007/149334中公开的液体制剂在5±3℃下保存，并用作对照(1)。另外，对照(1)经受苛刻条件(40℃以上的温度)并用作对照(2)。然后，将制剂的稳定性与本发明的各种形式的液体制剂的稳定性进行比较。
在本实施例中，为了鉴定含有阿柏西普(其为抗VEGF-Fc融合蛋白)作为活性成分的液体制剂的最佳pH，如下所述基于组氨酸盐缓冲剂制备每种pH的样品。
具体而言，将最终的阿柏西普浓度调整为40mg/ml，将(1)具有10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在5±3℃下存储的制剂)；(2)具有10mM磷酸钠，pH 6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在40℃下储存的制剂)，以及具有10％海藻糖，0.01％(w/v)聚山梨酯20且分别具有(3)5.5；(4)5.7；(5)6.0；(6)6.2；和(7)6.5的pH的10mM组氨酸-HCl缓冲剂的制剂在40℃下储存7天。然后，通过尺寸排除高效液相色谱(SE-HPLC)和HI-HPLC分析随时间推移产生的杂质。
在SE-HPLC分析中，使用TSK-gel G3000SWXL(7.8×300mm)柱(TOSOH Co.,Japan)，并且以0.5ml/min的流速使用0.2M磷酸钾(pH 6.2)，0.25M KCl和0.05％(w/v)NaN3缓冲剂。在280nm的吸光度下分析抗-VEGF-Fc融合蛋白的峰。
在40℃下储存7天的样品的SE-HPLC分析中，计算单体含量，以及合并并计算作为高分子量杂质的聚集体和作为低分子量杂质的片段。图1显示了在第7天的SE-HPLC结果。这表明，当与对照(2)比较时，本发明的制剂在pH 5.7、6.0、6.2和6.5显示显著减少的聚集体和片段产生，因此制剂稳定。此外，在各种pH条件下，已经确定制剂的稳定性在pH 6.0时最高。
在HI-HPLC分析中，使用TSK Phenyl-5PW(7.5×300mm)柱。作为流动相，使用50mM磷酸钠(pH7.0)。使用2M NaCl、50mM磷酸钠(pH7.0)和30％(v/v)乙腈缓冲剂并使其以0％-90％的浓度梯度流动。然后，在220nm的吸光度下分析抗VEGF-Fc融合蛋白的峰。在HI-HPLC分析期间，出现三个主峰，即峰1、峰2和峰3。当峰变化较小时，认为是稳定的。
图2显示了在40℃下储存的样品经过一段时间后的HI-HPLC分析的结果。图2显示在各条件下的峰1、峰2和峰3的变化，并且已经发现，当与对照(2)比较时，本发明的制剂在pH 5.7、6.0、6.2和6.5条件下显示明显较少的峰变化。另外，在各种其它pH条件下，制剂在pH 6.0条件下相对最稳定。
[实施例2]
评估制剂的最佳缓冲条件
在本实施例中，为了鉴定含有阿柏西普(其为抗VEGF-Fc融合蛋白)作为活性成分的液体制剂的最佳缓冲剂条件，如下制备样品。
具体而言，将最终的阿柏西普浓度调整为40mg/ml，将(1)具有10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(保存于5±3℃的制剂)；(2)具有10mM磷酸钠，pH 6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在40℃储存的制剂)，以及分别在(3)10mM磷酸钠，pH 6.0；(4)10mM组氨酸-HCl，pH 6.0；(5)10mM组氨酸-乙酸盐，pH6.0；(6)10mM琥珀酸盐，pH 6.0；和(7)10mM乙酸钠，pH5.6的缓冲剂中包含0.01％聚山梨酯20和2.5％蔗糖的各种制剂在40℃下储存21天。然后，与实施例1相同，通过SE-HPLC和HI-HPLC随着时间的经过分析单体、聚集体和变体。
此后，进行SDS-PAGE分析。向稀释至1mg/ml的20.0μl分析样品中加入5.0μl 5X样品缓冲剂(还原或非还原)，并将所得物在100℃下反应5分钟并用于分析。每孔装载12.5μl的最终分析样品。作为标记(M)，使用DokDo-MarkTM蛋白标记，并以每孔3μl加样。进行10％SDS-PAGE(还原)和6％SDS-PAGE(非还原)凝胶电泳。然后用考马斯蓝进行染色。进行脱色直到清晰的条带出现。
作为SDS-PAGE(非还原)(图3)以及SE-HPLC和HI-HPLC分析的结果，已经发现当与对照(2)比较时，本发明的10mM组氨酸-HCl和10mM组氨酸-乙酸盐的制剂显著抑制聚集体和杂质的产生。
[实施例3]
评估制剂的最佳糖条件
在本实施例中，为了鉴定含有阿柏西普(其为抗VEGF-Fc融合蛋白)作为活性成分的液体制剂的最佳糖，如下制备样品。
具体而言，将最终的阿柏西普浓度调整为40mg/ml，将(1)具有10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在5±3℃下储存的制剂)；(2)具有10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在50℃储存的制剂)，以及分别在具有0.01％聚山梨酯20的10mM组氨酸-乙酸盐缓冲剂(pH 6.0)中包含(3)2.5％海藻糖；(4)2.5％蔗糖；(5)2.5％甘露醇；和(6)2.5％葡萄糖的制剂在50℃下储存8天。然后，与实施例1和2相同，通过SDS-PAGE(还原、非还原)、SE-HPLC和HI-HPLC分析随着时间推移产生的单体、聚集体和变体。
作为SDS-PAGE(还原、非还原)分析(图4)以及SE-HPLC和HI-HPLC分析的结果，与对照(2)相比时，分别包括海藻糖、蔗糖、甘露醇和葡萄糖的本发明的所有制剂显著抑制了聚集体和杂质的产生。特别是在含有蔗糖的制剂中，抑制杂质和聚集体产生的效果最优异。
[实施例4]
评估制剂的最佳糖浓度
在本实施例中，为了鉴定含有阿柏西普(其为抗VEGF-Fc融合蛋白)作为活性成分的液体制剂的最佳糖浓度，如下制备样品。
具体而言，将最终的阿柏西普浓度调整为40mg/ml，将(1)具有10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在5±3℃下存储的制剂)；(2)具有10mM磷酸钠，pH 6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在45℃储存的制剂)，以及分别在具有0.01％聚山梨酯20的10mM组氨酸-乙酸盐缓冲剂(pH 6.0)中包含(3)0％；(4)2.5％；(5)5％；和(6)10％不同浓度的蔗糖的制剂在45℃下储存7天。然后，与实施例1和2相同，通过SDS-PAGE(还原、非还原)、SE-HPLC和HI-HPLC分析随着时间推移产生的单体、聚集体和变体。
在SE-HPLC分析结果中，已经发现本发明的不含蔗糖的制剂(3)显示出与对照(2)类似的制剂稳定性，并且随着本发明的每种制剂中蔗糖浓度增加，相对于对照(2)，抑制聚集体和杂质产生的效果增加(图5)。
[实施例5]
评估添加盐条件
在本实施例中，为了鉴定最适合于含有阿柏西普(其为抗VEGF-Fc融合蛋白)作为活性成分的液体制剂的附加盐成分，如下制备样品。
具体而言，将最终的阿柏西普浓度调整为40mg/ml，将(1)具有10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在5±3℃存储的制剂)，(2)具有10mM磷酸钠，pH 6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在45℃储存的制剂)，以及分别在具有0.01％聚山梨酯20的10mM组氨酸-乙酸盐缓冲剂(pH 6.0)中包含(3)没有盐，(4)40mM氯化钠，(5)40mM氯化铵；(6)40mM硫酸铵；和(7)40mM氯化钾的制剂在45℃下储存7天。然后，与实施例1和2相同，通过SDS-PAGE(还原、非还原)、SE-HPLC和HI-HPLC分析来分析随着时间推移产生的单体、聚集体和变体。
作为SDS-PAGE和SE-HPLC(图6)分析的结果，已经观察到，当与对照(2)比较时，本发明的没有附加盐成分的制剂(3)显示出最优异的抑制杂质和聚集体产生的效果。
[实施例6]
在振荡条件下根据是否存在表面活性剂评估稳定性
在本实施例中，如下制备样品，以便根据在振荡期间存在和不存在聚山梨酯20和蔗糖浓度来评估制剂的稳定性，其中所述液体制剂基于组氨酸-HCl缓冲剂并且包含阿柏西普(其为抗VEGF-Fc融合蛋白)作为活性成分。
具体而言，将最终的阿柏西普浓度调整至40mg/ml，将具有(1)10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20；(2)10mM组氨酸乙酸盐，pH 6.0，10％蔗糖；(3)10mM组氨酸-HCl，pH 6.0，7.5％蔗糖；(4)10mM组氨酸-HCl，pH 6.0，5％蔗糖，0.01％聚山梨酯20；(5)10mM组氨酸-HCl，pH6.0，7.5％蔗糖，0.01％聚山梨酯20；(6)10mM组氨酸-HCl，pH 6.0；10％蔗糖，0.01％聚山梨酯20的制剂分别在5±3℃或25℃下储存7天，同时通过定轨振荡器以200rpm振荡。
(1)中描述的制剂对应于现有专利文献1即国际公布WO 2007/149334中公开的制剂。(2)中描述的条件用作组氨酸盐缓冲剂中的变化的对照。
如SE-HPLC和HI-HPLC分析结果中所示，已经发现，无论是否存在聚山梨酯，在25℃下振荡储存7天的制剂与对照(1)相比显示出聚集体和变体的产生受到抑制。在SDS-PAGE(非还原)(图7)和SE-HPLC结果中，已经观察到，无论聚山梨酯是否存在，在25℃下振荡储存7天的制剂与对照(1)相比也显示出聚集体和变体的产生受到抑制。特别是没有聚山梨酯的制剂的抑制蛋白质片段和聚集体产生的效果略好。
[实施例7]
评估制剂的最佳聚山梨酯20浓度
在本实施例中，为了鉴定含有阿柏西普(其为抗VEGF-Fc融合蛋白)作为活性成分的液体制剂的最佳聚山梨酯20浓度，如下制备样品。
具体而言，将最终的阿柏西普浓度调整为40mg/ml，将(1)具有10mM磷酸钠，pH6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在5±3℃下存储的制剂)；(2)具有10mM磷酸钠，pH 6.2，5％蔗糖，40mM NaCl，0.03％聚山梨酯20的制剂(在45℃下储存的制剂)，以及分别在10mM组氨酸乙酸盐缓冲剂(pH 6.0)中包含10％蔗糖和(3)0％；(4)0.01％；(5)0.03％；(6)0.05％；和(7)0.1％不同浓度的聚山梨酯20的制剂在45℃下储存7天。然后，与实施例1和2相同，通过SDS-PAGE(还原、非还原)、SE-HPLC和HI-HPLC分析随着时间推移产生的单体、聚集体和变体。
在SE-HPLC分析结果中发现，本发明的没有聚山梨酯20的制剂(3)和具有聚山梨酯20的制剂(4)、(5)、(6)和(7)相比于对照制剂(2)具有优异的抑制聚集体和杂质产生的效果(图8)。
因此，通过实施例1至7，已经发现，与现有专利中的制剂相比，本发明的液体制剂的各种条件大大地抑制了断裂和聚集。
通过制剂稳定性试验发现，本发明的液体制剂具有抑制由具有IgG Fc结构域的融合蛋白的聚集、断裂和异构化引起的杂质和副产物产生的优异效果，因此融合蛋白能够长期稳定保存，并且在苛刻条件下也能够提供稳定性。
以上详细描述了本发明的特定特征。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，具体描述仅仅是优选实施方式，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同限定。

Claims (5)

1.一种液体制剂，其包含：
10至100mg/ml的蛋白质，其中血管内皮生长因子(VEGF)受体的可溶性细胞外结构域和人免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域融合；以及
缓冲剂，其包含组氨酸盐并且具有5.7至6.5的pH值；
糖，其选自由2.5％至10％的蔗糖、海藻糖、甘露醇和葡萄糖组成的组；以及
表面活性剂，其选自由0％至0.1％的聚山梨酯20和聚山梨酯80组成的组，
其中，所述VEGF受体的可溶性细胞外结构域包括第一VEGF受体的免疫球蛋白样结构域2和第二VEGF受体的免疫球蛋白样结构域3，并且所述组氨酸盐是10mM至50mM的组氨酸-HCl或组氨酸-乙酸盐，其中所述液体制剂不包含附加盐。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述糖是5％至10％的蔗糖。
3.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述表面活性剂是0％至0.03％的聚山梨酯20或聚山梨酯80。
4.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述蛋白质为阿柏西普。
5.根据权利要求4所述的液体制剂，其中所述液体制剂适用于玻璃体内注射。
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