KR20220130053A - IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 안정한 액상 제제 - Google Patents

IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 안정한 액상 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인을 가지는 융합 단백질[특히, 혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질(예컨대, 아플리버셉트)]의 안정한 액상 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한, VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질의 안정화용 조성물 및 VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 아플리버셉트(Aflibercept)를 비롯한 항-VEGF-Fc 융합 단백질의 유리체내 주사에 적당한 안정한 액상 제제를 통해 생리 활성의 안정화를 도모하면서 비정상적인 혈관생성에 의한 각종 안과 질환(예: 망막 정맥 폐쇄, 당뇨병성 황반 부종, 맥락막 혈관신생, 습성 연령-관련 황반 변성 등)의 치료 효과를 개선할 수 있다.

Description

IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 안정한 액상 제제 {A stable liquid formulation of fusion protein with IgG Fc domain}
본 발명은 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 안정한 액상 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈관 내피세포 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질, 예를 들어, 아플리버셉트(Aflibercept)가 안정화된 액상 제제, VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질의 안정화용 조성물 및 VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질을 안정화시키는 방법에 관한 것이다.
혈관 내피세포에 대한 선택성을 가지는 세포-유도 이량체 미토겐의 유형이 확인되었고, 이를 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)로 명명한다. VEGF는 혈관 신생과 혈관 투과성을 증가시키는 중요한 인자이다.
VEGF는 막-확장 티로신 키나제 수용체(membrane-spanning tyrosine kinase receptor)인 VEGF 수용체(VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3)를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. VEGF 수용체 중에서 VEGFR-1과 VEGFR-2는 VEGF 결합을 위해 세포외 영역에 7개의 Ig-유사 서열, 단일 막횡단 영역, 컨센서스(consensus) 티로신 키나제 영역을 가진다. 이러한 특성은 VEGF 길항제(anti-VEGF agent)를 위한 서열로 사용되며, 안과적 치료제인 아플리버셉트는 VEGFR-1의 두번째 결합 도메인과 VEGFR-2의 세번째 결합 도메인이 인간 IgG1의 Fc 영역과 결합되어 있는 구조로 약 115 kDa(글리코실화 포함)의 가용성 미끼 수용체(soluble decoy receptor)이다(문헌[Drug Design Development and Therapy (2013), 3(7), 711-722]) 참조).
VEGF를 통한 기전에서 비정상적인 혈관 신생은 안과적 질환인 습성 연령-관련 황반 변성(wet age-related macular degeneration), 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema), 망막 정맥 폐쇄-황반 부종(macular edema in retinal vein occlusion) 등과 연관되어 있다(문헌[J. Korean Med. Assoc. (2014), 57(7), 614-623] 참조).
이러한 안과적 질환에 대한 치료제로는 Pegaptanib(상표명: Macugen), Ranibizumab(상표명: Lucentis), Bevacizumab(상표명: Avastin), Aflibercept(상표명: Eylea)가 있는데, Aflibercept는 2011년에 습성 연령-관련 황반 변성의 치료제로 승인되었다(문헌[Biol. Ther. (2012), 2(3) 1-22], 문헌[Drug Design Development and Therapy (2013), 3(7), 711-722] 등 참조). 상기 치료제 중에서 Aflibercept가 시력 저하가 상당히 진행된 당뇨병성 황반 부종 환자에 대해 치료 효가장 우수한 것으로 보고된 바 있다(문헌[NEJM (2015), 372(13) 1193-1203] 참조). 아플리버셉트 (Aflibercept)는 전이성 결장직장 암(metastatic colorectal cancer) 등의 치료제 [상표명: 잘트랩(Zaltrap)]와 망막 정맥 폐쇄, 당뇨병성 황반 부종, 맥락막 혈관신생 (choroidal neovascularization), 습성 연령-관련 황반 변성 등의 치료제[상표명: 아일리아(Eylea)]로 시판되었다.
항체 의약품을 포함한 단백질 의약품은 최적의 조건이 아닌 조건에서 물리화 학적으로 변성이 일어난다. 특히, 온도, pH, 염의 농도, 공기와의 접촉, 단백질의 농도, 완충액(buffer)의 종류 등의 요인은 단백질의 산화(oxidation), 탈아마이드화(deamidation), 이성질체화(isomerization), 다합체화 (polymerization) 등에 상당한 영향을 미친다. 이러한 변성은 단백질의 응집(aggregation), 단편(fragment) 및 이성질체(isomer)를 생성시켜 생리 활성을 감소시킬 수 있다. 이와 같은 특성은 단백질에 따라 상이하며, 특히 Fc 융합 단백질의 경우에는 폴딩(folding) 문제가 있어 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography) 분석에서 3개의 피크(peak)로 분리되어 분석된다(문헌[Antibodies (2013), 2,452-500] 참조).
한편, 하기 선행 특허문헌 1(국제공개공보 WO 2007/149334호)에는 "1~100mg/ml의 아플리버셉트(Aflibercept), 0.01~5%의 유기 공용매(예: 폴리소르베이트, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등), 30~150mM의 등장화제(예: NaCl, KCl 등), 5~40mM의 인산나트륨 완충액 및 1.0~7.5%의 안정화제(예: 수크로오스, 소르비톨, 글리세롤, 트레할로오스, 만니톨 등)를 포함하는 안과용 제제(ophthalmic formulation)"와 "5~50mg/ml의 아플리버셉트(Aflibercept), 5~25mM의 인산나트륨 완충액, 0.01~0.15%의 유기 공용매, 1~10%의 안정화제, 20~150mM의 등장화제를 포함하는 동결건조가능 제제(lyophilizable formulation)"가 개시되어 있다. 하기 선행 특허문헌 1에 기재된 제제는 유리체내 투여에 적당한 프리필드 시린지 (prefilled syringe)에 적용할 수 있다.
하기 선행 특허문헌 1에 기재된 안과용 제제 및 동결건조가능 제제의 경우 아플리버셉트(Aflibercept)의 응집, 단편화 및 이성질체화 등으로 인한 불순물 내지 부산물의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 보고된 바 있으나, 선행 특허문헌 1의 제제는 가혹 조건, 예를 들어, 40℃ 이상의 고온 조건 또는 교반 조건 등이 주어지는 경우 아플리버셉트(Aflibercept)의 안정화 효과가 현저히 감소되는 문제가 발생한다.
이에, 본 발명자들은 아플리버셉트(Aflibercept)와 같은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질이 저장 조건에서 장기간 안정하게 유지될 뿐만 아니라 가혹 조건에서도 안정성이 향상된 액상 제제를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
선행 특허문헌 1: 국제공개공보 WO 2007/149334호
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질이 안정화된 제제를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질의 안정화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질의 안정화용 조성물; 및 아플리버셉트를 포함하는 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질; 및 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액; 을 포함하는 액상 제제를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인은 제1 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 2 및 제2 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 3을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 융합 단백질은 10 내지 40 mg/mL의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 히스티딘 염은 히스티딘-HCl 또는 히스티딘-아세테이트일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 히스티딘 염의 농도는 10 mM 내지 50 mM일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 전술한 액상 제제는 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 당은 2.5% 내지 10%의 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨 및 글루코오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 당은 5% 내지 10%의 수크로오스일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 계면활성제는 0% 내지 0.03%, 바람직하게는 0% 또는 0.01% 내지 0.03%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80일 수 있다.
본 발명은 또한, 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액; 및 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제; 를 포함하고, 상기 히스티딘 염은 10 mM 내지 50 mM의 히스티딘-HCl 또는 히스티딘-아세테이트이며, 상기 당은 2.5% 내지 10%의 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨 및 글루코오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 계면활성제는 0% 내지 0.03%, 바람직하게는 0% 또는 0.01% 내지 0.03%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인, VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질의 안정화용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2 pH 범위를 갖는 완충액을 이용하여 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 완충액에 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명은 또한, 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액; 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제; 및 아플리버셉트(Aflibercept); 를 포함하고, 상기 히스티딘 염은 10 mM 내지 50 mM의 히스티딘-HCl 또는 히스티딘-아세테이트이며, 상기 당은 2.5% 내지 10%의 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨 및 글루코오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 계면활성제는 0% 내지 0.03%, 바람직하게는 0% 또는 0.01% 내지 0.03%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인, 액상 제제를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 액상 제제는 유리체내 주사(intravitreal injection)에 적합할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 액상 제제는 일반적인 저장조건 뿐만 아니라 가혹 조건, 예를 들어, 40℃ 이상의 고온 조건 또는 교반 조건에서 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인을 가지는 융합 단백질[특히, 혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질(예컨대, 아플리버셉트)]의 응집, 단편화 및 이성질체화 등으로 인한 불순물 내지 부산물의 생성이 현저히 억제되어 장기 보관시 안정성을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 아플리버셉트(Aflibercept)를 비롯한 항-VEGF-Fc 융합 단백질의 유리체내 주사에 적당한 안정한 액상 제제를 통해 생리 활성의 안정화를 도모하면서 비정상적인 혈관생성에 의한 각종 안과 질환(예: 망막 정맥 폐쇄, 당뇨병성 황반 부종, 맥락막 혈관신생, 습성 연령-관련 황반 변성 등)의 치료 효과를 개선할 수 있다.
도 1은 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 히스티딘염 완충액의 pH를 달리하여 40℃에서 7일간 보관한 시료의 응집물(aggregate) 및 단편(fragment)의 함량(%) 변화를 측정한 그래프이다.
도 2는 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 히스티딘염 완충액의 pH를 달리하여 40에서 7일간 보관한 시료의 HI-HPLC(소수성 상호작용 고성능 액체 크로마토그래피) 분석에서 피크 1, 2, 및 3의 함량(%) 변화를 측정한 그래프이다.
도 3은 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 다양한 종류의 완충액 (소듐 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘-HCl, 히스티딘-아세테이트 및 소듐 아세테이트)에서 40℃ 조건으로 21일간 보관 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 4는 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 히스티딘염 완충액에 여러 종류의 당(트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 및 글루코오스)을 포함하는 제제에서 50℃에서 8일간 보관 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 5는 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 히스티딘염 완충액에 수크로오스 농도를 달리하여 45℃ 조건으로 7일간 보관한 시료의 응집물(aggregate) 및 단편(fragment)의 함량(%) 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 히스티딘염 완충액에 여러 종류의 염(소듐 클로라이드, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트 및 포타슘 클로라이드)을 포함하는 제제로 45℃에서 7일간 보관한 시료의 응집물(aggregate) 및 단편(fragment)의 함량(%) 변화를 측정한 그래프이다.
도 7은 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 히스티딘염 완충액에 폴리소르베이트 유무에 따른 제제를 25℃에서 200 rpm으로 교반(shaking)하면서 7일간 보관한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 8은 아플리버셉트(Aflibercept)를 포함하는 히스티딘염 완충액에 polysorbate 20 여러 농도(0%, 0.01%, 0.03%, 0.05%, 및 0.1%)를 포함하는 제제로 45℃에서 7일간 보관한 시료의 응집물(aggregate) 및 단편(fragment)의 함량(%) 변화를 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 기존에 제공되는 아플리버셉트(Aflibercept)와 같은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질이 안정화된 제제는 가혹 조건에서 안정성이 현저하게 감소하는 문제가 발생하여 일반적인 저장조건 뿐만 아니라 가혹 조건에서도 상기 융합 단백질이 안정하게 유지될 수 있는 제제의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명에서는 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질; 및 히스티딘염을 포함하며, 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액; 을 포함하는 액상 제제를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 액상 제제는 상기 융합 단백질을 일반적인 저장조건에서 장기간 안정하게 보관할 수 있을 뿐만 아니라, 가혹 조건에서도 불순물 내지 부산물의 생성이 현저하게 억제되므로 최적의 저장조건이 제공될 수 없는 불가피한 환경에서도 공지된 상기 융합 단백질의 제제와 비교하여 안정성이 현저하게 향상된 제제를 제공하는 것이 가능하다.
본 발명은 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질; 및 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액; 을 포함하는 액상 제제를 제공한다.
상기 액상 제제의 유효성분인 융합 단백질(fusion protein)에 있어서, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)의 가용성 세포외 도메인은 제 1 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 2 및 제 2 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 3를 포함할 수 있고, 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 도메인일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1의 Fc 도메인일 수 있다. 여기서, Fc 영역(Fc region)은 힌지(hinge)-CH1-CH2-CH3로 구성되어 있으며, CH1이 결실된 형태일 수 있다.
본 발명의 액상 제제에 있어서, 상기 융합 단백질은 약 10∼100 mg/ml, 바람직하게는 약 10∼80 mg/ml, 더욱 바람직하게는 약 10∼40 mg/ml의 양으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 액상 제제에 있어서, 상기 "완충액"은 그의 산-염기 콘쥬게이트 (conjugate) 성분의 작용에 의한 pH의 변화를 견디는 완충된 용액을 가리킨다. 본 발명의 일실시예에서는 히스티딘염을 포함하며 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액을 사용하였으며, 여기서 상기 히스티딘 염은 히스티딘-HCl 또는 히스티딘-아세테이트인 것이 바람직하고, 히스티딘 염의 농도는 10 mM 내지 50 mM일 수 있다.
도 1 및 2에 나타난 바와 같이, pH 5.7 내지 6.2의 히스티딘염 완충액을 사용한 제제의 조건에서 대조군 제제 (2) 보다 응집물 및 단편 생성 억제 효과가 현저하게 향상되었으며, 특히, pH 6.0에서 제제의 안정성이 가장 우수하였다.
완충액의 pH가 5.7 미만으로 낮아지는 경우, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이 제제의 안정성이 현저히 떨어지는 문제가 발생하며, pH가 6.5를 초과하는 경우 목표 단백질이 파손되거나 중첩되어 발생하는 불순물의 증가의 문제가 발생할 수 있다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이 다양한 종류의 완충액 조건에서 히스티딘-HCl 또는 히스티딘-아세테이트 완충액을 사용하였을 때, 응집물 및 불순물 생성 억제 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
나아가, 도 5의 제제 (3) 조건은 pH 6.0, 10mM의 히스티딘염 완충액에서 아플리버셉트의 안정성을 평가한 것으로, 상기 완충액의 조건만으로도 대조군 제제 (2)와 유사한 수준의 아플리버셉트 안정성이 유지됨을 확인하였다.
본 발명의 액상 제제는, 액상 제제의 유효성분인 상기 융합 단백질과 히스티딘염 완충액 외에도 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 액상 제제에 있어서, 상기 당은 트레할로오스(trehalose), 수크로오스(sucrose), 만니톨(mannitol), 소르비톨 (sorbitol), 글루코오스(glucose), 락토오스(lactose), 자일리톨(xylitol), 이노시톨(inositol), 글리세롤(glycerol) 및 하이드록시 프로필 사이클로덱스트린 (hydroxypropyl cyclodextrin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있고, 바람직하게는 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨 및 글루코오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 당의 농도는 2.5~10%(v/v)일 수 있다.
도 4에 나타난 바와 같이, 히스티딘염 완충액에 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨 및 글루코오스를 각각 포함하는 제제 (3) 내지 (6)은 모두 대조군 제제 (2) 보다 아플리버셉트의 안정성이 향상되었으며, 특히 당이 수크로오스인 경우 아플리버셉트 안정성이 가장 우수했다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이 수크로오스가 포함되지 않은 제제 (3)은 대조군 제제 (2)와 비교하여 유사한 정도의 제제 안정성을 나타냈으며, 수크로오스의 농도가 증가할수록 대조군 (2)에 비해 응집물 및 불순물 생성 억제 효과가 증가되었다.
본 발명의 액상 제제에 있어서, 상기 계면활성제는 안과용 약물 전달(ophthalmic drug delivery)을 위해서 사용될 수 있으며, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 쯔비터-이온성 계면활성제 등 그 종류에 제한은 없다. 계면활성제의 농도는 약 0% 내지 0.3%(v/v)일 수 있고, 바람직하게는 0% 또는 0.01% 내지 0.03%일 수 있다.
상기 음이온성 계면활성제(anionic surfactant)의 예로는 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 카르복실레이트 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 양이온 계면활성제(cationic surfactant)의 예로는 옥테니딘 디하이드로클로라이드, 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 헥사데실 트리메틸암모늄 브로마이드, 세틸 트리메틸암모늄 클로라이드(CTAC), 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 벤잘코늄 클로라이드(BAC), 벤제토늄 클로라이드, 5-브로모-5-니트로-1,3-디옥산, 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드, 세트리모늄 브로마이드, 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DODAB) 등을 들 수 있다.
상기 비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant)의 예로는 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬 에테르류, 폴리옥시프로필렌 글리콜 알킬 에테르류, 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르류(예: Triton X-100 등), 폴리옥시에틸렌 글리콜 알킬페놀 에테르류, 글리세롤 알킬 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르류(예: 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 등), 코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA, 도데실디메틸아민 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리에톡실화 탈로우 아민(POEA) 등을 들 수 있다.
상기 쯔비터-이온성 계면활성제(Zwitter-ionic surfactant)의 예로는 CHAPS(3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설페이트), 코카아미도프로필 하이드록시설타인 등을 들 수 있다.
또한, 계면활성제로서 암모늄 라우릴 설페이트, 소듐 라우릴 설페이트(SLS), 소듐 도데실 설페이트(SDS), 소듐 라우릴 에테르 설페이트(SLES). 소듐 마이레쓰 설페이트(sodium myreth sulfate) 등과 같은 알킬 설페이트류; 디옥틸 소듐 설포숙시네이트, 퍼플루오로옥탄설포네이트(PFOS), 퍼플루오로부탄설포네이트, 선형 알킬벤젠 설포네이트(LAB)류 등과 같은 도큐세이트(docusate)류; 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딘콜린 등과 같은 인지질(phospholipid)류; 스핑고마이엘린(sphingomyeline)류 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 전술한 액상 제제에 포함되는 구성성분 이외에 추가적인 염 성분의 첨가 여부에 따른 제제의 안정성을 평가하기 위해 염을 포함하지 않거나 다양한 종류의 염을 각각 포함하는 제제를 제조하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 추가적인 염 성분을 포함하지 않는 제제에서 응집물 및 불순물 생성 억제 효과가 가장 우수한 것으로 관찰되었다.
본 발명에 따른 액상 제제는 일반적인 저장조건에서 장기간 융합 단백질의 안정성이 유지되면서 가혹 조건에서도 융합 단백질의 불순물 내지 부산물 생성 억제 효과가 우수하여 융합 단백질의 안정성이 기존의 액상 제제보다 향상된다. 본 발명에서 "가혹 조건"은 융합 단백질에 대해 화학적 및 물리적으로 바람직하지 않은 환경을 가리키며, 용인할 수 없는 단백질 안정성을 갖도록 할 수 있다. 상기 가혹조건은 예를 들어, 고온 또는 교반조건 등이 있다.
본 발명에서, 용어 "안정한"은 단백질이 보관 중 그의 물리적 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것을 말한다. 단백질 안정성 측정을 위한 다양한 분석적 기술이 당업계에서 이용가능하며, 안정성은 선택된 온도에서, 선택된 기간에 대해 측정될 수 있다.
단백질은 색 및/또는 투명도의 육안 검사로 관찰시, 또는 UV 광산란 (보이는 응집체를 측정함) 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 측정시, 응집, 침전 및/또는 변성에 있어서 거의 변화를 보이지 않거나 전혀 변화를 보이지 않는 경우 제제에서 "그의 물리적 안정성을 유지한다"라고 할 수 있다.
도 1 내지 6 및 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 다양한 조건의 액상 제제는 40 내지 50℃의 온도 범위에서 7 내지 21일 동안 대조군 제제 (2) 보다 응집물 및 불순물 생성이 현저하게 억제되어 상대적으로 안정하게 유지되었다.
본 발명의 다양한 조건의 액상 제제를 7일 동안 200 rpm으로 교반(shaking)하면서 25℃에서 보관한 다음 각각의 제제를 SE-HPLC 및 HI-HPLC 분석한 결과, 폴리소르베이트 20의 유무에 관계없이 응집물 및 변형체 생성이 억제되었다. SDS-PAGE(Non-reducing)(도 7) 및 SE-HPLC 결과에서도 마찬가지로, 25℃에 7일 동안 교반하는 조건에서 폴리소르베이트의 유무에 관계없이 대조군 (1)보다 응집물 및 단백질 단편 생성이 억제되는 것이 관찰되었으며, 특히 폴리소르베이트가 포함되지 않은 제제의 응집물 및 단백질 단편 생성 억제 효과가 약간 더 좋았다.
본 발명은 또한, 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액; 및 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제; 를 포함하고, 상기 히스티딘 염은 10 mM 내지 50 mM의 히스티딘-HCl 또는 히스티딘-아세테이트이며, 상기 당은 2.5% 내지 10%의 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨 및 글루코오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 계면활성제는 0% 내지 0.03%, 바람직하게는 0% 또는 0.01% 내지 0.03%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인, VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인과 IgG의 Fc 도메인이 융합된 단백질의 안정화용 조성물을 제공한다.
상기 안정화용 조성물의 구성에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 파히기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한, 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2 pH 범위를 갖는 완충액을 이용하여 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포외 도메인과 인간 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 도메인이 융합된 단백질을 안정화시키는 방법을 제공한다.
상기 완충액 및 융합 단백질에 대한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 중복된 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 융합 단백질을 안정화시키는 방법에 있어서, 상기 완충용액에 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제를 추가로 첨가할 수 있다.
추가로 첨가되는 당 및 계면활성제에 대한 설명 또한 전술한 바와 동일하므로, 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한, 히스티딘 염을 포함하며, 5.7 내지 6.2의 pH 범위를 갖는 완충액; 당 및 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 안정화제; 및 아플리버셉트(Aflibercept); 를 포함하고, 상기 히스티딘 염은 10 mM 내지 50 mM의 히스티딘-HCl 또는 히스티딘-아세테이트이며, 상기 당은 2.5% 내지 10%의 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨 및 글루코오스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 상기 계면활성제는 0% 내지 0.03%, 바람직하게는 0% 또는 0.01% 내지 0.03%의 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인, 액상 제제를 제공한다.
상기 액상 제제는 아플리버셉트의 처리로 치료될 수 있는 질환이라면 특별한 제한없이 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약 용도로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 망막 정맥 폐쇄, 당뇨병성 황반 부종, 맥락막 혈관신생, 습성 연령-관련 황반 변성 등의 각종 안과 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액상 제제는 약제학적으로 허용가능한 담체(carrier), 희석제(diluent), 부형제(excipient) 등을 추가로 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 제제에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 액상 제제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 액상 제제는 목적에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 안과 질환의 치료를 위해 유리체내 주사(intravitreal injection)로 투여되는 것이 좋고, 유리체내 주사에 적당한 프리필드 시린지(pre-filled syringe)에 적용할 수 있다.
본 발명의 액상 제제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 범위는 하기 실시예에 국한되는 것으로 해석되어서는 아니되며, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자('통상의 기술자')에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
제제의 최적 pH 조건 평가
본 실시예 1 및 이하의 실시예 2 내지 5에서는 선행기술문헌인 국제공개공보 WO 2007/149334호에 개시된 액상 제제를 5±3℃에서 보관한 것을 대조군 (1)로 하고, 대조군 (1)에 가혹 조건(40℃ 이상의 온도)을 가한 것을 대조군 (2)로 하여, 제제 안정성을 본 발명의 다양한 형태의 액상 제제 안정성과 비교하였다.
본 실시예에서는 항-VEGF-Fc 융합 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)를 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적 pH를 확인하기 위하여 다음과 같이 히스티딘염 완충액을 기반으로 pH별로 시료를 제조하였다.
구체적으로, 아플리버셉트(Aflibercept)의 최종 농도를 40 mg/ml가 되도록 하고, (1) 10 mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), pH 6.2, 5% 수크로오스(sucrose), 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(5±3℃ 보관) 제제; (2) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(40℃ 보관) 제제와 10% 트레할로오스, 0.01%(w/v) 폴리소르베이트 20 및 10mM 히스티딘-HCl 완충액의 조건에서 pH를 각각 (3) 5.5; (4) 5.7; (5) 6.0; (6) 6.2; (7) 6.5로 하고 40℃에서 7일간 보관하여 시간이 경과함에 따라 생성된 불순물을 SE-HPLC(크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피) 및 HI-HPLC 분석을 수행하였다.
SE-HPLC 분석에서, TSK-gel G3000SWXL(7.8 × 300 mm) 칼럼(일본 TOSOH사)을 사용하여 0.2M 포타슘 포스페이트 (pH 6.2), 0.25M KCl 및 0.05%(w/v) NaN3 완충액을 0.5 ml/분의 속도로 흘려주고, 흡광도 280nm에서 항-VEGF-Fc 융합 단백질의 피크를 확인하였다.
40℃에서 7일간 보관한 시료에 대한 SE-HPLC 분석에서, 단량체의 함량을 계산하고, 고분자량 불순물인 응집물(aggregate)들과 저분자량 불순물인 단편(fragment)들을 합하여 계산하였다. 도 1은 7일째의 SE-HPLC 결과를 나타낸 것이다. 대조군 (2)와 비교하여 본 발명의 제제는 pH 5.7, 6.0, 6.2 및 6.5에서 응집물들과 단편 생성이 현저하게 감소되어 안정하다는 것을 나타낸다. 또한, 여러 pH 조건 중 pH 6.0에서 제제의 안정성이 가장 높은 것으로 분석되었다.
HI-HPLC 분석에서 TSK Phenyl-5PW(7.5 × 300 mm) 칼럼을 사용하였고, 이동상으로는 50mM 소듐 포스페이트(pH 7.0)를 사용하였고, 2M NaCl, 50mM 소듐 포스페이트(pH 7.0) 및 30%(v/v) 아세토니트릴 완충액을 사용하여 0%~90%의 농도 구배로 흘려 주어 흡광도 220nm에서 항-VEGF-Fc 융합 단백질의 피크를 확인하였다. HI-HPLC 분석 시 피크 1, 피크 2 및 피크 3 등 3개의 주요 피크가 있는데, 각 피크의 변화가 적은 것을 안정한 것으로 판단하였다.
40℃에서 보관한 시료를 시간의 경과에 따라 HI-HPLC 분석한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 각 조건에서의 피크 1, 피크 2 및 피크 3의 변화를 나타내며, 대조군 (2)와 비교하여 본 발명의 pH 5.7, 6.0, 6.2 및 6.5 조건의 제제에서 피크의 변화가 현저하게 적은 것이 확인되었다. 또한, 다른 여러 pH 조건에 비하여 pH 6.0 조건에서 상대적으로 가장 안정한 것으로 나타났다.
제제의 최적 완충액 조건 평가
본 실시예에서는 항-VEGF-Fc 융합 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)를 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적 완충액 조건을 확인하기 위하여 다음과 같이 시료를 제조하였다.
구체적으로, 아플리버셉트(Aflibercept)의 최종 농도를 40 mg/ml가 되도록 하고, (1) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(5±3℃ 보관 제제); (2) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(40℃ 보관 제제), 그리고 (3) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0; (4) 10mM 히스티딘-HCl, pH 6.0; (5) 10 mM 히스티딘-아세테이트, pH 6.0; (6) 10mM 숙시네이트(succinate), pH 6.0; 및 (7) 10mM 소듐 아세테이트, pH 5.6의 완충액 각각에 0.01% 폴리소르베이트 20과 2.5% 수크로오스를 포함하는 여러 제제 조건에서 40℃, 21 일간 보관하며 시간 경과에 따라 단량체, 응집체, 및 변형체를 상기 실시예 1과 동일하게 SE-HPLC, HI-HPLC로 분석하였다.
그리고, SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 1 mg/mL로 희석된 분석시료 20.0 μL에 5x 시료 완충액(reducing 또는 non-reducing) 5.0 μL를 첨가한 후 100℃에서 5분 반응한 시료를 분석에 사용하였다. 최종 분석시료는 웰 당 12.5 μL 로딩하였다. 마커(M)는 DokDo-Mark™ 단백질 마커를 사용하였으며, 웰 당 3 μL 로딩하였다. 10% SDS-PAGE(Reducing), 6% SDS-PAGE(Non-reducing) 겔에 전기영동한 후 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색하였으며, 선명한 밴드가 나올 때까지 탈색하였다.
SDS-PAGE(Non-reducing)(도 3), SE-HPLC 및 HI-HPLC로 분석한 결과, 대조군 (2)와 비교하여 본 발명의 10 mM 히스티딘-HCl 및 10 mM 히스티딘-아세테이트 제제는 응집물 및 불순물 생성을 현저하게 억제하는 것으로 확인되었다.
제제의 최적 당 종류 조건 평가
본 실시예에서는 항-VEGF-Fc 융합 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)를 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적인 당을 확인하기 위하여 다음과 같이 시료를 제조하였다.
구체적으로, 아플리버셉트(Aflibercept)의 최종 농도를 40 mg/ml가 되도록 하고, (1) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(5±3℃ 보관 제제); (2) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(50℃ 보관 제제), 그리고 0.01% 폴리소르베이트 20을 포함하는 10mM 히스티딘-아세테이트 완충액(pH 6.0)에 (3) 2.5% 트레할로오스; (4) 2.5% 수크로오스; (5) 2.5% 만니톨; 및 (6) 2.5% 글루코오스를 각각 포함하는 제제를 50℃에서 8일간 보관하여 시간 경과에 따라 생성되는 단량체, 응집물, 및 변형체를 상기 실시예 1 및 2와 동일하게 SDS-PAGE(Reducing, Non-reducing), SE-HPLC, 및 HI-HPLC로 분석하였다.
SDS-PAGE(Reducing, Non-reducing) 분석(도4) SE-HPLC 및 HI-HPLC 분석 결과, 대조군 (2)와 비교하여 본 발명의 트레할로오스, 수크로오스, 만니톨 및 글루코오스를 각각 포함하는 모든 제제는 응집물 및 불순물 생성을 현저하게 억제 하였으며, 특히 수크로오스를 포함하는 제제에서의 응집물 및 불순물 생성 억제 효과가 가장 우수하였다.
제제의 최적 당 농도 조건 평가
본 실시예는 항-VEGF-Fc 융합 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)를 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적인 당의 농도 확인하기 위하여, 다음과 같이 시료를 제조하였다.
구체적으로, 아플리버셉트(Aflibercept)의 최종 농도를 40 mg/ml가 되도록 하고, (1) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20 (5±3℃ 보관 제제); (2) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(45℃ 보관 제제), 그리고 0.01% 폴리소르베이트 20을 포함하는 10mM 히스티딘-아세테이트 완충액(pH 6.0)에 각각 (3) 0%; (4) 2.5%; (5) 5%; 및 (6) 10%로 수크로오스 농도를 달리하여 45℃ 조건으로 7일간 보관하며 시간 경과에 따라 생성되는 단량체, 응집체, 및 변형체를 상기 실시예 1 및 2와 동일하게 SDS-PAGE(Reducing, Non-reducing), SE-HPLC, 및 HI-HPLC로 분석하였다.
SE-HPLC 분석 결과, 본 발명의 수크로오스를 포함하지 않는 제제 (3)은 대조군 (2)와 유사한 정도의 제제 안정성을 나타냈으며, 본 발명의 각 제제에서 수크로오스의 농도가 증가할수록 대조군 (2)에 비해 응집물 및 불순물 생성 억제 효과가 증가됨을 확인하였다(도 5).
추가적인 염 조건 평가
본 실시예에서는 항-VEGF-Fc 융합 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)를 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적인 추가적인 염 성분을 확인하기 위하여 다음과 같이 시료를 제조하였다.
구체적으로, 아플리버셉트(Aflibercept)의 최종 농도를 40 mg/ml가 되도록 하고, (1) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(5±3℃ 보관 제제); (2) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20(45℃ 보관 제제), 그리고 0.01% 폴리소르베이트 20을 포함하는 10mM 히스티딘-아세테이트 완충액(pH 6.0)에 (3) 염을 포함하지 않는 제제; (4) 40 mM 소듐 클로라이드; (5) 40 mM 암모늄 클로라이드; (6) 40 mM 암모늄 설페이트; 및 (7) 40 mM 포타슘 클로라이드를 각각 포함하는 제제를 45℃ 조건으로 7일간 보관하며, 시간 경과에 따라 생성되는 단량체, 응집물, 및 변형체를 상기 실시예 1 및 2와 동일하게 SDS-PAGE(Reducing, Non-reducing), SE-HPLC, 및 HI-HPLC로 분석하였다.
SDS-PAGE 및 SE-HPLC(도 6) 분석 결과, 대조군 (2)와 비교하여 본 발명의 추가적인 염 성분을 포함하지 않는 제제 (3)의 응집물 및 불순물 생성 억제 효과가 가장 우수한 것으로 관찰되었다.
교반 조건에서 계면활성제 유무에 따른 안정성 평가
본 실시예에서는 항-VEGF-Fc 융합 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)를 유효성분으로 함유하는 히스티딘-HCl 완충액 기반의 액상 제제로 교반(agitation)을 하는 동안 수크로오스 농도 및 폴리소르베이트 20 유무에 따른 제제 안정성 평가를 위해서 다음과 같이 시료를 제조하였다.
구체적으로, 아플리버셉트(Aflibercept)의 최종 농도를 40 mg/ml가 되도록 하고, (1) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20; (2) 10 mM 히스티딘-아세테이트, pH 6.0, 10% 수크로오스; (3) 10 mM 히스티딘-HCl, pH 6.0, 7.5% 수크로오스; (4) 10 mM 히스티딘-HCl, pH 6.0, 5% 수크로오스, 0.01% 폴리소르베이트 20; (5) 10 mM 히스티딘-HCl, pH 6.0, 7.5% 수크로오스, 0.01% 폴리소르베이트 20; 및 (6) 10 mM 히스티딘-HCl, pH 6.0, 10% 수크로오스, 0.01% 폴리소르베이트 20 제제를 각각 orbital shaker로 200 rpm으로 교반하면서 5±3℃ 또는 25℃에 7일간 보관하였다.
이때, 상기 (1)에 기재된 조건은 선행특허 문헌 1인 국제공개공보 WO 2007/149334호의 제제에 해당하며, 상기 (2)에 기재된 조건은 히스티딘염 완충액 변화에 대한 대조군으로 사용되었다.
SE-HPLC 및 HI-HPLC 분석 결과, 25℃에 7 일 동안 교반하면서 보관한 제제 조건에서 폴리소르베이트의 유무에 관계없이 대조군 (1) 보다 응집물 및 변형체의 생성이 억제됨을 확인하였다. SDS-PAGE(Non-reducing)(도 7) 및 SE-HPLC결과에서도 마찬가지로, 25℃에 7일 동안 교반하는 조건에서 폴리소르베이트의 유무에 관계없이 대조군 (1)보다 응집물 및 단백질 단편 생성이 억제되는 것이 관찰되었으며, 특히 폴리소르베이트가 포함되지 않은 제제의 응집물 및 단백질 단편 생성 억제 효과가 약간 더 좋았다.
제제의 최적 polysorbate 20 농도 조건 평가
본 실시예에서는 항-VEGF-Fc 융합 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)를 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적인 polysobrate 20의 농도를 확인하기 위하여 다음과 같이 시료를 제조하였다.
구체적으로, 아플리버셉트(Aflibercept)의 최종 농도를 40 mg/ml가 되도록 하고, (1) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20 (5±3℃ 보관 제제); (2) 10 mM 소듐 포스페이트, pH 6.2, 5% 수크로오스, 40mM NaCl, 0.03% 폴리소르베이트 20 (45℃ 보관 제제), 그리고 10mM 히스티딘-아세테이트 완충액(pH 6.0), 10% 수크로오스 조성에 각각 (3) 0%; (4) 0.01%; (5) 0.03%; (6) 0.05; 및 (7) 0.1% 농도의 폴리소르베이트 20을 포함하는 제제를 45℃ 조건으로 7일간 보관하며, 시간 경과에 따라 생성되는 단량체, 응집물, 및 변형체를 상기 실시예 1 및 2와 동일하게 SDS-PAGE(Reducing, Non-reducing), SE-HPLC, 및 HI-HPLC로 분석하였다.
SE-HPLC(도 8) 분석 결과, 본 발명의 폴리소르베이트 20을 포함하지 않는 제제 (3)와 포함하는 제제 (4), (5), (6) 및 (7) 모두 응집물 및 불순물 생성 억제 효과가 대조군 (2)와 비교하여 우수한 것으로 관찰되었다.
결과적으로, 상기 실시예 1 내지 7을 통해 본 발명의 다양한 조건의 액상 제제는 선행 특허문헌 (1)의 제제에 비해 응집 및 단편화가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
이와 같은 제제 안정성 평가를 통해, 본 발명의 액상 제제는 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 응집, 단편화 및 이성질체화 등으로 인한 불순물 내지 부산물의 생성 억제 효과가 탁월하여 상기 융합 단백질을 장기간 안정하게 보관할 수 있을 뿐만 아니라 가혹 조건에서도 향상된 안정성을 제공할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 다음을 포함하되, 추가적인 염 성분은 포함하지 않는 액상 제제:
    10 mg/ml 내지 100 mg/ml의 아플리버셉트;
    2.5(w/v)% 내지 10(w/v)%의 당;
    0(w/v)% 내지 0.3(w/v)%의 계면활성제; 및
    pH 5.7 내지 pH 6.5를 유지하고, 히스티딘 염을 포함하는 완충액.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당의 농도는 5(w/v)% 내지 10(w/v)%인, 액상 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 히스티딘 염은 10 mM 내지 50 mM의 히스티딘-HCl 또는 히스티딘 아세테이트인, 액상 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 당은 수크로오스, 트레할로오스, 만니톨 및 글루코오스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 액상 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 액상 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 액상 제제는 유리체내 주사 (intravitreal injection)에 적합한, 액상 제제.
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