CN107853456A - 生物脱霉剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物脱霉剂，由益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体混合、干燥而成，所述益生菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体的质量比为1：5~25。制作方法依次按照如下步骤进行：取在宿主消化道内定植时间至少12小时的益生菌扩大培养，用PBS缓冲液制成菌悬液；按菌悬液与酵母细胞壁质量比2~10：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁，测蛋白总量；再加入碳二亚胺，缓慢搅拌后避光反应8~24 h，蛋白总量与碳二亚胺的质量比为0.2~10：1；将反应液离心弃上清，向沉淀中加入生理盐水溶解沉淀；加入载体混合后干燥成粉，沉淀与载体的质量比为1：5~25。

Description

生物脱霉剂及制备方法

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，尤其涉及一种价廉高效、可稳固吸附饲料中多种霉菌毒素的生物脱霉剂及制作方法。

背景技术

霉菌毒素是由霉菌或其他真菌产生的广泛存在于农作物、食品及饲料中的一类有毒有害物质（Darwish WS，et aI．，2014）。对畜禽养殖业而言，它能够侵害动物肝脏肾脏，严重阻碍动物体正常新陈代谢及免疫机能，有的甚至能够致癌、致畸（Awad W,et a1．，2013）。在饲料原料收集、产品加工、保存运输以及销售使用过程中均不免受到霉菌及其毒素污染，可以说霉菌毒素无处不在（汤少伟等，20l0）。其中黄曲霉毒素对人类和动物健康的威胁己为人所熟知( GuntherA．，et al.)，另外有研究发现饲料（尤其含玉米饲料）中主要霉菌毒素为呕吐毒素、烟曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，而且多种毒素并存现象普遍( Chen andRawlings，2008)。尤其最近几年农作物副产物（如棉籽粕、菜籽粕、葵籽粕、麸皮等）被饲料大量使用，使得饲料中霉菌毒素含量成倍增长。目前，对于饲料中霉菌毒素的处理方法有以下几种，分别存在着不同问题。

1. 吸附处理

大多是以活性炭和蒙脱石等铝硅酸盐为吸附剂，脱毒方法单一且非特异性，甚至能够吸附饲料中的维生素、微量元素等营养成分，难以降解而造成环境的蓄积性污染。另外还有以酵母细胞壁提取物（简称酵母细胞壁）为吸附剂，酵母细胞壁的特殊空间结构提供了更多的毒素结合位点，通过氢键和范德华力等分子间作用力可稳固吸附多种霉菌毒素，形成多糖-毒素复合物，阻止毒素被肠道吸收。具有特异性强、添加量少、在胃肠道内稳定性高及排出后可以被降解等特点，但在肠道停留时间短，吸附不完全。

2. 生物降解

李俊霞等人（2008）筛选出一株能降解黄曲霉毒素（ Aflatoxin，AF）B1的嗜麦芽窄食单胞菌，并对其在生物脱毒的应用领域进行了初步研究（2008）。但是该菌株只能降解黄曲霉毒素，而且价格较高，限制了其大规模应用推广。

发明内容

本发明是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种价廉高效、可稳固吸附饲料中多种霉菌毒素的生物脱霉剂及制作方法。

本发明的技术解决方案是：一种生物脱霉剂，由益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体混合、干燥而成，所述益生菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，所述益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体的质量比为1：5~25。

上述生物脱霉剂的制作方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 取在宿主消化道内定植时间至少12小时的益生菌扩大培养，培养液经离心、弃上清液后取菌泥，用生理盐水洗涤菌泥后，再用pH 8.0的PBS缓冲液制成菌悬液；

b. 按菌悬液与酵母细胞壁质量比2~10：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁，测蛋白总量；再加入碳二亚胺，缓慢搅拌后避光反应8~24 h，所述蛋白总量与碳二亚胺的质量比为0.2~10：1；

c. 将反应液离心弃上清液，向沉淀中加入2~10倍体积生理盐水溶解沉淀；

d. 加入载体混合后干燥成粉，所述沉淀与载体的质量比为1：5~25。

本发明的生物脱霉剂可在宿主消化道短暂定植，不但可保护肠道粘膜还可使酵母细胞壁彻底（不留死角）吸附饲料中的各种霉菌及霉菌毒素；使用方法简易灵活，可以拌入饲料或放入饮水摄入；每吨饲料只需添加100g左右即可，用量少，价格低廉。

附图说明

图1是本发明实施例1枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联物镜检图。

图2是本发明实施例1中FITC荧光染色的霉菌镜检图。

图3是本发明实施例1实验动物粪便抹片在荧光显微镜下的镜检图。

图4是本发明实施例1对照组和试验组处理后4h消化道粘膜镜检图。

图5是本发明实施例1对照组和试验组处理后12 h消化道粘膜镜检图。

具体实施方式

实施例1：

本发明的生物脱霉剂是由枯草芽孢杆菌/酵母细胞壁偶联物与葡萄糖混合、干燥而成，所述枯草芽孢杆菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，所述枯草芽孢杆菌/酵母细胞壁偶联物与葡糖糖的质量比为1：15。

依次按照如下步骤制备：

a. 取在宿主消化道内定植时间至少12小时的枯草芽孢杆菌（保藏号: CICC 20683）种子液以1：100（VN）比例接种于1000 mL/5000 mL装有培养基的三角烧瓶中，37℃震荡培养过夜，待菌株生长至对数后期离心收集菌体沉淀，然后用无菌PBS（pH 8.0）洗涤2~3次，最后用适当体积PBS缓冲液（pH 8.0）制成菌悬液备用；

b. 按菌悬液与酵母细胞壁质量比5：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁（MOS），测蛋白总量；再加入碳二亚胺（EDC），缓慢搅拌后避光反应15 h，所述蛋白总量与碳二亚胺的质量比为5：1；

c. 将反应液离心弃上清液取沉淀，即得到枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联产物，向沉淀中加入5倍体积生理盐水溶解沉淀；

d. 加入葡萄糖混合后干燥成粉，所述沉淀与葡萄糖的质量比为1：15。

枯草芽孢杆菌（保藏号: CICC 20683）定植时间是按照如下方法确定的：

将购买的益生菌菌种分别接种在营养琼脂培养基上进行培养，从平皿上挑取各菌株单菌落，接种于50 mL/250 mL兰角锥瓶中，37℃震荡培养8~10 h，待菌株生长至对数期时，4℃5000 r/min离心沉淀菌体，并用无菌PBS（pH7.4）洗涤2~13次。最后重悬于PBS溶液（pH7.4）中，使菌液终含量达10⁸ CFU/mL。然后将其与FITC溶液按10：1（V/V）混合，4℃标记2h后再次使用无菌PBS （pH7.4）洗涤5次，菌体终含量仍保持10⁸ CFU/mL。

将已经荧光标记的益生菌经口饲喂分别给10只健康鸡，剂量为l mL/只。经处理后第1、3、6、12……68 h时，每个时间点随机选2只试验鸡进行剖检，分别取其食道、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指肠、空回肠、盲肠、泄殖腔等部位粘膜以及粪便样品进行荧光示踪检测，确定益生菌在宿主消化道各部位中的定植部位定植时间。

将实施例1所得偶联产物进行革兰氏染色镜检，结果如图1所示。从图1可以看出枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联成功。

本发明实施例1生物脱霉剂的应用效果评价：

具体实验步骤如下：

①实验动物：彻底清扫鸡舍并进行常规消毒，即入雏前3天进行高锰酸钾．福尔马林熏蒸消毒24 h（W:V=1:2），注意熏蒸时舍温控制在15℃以上。试验鸡采用网上平养，统一饲喂专用不含任何微生态制剂的饲料。正常饲养至1月龄备用，期间按常规程序进行免疫和消毒；

②霉菌荧光标记：将采购的霉菌菌种（黄曲霉ATCC 28539和禾谷镰刀菌ATCC 200362）进行扩增培养。先取1 mL种子液接种于1 L YPD培养基中，30℃条件下培养48h；然后于6000r/min转速下离心10 min收集菌体，弃上清液。然后使用PBS（pH 7.4）洗涤3次后，重新悬浮并调使混合菌液终浓度达到10⁸ CFU/mL；然后与FITC溶液按10:1（V/V）混合，4℃标记2h后使用PBS（pH 7.4）洗涤5次，重新悬浮使菌液浓度达到10⁸ CFU/mL，荧光标记的霉菌如图2所示。

所述黄曲霉、禾谷镰刀菌均来源于美国ATCC菌种库。

③将实验鸡随机分为2组，每组4只，雌雄各半。一组为对照组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂按每吨饲料添加100g的传统脱霉剂（酵母细胞壁吸附剂），另一组为试验组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂同等剂量的本发明实施例1生物脱霉剂。

④每隔2h采集鸡粪，直至饲喂后24 h。用PBS（pH7.4）溶解鸡粪1 g/mL，然后取50μL于载玻片上，涂布均匀并固定。倒置荧光显微镜配置激发光主波长为334 nm的UV激发滤色镜，使用40倍物镜进行观察，试验后2h、4h、6h、8h、12h鸡粪中荧光标记霉菌的镜检结果如图3所示。图3中3-1至3-10分别显示了对照组（2h）、试验组（2h）、对照组（4 h）、试验组（4h）、对照组（6h）、试验组（6h）、对照组（8h）、试验组（8 h）、对照组（10 h）及试验组（10 h）的粪便镜检结果。分别将6h、12h和24h的鸡粪用PBS （pH7.4）溶解成1 g/mL，混匀后取1ml适当稀释至平板计数，28±1℃条件下培养5d，采用GB4789.15-2016方法测定霉菌菌落总数，结果如表1所示。

表1 不同时间段各组鸡粪中霉菌菌落总数，单位：cfu/g

结果表明：对照组与实验组均不同程度有荧光标记的霉菌排出体外，从荧光量可看出试验组在12h排出体外的霉菌数试验组较对照组高。在平板计数结果上看，对照组与试验组均长出大量的霉菌，试验组霉菌数较多。说明本发明实施例1的益生菌偶联制剂短暂定植，排出体外同时脱除霉菌较多。

⑤饲喂后4h及l2h进行动物解剖。对照组及实验组每次随机选择2只，颈动脉放血致死，无菌条件下依次剪开腹腔各层，取出动物十二指肠部位组织，放置于灭菌的干净平皿中；将各部位剪开，注意只取十二指肠中间一段，避免两端交界处消化道内容物之间的干扰。先无菌PBS （pH 7.4）冲洗除去肠内容物，然后将组织放入灭菌的干净平皿中，再用PBS（pH7.4）反复洗涤。用干净载玻片边缘轻轻刮取各部位粘膜上皮悬浮于1 mL无菌PBS（pH7.4）中，分别取50 μL于载玻片上，涂布均匀并固定，于倒置荧光显微镜下观察。结果分别如图4和5显示。

图4中4-1至4-6分别为对照组腺胃、肌胃、十二指肠、空回肠、盲肠、直肠粘膜镜检图；图4-7至4-12依次为试验组腺胃、肌胃、十二指肠、空回肠、盲肠、直肠粘膜抹片镜检图。从图4可以看出，饲喂后4h，对照组和试验组各部位的腺胃、肌胃荧光标记霉菌较多。

图5中5-1至5-6分别为对照组腺胃、肌胃、十二指肠、空回肠、盲肠、直肠粘膜镜检图；5-7至5-12依次为试验组腺胃、肌胃、十二指肠、空回肠、盲肠、直肠粘膜抹片镜检图。从图5可以看出，饲喂12h后，试验组各部位检测少量荧光标记的霉菌，而对照组可在十二指肠部位检测到大量荧光，说明益生菌偶联制剂短暂定植，排出体外同时几乎脱除霉菌，而对照组荧光标记的霉菌则在十二指肠附近停留。

实旋例2：

本发明的生物脱霉剂是由粪肠球菌/酵母细胞壁偶联物与葡萄糖混合、干燥而成，所述粪肠球菌在宿主消化道内定植时间至少48小时，所述粪肠球菌/酵母细胞壁偶联物与葡萄糖的质量比为1：5。

依次按照如下步骤制备：

a. 取在宿主消化道内定植时间至少48小时的粪肠球菌（保藏号:CICC 20440）种子液以1：100（VN）比例接种于1000 mL/5000 mL装有培养基的三角烧瓶中，37℃震荡培养过夜，待菌株生长至对数后期离心收集菌体沉淀，然后用无菌PBS（pH 8.0）洗涤2~3次，最后用适当体积PBS缓冲液（pH 8.0）制成菌悬液备用；

b. 按菌悬液与酵母细胞壁质量比2：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁（MOS），测蛋白总量；再加入碳二亚胺（EDC），缓慢搅拌后避光反应8 h，所述蛋白总量与碳二亚胺的质量比为0.2：1；

c. 将反应液离心弃上清液取沉淀，即得到枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联产物，向沉淀中加入2倍体积生理盐水溶解沉淀；

d. 加入葡萄糖混合后干燥，所述沉淀与葡萄糖的质量比为1：5。

粪肠球菌（保藏号:CICC 20440）定植时间是按照实施例1所述方法确定的。

本发明实施例2生物脱霉剂的应用效果评价按照如下方法进行：

①实验动物：彻底清扫鸡舍并进行常规消毒，即入雏前3天进行高锰酸钾．福尔马林熏蒸消毒24 h（W:V=1:2），注意熏蒸时舍温控制在15℃以上。试验鸡采用网上平养，统一饲喂专用不含任何微生态制剂的饲料。正常饲养至1月龄备用，期间按常规程序进行免疫和消毒；

②霉菌荧光标记：将采购的霉菌菌种（黄曲霉ATCC 28539和禾谷镰刀菌ATCC 200362）进行扩增培养。先取1 mL种子液接种于1 L YPD培养基中，30℃条件下培养48h；然后于6000r/min转速下离心10 min收集菌体，弃上清液。然后使用PBS（pH 7.4）洗涤3次后，重新悬浮并调使混合菌液终浓度达到10⁸ CFU/mL；然后与FITC溶液按10:1（V/V）混合，4℃标记2h后使用PBS（pH 7.4）洗涤5次，重新悬浮使菌液浓度达到10⁸ CFU/mL，荧光标记的霉菌如图2所示。

③将实验鸡随机分为2组，每组4只，雌雄各半。一组为对照组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂每吨饲料添加100g的传统脱霉剂（酵母细胞壁吸附剂），另一组为试验组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂同等剂量的本发明实施例2生物脱霉剂。

④分别在6h、12h和24h采集鸡粪，用PBS （pH7.4）溶解鸡粪为1 g/mL，混匀后取1ml适当稀释至平板计数，28±1℃条件下培养5d，采用GB4789.15-2016方法测定霉菌菌落总数，霉菌菌落总数结果如表2所示。

表2 不同时间段各组鸡粪中霉菌菌落总数，单位：cfu/g

结果显示：对照组与试验组均长出大量的霉菌，试验组较多；说明本发明实施例2的益生菌偶联制剂短暂定植，排出体外同时脱除霉菌较多。

实施例3：

本发明的生物脱霉剂是由屎肠球菌/酵母细胞壁偶联物与可溶性淀粉混合、干燥而成，所述屎肠球菌在宿主消化道内定植时间至少48小时，所述屎肠球菌/酵母细胞壁偶联物与可溶性淀粉的质量比为1：25。

依次按照如下步骤制备：

a. 取在宿主消化道内定植时间至少48小时的屎肠球菌（保藏号:CICC 6078）种子液以1：100（VN）比例接种于1000 mL/5000 mL装有培养基的三角烧瓶中，37℃震荡培养过夜，待菌株生长至对数后期离心收集菌体沉淀，然后用无菌PBS（pH 8.0）洗涤2~3次，最后用适当体积PBS缓冲液（pH 8.0）制成菌悬液备用；

b. 按菌悬液与酵母细胞壁质量比10：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁（MOS），测蛋白总量；再加入碳二亚胺（EDC），缓慢搅拌后避光反应24h，所述蛋白总量与碳二亚胺的质量比为10：1；

c. 将反应液离心弃上清液取沉淀，即得到枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联产物，向沉淀中加入10倍体积生理盐水溶解沉淀；

d. 加入可溶性淀粉混合后干燥，所述沉淀与可溶性淀粉的质量比为1：25。

屎肠球菌（保藏号:CICC 6078）的定植时间是按照实施例1所述方法确定。

本发明实施例3生物脱霉剂的应用效果评价按照如下方法进行：

①实验动物：彻底清扫鸡舍并进行常规消毒，即入雏前3天进行高锰酸钾．福尔马林熏蒸消毒24 h（W:V=1:2），注意熏蒸时舍温控制在15℃以上。试验鸡采用网上平养，统一饲喂专用不含任何微生态制剂的饲料。正常饲养至1月龄备用，期间按常规程序进行免疫和消毒；

②霉菌荧光标记：将采购的霉菌菌种（黄曲霉ATCC 28539和禾谷镰刀菌ATCC 200362）进行扩增培养。先取1 mL种子液接种于1 L YPD培养基中，30℃条件下培养48h；然后于6000r/min转速下离心10 min收集菌体，弃上清液。然后使用PBS（pH 7.4）洗涤3次后，重新悬浮并调使混合菌液终浓度达到10⁸ CFU/mL；然后与FITC溶液按10:1（V/V）混合，4℃标记2h后使用PBS（pH 7.4）洗涤5次，重新悬浮使菌液浓度达到10⁸ CFU/mL，荧光标记的霉菌如图2所示。

③将实验鸡随机分为2组，每组4只，雌雄各半。一组为对照组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂每吨饲料添加100g的传统脱霉剂（酵母细胞壁吸附剂），另一组为试验组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂同等剂量的本发明实施例3生物脱霉剂。

④分别在6h、12h和24h采集鸡粪，用PBS（pH7.4）溶解鸡粪为1 g/mL，混匀后取1ml适当稀释至平板计数，28±1℃条件下培养5d，采用GB4789.15-2016方法测定霉菌菌落总数，霉菌菌落总数结果如表3所示。

表3 不同时间段各组鸡粪中霉菌菌落总数，单位：cfu/g

结果显示：对照组与试验组均长出大量的霉菌，试验组较多；说明本发明实施例3的益生菌偶联制剂短暂定植，排出体外同时脱除霉菌较多。

Claims (2)

1.一种生物脱霉剂，其特征在于：由益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体混合、干燥而成，所述益生菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，所述益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体的质量比为1：5~25。

2.一种如权利要求1所述生物脱霉剂的制作方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 取在宿主消化道内定植时间至少12小时的益生菌扩大培养，培养液经离心、弃上清液后取菌泥，用生理盐水洗涤菌泥后，再用pH 8.0的PBS缓冲液制成菌悬液；

b. 按菌悬液与酵母细胞壁质量比2~10：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁，测蛋白总量；再加入碳二亚胺，缓慢搅拌后避光反应8~24 h，所述蛋白总量与碳二亚胺的质量比为0.2~10：1；

c. 将反应液离心弃上清液，向沉淀中加入2~10倍体积生理盐水溶解沉淀；

d. 加入载体混合后干燥成粉，所述沉淀与载体的质量比为1：5~25。