CN107846901A - 抗微生物和农用化学组合物 - Google Patents

Abstract

根据本发明，提供一种抗微生物组合物，其包含含有铜和/或锌离子的水溶液，任选地包含氢氧化物盐和亚磷酸。所述组合物在与亚硝酸盐(如亚硝酸钠)组合时额外地杀孢子和杀菌核。本发明还可包括在农业应用中容易实现的浓度下能抑制菌核形成的含有亚磷酸盐或膦酸盐基团(PO/1)的化学物质。本发明的组合物抑制真菌的菌核形成，并且因此可在田地中用于防止病原性真菌的持续和发展。

Description

抗微生物和农用化学组合物

相关专利申请的交叉引用

本申请要求Tony John Hall博士于2015年6月8日提交的名称为“抗微生物和农用化学组合物(Antimicrobial and Agrochemical Compositions)”的美国专利申请第62/172,501号的优先权，根据国家或地区法律的准许将其全部公开内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体上涉及还抑制真菌菌核形成的抗微生物组合物，并且更具体地涉及包含铜离子(在有或没有锌离子的情况下)、氢氧化物盐和亚磷酸作为活性成分的含水组合物。所述组合物在与亚硝酸盐(如亚硝酸钠)组合时额外地具有杀孢子和杀菌核性。所述组合物凭借着其含有具有亚磷酸盐和膦酸盐(PO₃ ^3-)基团的亚磷酸而成为真菌菌核形成抑制剂。

背景技术

农业的全球化已经导致作物植物生长在其中可能使它们暴露于它们所敏感的新病原体或现有病原体的新菌株(如真菌和细菌)的地区中。据估计所有主要作物疾病的70％是由植物病原性真菌引起，并且现在已确认植物疾病威胁全世界的食物供应。

农用商业抗真菌剂的开发始于19世纪的基于铜的波尔多混合物(Bordeauxmixture)。在20世纪，生产了许多新类别的具有限定的作用模式的合成有机杀真菌剂，但真菌对许多这些药剂的抗性的形成已经成为越来越大的问题。另外，许多这些杀真菌剂对环境或其它物种具有毒性作用，并且它们可存留于作物中并进入食物链。因此，越来越需要对于环境和消费者更安全的新杀真菌剂。

许多真菌以孢子形式散播，并且通过风传播其孢子的植物病原性真菌导致一些最具破坏性的作物疾病，例如咖啡锈病(咖啡锈菌(Hemileia vastairix))、稻瘟病(稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae))和香蕉植物上的黑斑病(斐济球腔菌(Mycosphaerellafijiensis))。真菌(和细菌)孢子对冷、热量、紫外光和大多数杀真菌剂具有高抗性。实际上，大多数孢子的抗性使得化学物质(如在高浓度(例如分别为5％到10％和>10％)下具杀孢子性的次氯酸(漂白剂)和过氧化氢)在这些杀孢子浓度下也对植物、动物和甚至建筑环境具有高度破坏性。

除了作为散播和存活的手段的孢子以外，许多真菌可产生被称作菌核的存活结构，所述菌核代表归因于丝核菌属(Rhizoctonia)、轮枝孢属(Verticiliium)、核盘菌属(Sclerotinia)和壳球孢属(Macrophormina)的植物病原性疾病的重要来源。菌核是无性、多细胞、休眠和高度化学抵抗性的结构。菌核通常是黑化的，这使其获得对紫外光暴露的抵抗性，并且因此，它们通常被识别为是在土壤中或植物、水果和蔬菜上的黑色斑点或物体。一旦菌核存在于土壤中，它们就可存活许多年，从而当与植物根部接触时感染新近种植的作物，导致菌核出芽和经由根部侵入植物的真菌菌丝的生长。因此，存在对可在农业中控制菌核形成的环境安全和有成本效益的产品的需要。

由于基于铜的杀真菌剂可广泛获得、便宜和使用相对安全，所以现今基于铜的杀真菌剂仍然广泛地在农业(包括有机耕种)中使用。另外，真菌对基于铜的产品的抵抗性低，因为铜发挥多种毒性作用，包括细胞膜破坏和使脱水酶的铁-硫簇失活。然而，当前可用的基于铜的产品是铜化合物(如氢氧化铜和氯氧化铜)的悬浮液，所述铜化合物的悬浮液通过粘附到植物的叶片预防性地用于防止真菌发育。因为这些基于铜的杀真菌剂提供极少的离子铜(其是铜的杀真菌/杀细菌形式)，所以这些基于铜的杀真菌剂需要频繁施加，并含有相对大量的铜-波尔多混合物叶面喷雾剂，并且氯氧化铜产品通常含有2.5克/升的元素铜。

美国环境保护局将呈盐形式的亚磷酸(如亚磷酸钾)归类为生物农药。亚磷酸盐对卵菌和真菌具有直接和间接的作用模式。直接效应包括抑制菌丝体生长和遏止孢子形成和出芽。亚磷酸盐的间接效应包括通过还未完全阐明的机制激活植物防御响应。亚磷酸盐具有低毒性，并且类似于基于铜的杀真菌剂，它们具有以下优点：便宜、使用相对安全和通过经由多个作用位点起作用，避免抵抗性的形成。

全球的健康和环境法规对于农药残留物变得愈来愈严格。因此，全世界范围内的农民面临以下困境：需要控制破坏性病原体，这需要使用较多的杀真菌剂/杀细菌剂，而监管机构要求作物上和土壤中较少的化学残留物。通过孢子传播的植物病原性真菌提出特别困难的目标，并且当前不存在可商购的经证实杀孢子的产品。显而易见的是，如果可在孢子释放到空气中之前在被感染的植物上杀灭孢子/使孢子失活，则这将防止孢子传播并产生有效的疾病控制。

因此，存在对非植物毒性的有效且安全的杀孢子农业组合物的需要。众所周知，酸和亚硝酸钠之间的反应使得产生具有抗微生物和杀孢子活性的高反应性氮氧化物。相比于亚硝酸钠组合的单独的铜和/或锌离子或单独的亚磷酸，由本发明人使用与亚硝酸钠组合的含有铜和/或锌离子和亚磷酸的组合物实行的实验出人意料地揭示协同的抗真菌、杀孢子和杀菌核活性。重要的是，这些组合物在与亚硝酸钠组合时在杀孢子/杀菌核的浓度下不具有植物毒性。另外，这些组合物在与亚硝酸钠组合时有利地具有短暂的(至多大约6小时)杀孢子/杀菌核活性和延长的(数天到数周)抗真菌和植物防御诱导效应。此外，可以安全、有成本效益和环保的方式制备和使用这些组合物。本发明描述这类组合物。

水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani(R.solani))是分布广泛的、土传植物病原性真菌，其引起许多植物物种中的根腐病和猝倒病，以及马铃薯块茎上的黑痣病。水稻纹枯病菌形成富黑色素的菌核，所述富黑色素的菌核可在土壤中存活长时间段，并且在新近种植作物中充当初级接种物。在评定含有铜、锌和亚磷酸的组合物在对于水稻纹枯病菌的真菌生长抑制分析(通常在1到2天的培养之后检验)方面的效应的同时，本发明人注意到在1到2天的培养之后，在保持多于一周的培养板中，在仅部分抑制水稻纹枯病菌的生长的某些组合物的浓度下抑制菌核的形成和/或成熟。这类经部分抑制的培养物通常在2到4天的培养之后变得汇合，并且在此时，由于营养素变得有限，真菌开始产生菌核，所述菌核首先显现为白色分块或物体，并且然后变成黑化的、成熟的黑色结构，所述结构甚至在已经变干的培养板中可保持存活许多个月。

进一步研究此出乎意料的观测结果，并且此处呈现的结果示出组合物中亚磷酸的存在是造成抑制菌核形成的原因。进一步的实验出人意料地揭示广泛使用的农用化学品，如亚磷酸、其盐(例如亚磷酸钾)和除草剂草甘膦(2-[(膦酰甲基)氨基]乙酸)(所述所有农用化学品均含有亚磷酸盐或膦酸盐(PO₃ ^3-)基团)全部是菌核形成的强效抑制剂。

发明内容

根据本发明，提供在与亚硝酸盐组合时包含含有铜和/或锌离子、任选地氢氧化物盐和亚磷酸的水溶液的抗微生物、杀孢子和杀菌核组合物；在优选实施例中，亚硝酸盐是亚硝酸钠。在一些实施例中，本发明包括可在对于农业应用可容易实现的浓度下抑制菌核形成的含有亚磷酸盐或膦酸盐基团(PO₃ ^3-)的化学物质。本发明的组合物抑制真菌的菌核形成，并且因此可在田地中用于防止病原性真菌的延续和发展。

前述段落已经通过引言的方式提供，而不旨在限制如本说明书和附图以及权利要求书中所描述的本发明的范围。

附图说明

将参照以下附图描述本发明，其中相似的标号指代相似的要素，并且其中：

图1描绘选择的亚磷酸盐和膦酸盐(PO₃ ^3-)化学物质的结构。

图2是描绘单独和与亚硝酸钠(NaNO₂)组合的组合物Cu-Zn#31的杀菌核效应的图示。

以具有1到100毫摩尔的亚硝酸钠的1％的储备溶液使用CuZn#31。对水稻纹枯病菌的未成熟(白色)和成熟(黑色)菌核处理10分钟，并且在2天的培养之后评定后续的在PDA上的真菌生长。NG＝无生长。

图3是描绘亚磷酸(HP)、草甘膦(GP)和氨甲基膦酸(AMPA)对水稻纹枯病菌的黑色菌核形成的效应的图示。

所示的结果是根据3次单独的实验(HP和GP)和2次单独的实验(AMPA)的平均值±标准差。

将结合优选实施例描述本发明，然而，应理解，并不旨在使本发明限于描述的实施例。相反，旨在涵盖如可以包括于如由本说明书和附图限定的本发明的精神和范围内的替代方案、修改和等效物。

具体实施方式

本发明和本文描述和设想的各种实施例包括用于与亚硝酸盐(如亚硝酸钠)组合的含有铜离子和/或锌离子与亚磷酸的组合物的迄今为止未知的协同抗微生物活性的组合物、制剂、方法和用途。将通过实例的方式描述本发明，而非进行限制。可以在阅读本说明书和查看附图之后确定对本文描述的本发明的修改、改进和添加；这类修改、改进和添加被认为包括于本发明和本文描述或设想的其各种实施例的精神和广泛范围中。

如本文所使用，抗微生物包括抗细菌、抗真菌、抗卵菌和抗病原体。杀孢子和杀菌核

在与亚硝酸钠组合时描述的组合物的抗微生物、杀孢子和杀菌核活性出人意料地比单独的铜离子(在有或没有锌离子的情况下)或单独的亚磷酸的活性更强。重要的是，这些组合物在有效的抗微生物、杀孢子和杀菌核浓度下还不具有植物毒性。由于组合物含有铜离子和/或锌离子和亚磷酸，所以它们还在耗尽与亚硝酸钠的杀孢子/杀菌核反应之后(在大约6小时之后)有利地保持如抗微生物和植物防御刺激化学物质的效用。

本发明的一个实施例涉及相比于单独的铜离子(在有或没有锌离子的情况下)或单独的亚磷酸的溶液在与亚硝酸盐(优选地亚硝酸钠)组合时的抗真菌和杀孢子活性，含有铜离子(在有或没有锌离子的情况下)和亚磷酸的组合物在与亚硝酸盐组合时的出人意料地协同的植物病原性真菌的生长抑制以及杀孢子和杀菌核活性。

在本发明的另一个实施例中，其展示含有铜盐(在有或没有锌盐的情况下)和亚磷酸的上述组合物是真菌菌核形成的出人意料地强效抑制剂。实际上，其进一步和出乎意料地展示含有亚磷酸盐或膦酸盐基团(PO₃ ^3-)的各种化学物质可在对于农业应用可容易实现的浓度下抑制菌核形成。值得注意的是，化学物质包括杀真菌剂(亚磷酸钾、亚磷酸和乙磷铝)和除草剂草甘膦，上述全部是广泛使用的农用化学品。

根据以下概述的一般程序方便地制备含有铜离子(在有或没有锌离子的情况下)和亚磷酸的组合物。本发明的这些公开的实施例例示某些优选的组合物；然而，这些实例并不旨在限制本发明的范围。如对本领域的技术人员将显而易见的，可以在不脱离本发明的精神和广泛范围的情况下进行多种改变和修改。

本发明的抗微生物组合物包含由氯氧化铜提供的铜离子的水溶液，所述氯氧化铜的两种形式为：(1)氯氧化铜技术产品(CuOCl-TP)含有大约57％的元素铜，并且1％的水中悬浮液的pH为6.2，(2)氯氧化铜可湿性粉剂(CuOCl-WP)含有大约50％的元素铜，并且1％的水中悬浮液的pH为8.3。CuOCl-WP含有大约10％的膨润土和表面活性剂以增加水不可溶的氯氧化铜的“可湿性”，使得其保持悬浮的时间比CuOCl-TP长。还可从五水合硫酸铜提供组合物中的铜离子，所述五水合硫酸铜在组合物的产生期间与CuOCl混合，或单独地制备组合物并稍后与基于CuOCl的组合物混合在一起。

组合物中的铜离子可有或没有锌离子和亚磷酸，其中任选添加氢氧化物盐以控制组合物的酸度的。在这方面中，使用氢氧化钠或氢氧化钾有时导致用CuOCl-TP或硫酸铜制备的组合物的不稳定性(浑浊、结晶)，但在用CuOCl-WP制备的组合物中不导致不稳定性。出人意料地，氢氧化铵可与所有三种铜化合物一起使用，以控制组合物的酸度，而不具有浑浊或结晶的问题，并且因此，氢氧化铵是用于组合物中的优选的氢氧化物。

表1中示出关于各种这类基于铜和铜-锌的组合物的一些观测结果。结果示出例如对于产生稳定的组合物，硫酸铜优选于氯化铜。结果还出人意料地示出对于生产仅有铜的组合物，CuOCl-WP优选于铜CuOCl-TP，这是由于后者的不稳定性(结晶)。然而，出人意料地发现锌离子的存在防止用CuOCl-TP制备的组合物中的不稳定性(结晶)。

表1.关于在室温(22℃)下制备和储存的在添加或不添加氢氧化铵(NH₄OH)的情况下具有亚磷酸(H₃PO₃)的各种铜和铜-锌组合物的稳定性的观测结果。在表中，将克(gram或grams)缩写成字母g，将毫升(milliliter或milliliters)缩写成字母ml，并且将分升缩写成字母dL。

本发明的抗微生物组合物和具体地本发明的杀孢子和杀菌核组合物包含，(i)铜离子(在有或没有锌离子的情况下)和亚磷酸的水溶液(具有任选添加的氢氧化物盐，如氢氧化钠、氢氧化钾，并且优选地氢氧化铵)，和(ii)与亚硝酸盐(优选地亚硝酸钠)的组合。

在本发明的一个实施例中，抗微生物组合物包括具有溶解于水中的氯氧化铜或五水合硫酸铜(在有或没有锌盐(优选地硫酸锌)的情况下)的溶液，其中随后将亚磷酸添加到溶液，其中任选添加氢氧化物盐(优选地氢氧化铵)以控制如此形成的酸性铜或铜-锌组合物的pH。将这些溶液标示为例如Cu-31或CuZn-43-N和Cu-32-N(N＝具有添加的NH₄OH，参见表2)。

在本发明的一个实施例中，抗微生物组合物包括具有混合于水中的氯氧化铜-WP的悬浮液，其中在添加亚磷酸之前添加在低温(20℃到50℃(更多细节参见以下实例))下增强膨润土的沉淀的氢氧化铵。

使用含有氯氧化铜、膨润土和一种或多种表面活性剂的CuOCl-WP方便地制备基于氯氧化铜的组合物。发现在添加或不添加氢氧化铵的情况下，(i)添加亚磷酸使CuOCl-WP溶解以形成稳定的溶液，和(ii)将亚磷酸添加到CuOCl-WP的悬浮液，随后在70℃到90℃下培育15分钟到30分钟促进膨润土组分的快速沉淀，留下澄清的深绿色溶液。

以下实例描述用于制备2X储备液(经酸溶解的氯氧化铜组合物(Cu-32-2X))的一般方案，所述组合物继而可用于制备如Cu-32和Cu-Zn-32的配制物。除非另行说明，否则所有化学物质得自西格玛-奥德里奇有限公司(Sigma-Aldrich Company Ltd.)(The oldBrickyard,New Road,Gillingham,Dorset SP8 4XT,UK)，除非另行说明。Hortiphyte得自Hortifeeds,Park Farm,Park Farm Road,Kettlethorpe,Lincoln LN1 2LD,UK。乙磷铝(三乙膦酸铝)和草甘膦(2-[(膦酰甲基)氨基]乙酸)得自拜耳作物科学公司(BayerCropScience)(230 Cambridge Science Park Milton Road,Cambridge CB4 0WB,UK)。氨甲基膦酸得自英国飞世尔科技公司(Fisher Scientific UK)(Bishop Meadows Road,LE115RG Loughborough,Leicestershire,UK)。亚磷酸钾购自中国武汉建设大街498号的武汉瑞今贸易有限公司(Wuhan Rison Trading Ltd.,498 Jianshe Ave,Wuhan,China)。氯氧化铜50-可湿性粉剂(CuOCl-WP)和氯氧化铜-技术产品(CuOCl-TP)得自Manica S.P.A.,4Via all'Adige,38068 Rovereto,Italy。

将10.0克的CuOCl-WP(含有50％的元素铜)添加到玻璃烧杯中的70毫升的蒸馏水中；电磁搅拌器和搅拌棒用于混合并形成绿蓝色悬浮液。如果膨润土待在低温(20℃到50℃)下沉淀析出，则在此时将8.0毫升的氢氧化铵(56.6％的溶液)添加到CuOCl-WP悬浮液将出人意料地加速膨润土沉淀。逐渐地添加35.0克的亚磷酸，导致CuOCl-WP的溶解，以形成深绿色溶液，将所述深绿色溶液再搅拌5分钟，并且然后用蒸馏水将其补足到90毫升的体积。然后将溶液升温到例如37℃，保持24小时，或在此期间将CuOCl-WP配制物的膨润土沉淀析出。通过离心去除膨润土，随后倒出可溶组合物。如果膨润土待在高温(例如60℃到90℃)下沉淀，则在此时，可通过添加氢氧化铵(1毫升/升到80毫升/升)来修改酸性溶液的pH，并且然后可用蒸馏水最终将总体积调节到100毫升。

此Cu-32-2X浓缩液可与其它配制物混合以方便地制备各种其它产品。因此，为了制备Cu-32，将2X浓缩液与蒸馏水1:1混合。为了制备CuZn-32，在搅拌的情况下组合相同体积的Cu-32和Zn-32(参见表2)。

应注意，CuOCl-TP不可用于通过添加亚磷酸和任选地用碱性铵盐中和来制备稳定的仅有铜的组合物，因为(在添加或不添加氢氧化铵的情况下)用CuOCl-TP制备的这类组合物在几天内结晶析出(参见表1)。然而，通过制备CuOCl-TP和锌盐(优选地硫酸锌)在水中的悬浮液，随后(在添加或不添加氢氧化铵的情况下)添加亚磷酸来制备的基于铜-锌的组合物是出人意料地稳定的组合物，其有利地甚至在若干周之后也不示出结晶的迹象，并且不需要时间和/或加热来沉淀析出膨润土，如同上述基于CuOCl-WP的组合物一样(参见表1)。

优选地用氢氧化铵制备含有硫酸铜的组合物。

此外，在没有任何明显的抗微生物活性改变的情况下，可将用氯氧化铜(-WP或-TP)制备的基于铜和铜-锌的组合物与用硫酸铜制备的基于铜和铜-锌的组合物，以在1:1到1:100的范围内的比例组合，如根据通过以不同比率组合Cu-31和Cu-32制备的各种组合物所示出(如表2所示)。

对于基于铜和铜-锌的组合物，优选的是，组合物中元素铜和锌的总浓度为1克/升到50克/升等级。

在基于铜-锌的组合物中，元素铜浓度与元素锌浓度的比率可以为100:1到1:100等级，优选地10:1到1:10，并且甚至更优选地1:1。

如果氢氧化物盐(优选地氢氧化铵)溶液的浓度为14.5摩尔，那么以1毫升/升到80毫升/升的等级将其添加到组合物。

所选择用于组合物的酸是亚磷酸。优选的是，组合物中亚磷酸的浓度为40克/升到800克/升等级。

用于组合物的优选的溶剂相是蒸馏水或去离子水。

对于基于上述方案的其它基于氯氧化铜的组合物的实例，参见表2。

在本发明的一些实施例中，基于氯氧化铜与基于硫酸铜的铜和铜-锌组合物可以1:100到100:1的比率组合。由于氯氧化铜通常比硫酸铜昂贵很多，并且产生相关联的组合物的方案更复杂，所以这类组合物可以为适用的不仅是因为其实用，而且是因为其有成本效益。

对于基于此方案的其它经亚磷酸溶解的Cu#、Cu-Zn#和Zn#组合物的实例，参见表2。在表中，将克缩写成字母g，将毫升缩写成字母ml。

表2.组合物和其组分以及其关于培养基中水稻纹枯病菌的生长的50％抑制性浓度(IC₅₀)的实例。

*组合物不含有碱性铵盐(例如Cu-32)，或任选地在亚磷酸之后添加氢氧化铵以增加组合物的pH(例如Cu-32-N)。**将用#标示的组合物制备为用亚磷酸溶解的不可溶金属-铵络合物。***在22℃下在培养24小时之后，在马铃薯葡萄糖琼脂上抑制50％的水稻纹枯病菌的生长所需要的组合物的浓度(IC₅₀)。^&1:1混合物含有总共2.5g/dL的元素铜(来自CuSO₄.5H₂O组合物的1.25g/dL和来自CuOCl-WP组合物的1.25g/dL)，并且基于Cu-31和Cu-32的结果具有针对水稻纹枯病菌的预期的IC₅₀，10:1和100:1的Cu-31:Cu-32混合物同样如此。^sCuZn#12在大多数实验中用作内标物。⁺等同于Cu#28、Zn#4和CuZn#12中的浓度。

设想为了在农业中实际地用作叶面喷雾剂，例如，将在混合或搅拌的情况下，将组合物的储备溶液添加到水中，以稀释到例如100倍到1,000倍。然后将在持续搅拌或混合的情况下添加合适量的亚硝酸钠储备溶液(例如690克/升(10M)，以稀释到例如200倍，以在组合的产品中产生50mM的最终浓度。然后可以以合适的浓度将合适的助剂、粘展剂、佐剂、载剂、表面活性剂或增量剂添加到有效量的组合的产品。

为了可以由本领域的技术人员示出、更易于理解和容易地实行本发明，本发明的实施例现将仅通过非限制性实例的方式呈现并参照附图描述。

实例1.用组合物进行真菌生长抑制分析。

真菌生长抑制分析。将水稻纹枯病菌菌株从马铃薯表皮上的菌核中分离，并且将其在室温(22℃)下在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养维持。为了评定组合物对真菌生长的效应，将10微升的稀释于无菌蒸馏水中的测试组合物放置于12孔组织培养板的孔中，并通过移液管将1毫升的PDA添加到每个孔中。摇动培养板以使测试组合物均匀地分布在整个琼脂中(单独的蒸馏水用作对照组)，并且然后使琼脂凝结。使用刮刀从建立的真菌培养物切割出含有真菌菌丝(3毫米×3毫米)的琼脂棒，并插入在12孔培养板的每个孔中的琼脂中心所切的孔洞中，然后在室温下进行培养。为了评定组合物对径向真菌生长的效应，在90°角度下使用直尺两次测量真菌菌丝的直径，并且计算平均直径(毫米)。以图形方式确定抑制水稻纹枯病菌径向生长50％所需要的组合物浓度(IC₅₀)。

结果：

如表2所示，各种Cu、CuZn、Cu#和Cu-Zn#组合物的IC₅₀值全部在储备溶液的0.14％到0.28％(储备溶液分别稀释大约700倍到350倍)的范围内，这表明制备组合物的方法和铜的来源不显著地更改组合物抑制培养基中的植物病原性真菌水稻纹枯病菌生长的能力。另外，基于氯氧化铜和硫酸铜的铜(和CuZn)组合物可以在广泛的浓度范围内混合在一起，并且仍然维持充分的抗真菌活性。

值得注意的是，组合物比制备其的组分更具活性。CuOCl-WP、CuOCl-TP、硫酸铜、硫酸锌和亚磷酸针对水稻纹枯病菌的IC₅₀值分别为2.0％、1.8％、0.39％、0.33％和0.64％，因此事实是所有的组合物的IC₅₀值(大约0.15％)显著低于将在组合铜组合物和亚磷酸时所预期的；这指示组分在一起组合在所描述的组合物中时的协同作用。此协同作用对于氯氧化铜衍生的组合物特别明显，因为CuOCl-WP和CuOCl-TP的IC₅₀值特别低，分别为2.0％和1.8％，并且亚磷酸的IC₅₀为0.64％，而Cu-32和Cu-32-T的IC₅₀值分别为0.19％和0.17％。综合而言，示出组成部分在组合在组合物中时的协同活性的这些结果出人意料地揭示使用以上在“具体实施方式”部分中描述的方案制备的这些组合物的增强的抗微生物效力。

还值得注意的是，铜-锌(CuZn)组合物存在特定的优点：(i)可商购的基于铜的杀真菌剂(例如波尔多混合物、氯氧化铜、氢氧化铜和氧化铜)通常在经稀释例如用于叶面喷雾时含有大约2.5克/升的元素铜。这些产品中的铜盐很大程度上不可溶并且处于悬浮状态，因此产品粘附到植物的叶片上；当下雨并且叶片上的产品变得湿润时，释放少量的活性离子铜，并且所述离子铜具有抗微生物活性。下雨的副作用是其将铜悬浮液从叶片冲洗到地面上，因此需要频繁施加这些产品。

表2中描述的仅有铜的组合物中的大多数在100X储备溶液中含有25克/升的元素铜(分别为4.4克/分升、5克/分升和10克/分升的CuOCl-TP、CuOCl-WP和硫酸铜)，因此组合物的1:100稀释的叶面喷雾剂将含有比典型商业产品低10倍的0.25克/升的元素铜。组合物中离子铜(和锌)的存在(除了与亚磷酸的协同抗微生物效应以外)部分地解释在抑制水稻纹枯病菌的生长方面与悬浮液产品CuOCl-WP和CuOCl-TP相比，为什么它们甚至在存在水的情况下的PDA培养基中具有如此高得多的活性(10倍到15倍)(参见表2)。另外，当前基于铜的产品的悬浮液倾向于沉降，并且可堵塞喷雾设备，然而所描述的组合物是更适合与喷雾设备一起使用的离子溶液。

在一个季节中通常对作物(如葡萄树和马铃薯)喷雾10次到15次，而本文所述的用作喷雾处理剂的Cu或CuZn组合物在整个季节处理中将含有的铜大约等于一次施加的可商购的基于铜的产品。通常仅用相当的仅有铜的组合物中含有的铜的量的50％制备CuZn组合物(例如参见表2中的Cu#28和CuZn#12)，而作为抗真菌组合物，它们在活性上相当；这意味着将铜浓度减少到商业的基于铜的产品的铜浓度的l/20。公认为必须频繁地施加大量的商业的基于铜的杀真菌剂(不可溶、非离子铜)有效，而这导致大量潜在有毒的铜通过雨水或浇水被冲洗到土壤中。

耕作的农业土地(其中不使用基于铜的杀真菌剂)通常缺乏微量营养素，如铜和尤其是锌(Sillinpaa.M.(1982)土壤的微量营养素和营养素状态：全球研究(Micronutrientsand the nutrient status of soils:A global study).《联合国粮食与农业组织土壤公报(FAO Soils Bulletin)》,No.48.意大利罗马的联合国粮食与农业组织(FAO,Rome.Italy))，并且因此本文描述的CuZn组合物在施加到植物时可提供有效营养量的这些微量营养素。

实例2.用组合物和亚硝酸钠进行的杀真菌分析。

杀真菌分析。从马铃薯葡萄糖琼脂(FDA)上的稻瘟病菌培养物切割含有真菌菌丝(3毫米×3毫米)的琼脂棒，并将其放置于含有75微升的各种浓度的亚硝酸钠或无菌蒸馏水(DW)的96孔培养板的孔中。为了开始反应，将75微升的组合物(稀释于DW中)添加到孔。在去除液体时，小心地摇晃培养板并在室温下培育30分钟，并且添加150微升的的CM-1介质5分钟，以终止反应。去除CM-1介质，并且将琼脂棒插入到切入9厘米皮氏培养皿中的PDA的孔洞中(每个皮氏培养皿6根到7根琼脂棒)，然后将其在室温下培养4天，在此期间(在90°角度下使用直尺两次)测量真菌生长，并且计算平均直径(以毫米为单位)。如果通过眼睛不可检测到真菌生长，则通过相位显微法(40X)观测培养物以证实如通过视觉检验判定的不存在生长(NG)。

结果：

表3中的结果示出在不存在亚硝酸钠(NaNO₂)的情况下，CuZn#12和其组分(硫酸铜-硫酸锌(CuZn)和亚磷酸(H₃PO₃))在最高的测试浓度(1％的储备溶液)下对稻瘟病菌不是杀真菌的。然而，在存在10毫摩尔亚硝酸钠的情况下，通过仅30分钟的暴露，所有三种组合物示出杀真菌活性的浓度相关性增加。显而易见的是，CuZn的杀真菌性稍微低于亚磷酸，并且两者的活性显著低于CuZn#l2。关于亚磷酸的结果是出人意料的，因为从NaNO₂产生的氮氧化物是pH相关的，而亚磷酸的pH比CuZn#12低(表3)。然而，在计算CuZn和亚磷酸之间的协同作用时解释了此出人意料的结果。

为了确定在存在或不存在亚硝酸钠的情况下呈CuZn#12形式的CuZn和亚磷酸的组合活性是否是协同的，使用下式：

Sf＝M/[A+0.01×B(100-A)]

其中：Sf是协同作用因子，A是CuZn对照组％；B是亚磷酸对照组％；M是混合物CuZn#12对照组％。如果Sf>1，则存在协同作用。(参考文献：Samoucha Y和Cohen Y(1984).(在控制黄瓜的霜霉病方面甲霜灵和代森锰锌之间的协同作用(Synergy betweenMetalaxyl and Mancozeb in controlling downy mildew in cucumbers).《植物病理学(Phytopathology)》74:1434-1437)。

当计算协同作用因子值时(表3)，在与10mM亚硝酸钠组合的0.3％的组合物浓度下(Sf＝1.37)和1％的组合物浓度下(Sf＝1.57)观测到明显的协同作用。

因此，这些结果示出呈组合物CuZn#12形式的CuZn和亚磷酸的组合在与亚硝酸钠组合时协同地作用，以产生出人意料的大于预期的抗微生物/杀真菌效应。

表3.在存在和不存在10毫摩尔亚硝酸钠的情况下组合物CuZn#l2以及在相等浓度下的其铜-锌(CuZn)和亚磷酸(H₃PO₃)组分对稻瘟病菌的杀真菌效应。NG指示无生长。用蒸馏水(DW)进行的对照组真菌生长为20mm。圆括号中的对照组值％用于计算如本文中所描述的协同作用因子(Sf；值>1.0指示协同作用)。

实例3.用组合物和亚硝酸钠进行的杀孢子分析。

杀孢子分析：(1)通过用无菌蒸馏水(DW)轻缓地冲洗，从生长在9厘米皮氏培养皿中马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上的成熟培养物中分离灰葡萄孢(Botrylis cinerea(B.cinerea，也称为灰霉菌)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense(F.oxysporum；引起香蕉的巴拿马病)的孢子。使含有孢子的溶液通过40微米过滤器以去除残渣，并且将滤液调节到2×10⁶个(灰葡萄孢)或5×10⁶个(尖孢镰刀菌)孢子/毫升DW。将十微升的亚硝酸钠(溶解于无菌DW中)或DW的样品添加到含有10微升的孢子溶液的48孔组织培养板的孔。为了开始反应，添加组合物(时刻＝0)，并且通过小心地摇晃培养板充分地混合反应物。在室温下培育30分钟之后，通过添加在60℃下的1毫升的PDA终止反应。然后将培养板在室温下培养3到4天，在此期间视觉地评定真菌生长。如下对真菌生长进行评分：等于对照组培养物(在DW的情况下)的真菌生长评分为2。如果真菌生长明显地小于对照组，则其评分为1。无真菌生长评分为0。当紧接在组合物之后(在2秒内)添加PDA时，不管使用的亚硝酸钠的浓度(至多100毫摩尔)或组合物的浓度(至多1％的储备溶液的稀释液)如何，都未观测到真菌生长，示出PDA甚至在实验中使用的NaNO₂的最高浓度(100mM)和CuZn#12的最高浓度(1％)下有效地抑制反应。

(2)为了评定单独的组合物的杀孢子效应，使灰葡萄孢孢子(1×10⁴)暴露于在22℃下微量离心管中的各种浓度的组合物或DW。在1小时暴露之后，用1ml的DW冲洗孢子两次，并且然后将其悬浮于PDA中，并培育6天，在此期间如表4中所描述的评定真菌生长。

结果：

表4中的结果示出组合物CuZn#12、Cu#28、Zn#4在10％的储备溶液下是轻微杀孢子的，但在较低的浓度下不是杀孢子的，而组合物Cu-32示出在10％和5％的储备溶液下轻微的杀孢子活性，但在较低的浓度下不示出杀孢子活性。Cu#32更大的杀孢子活性可通过其亚磷酸的浓度(17.5克/分升)与其它3种组合物(4克/分升；参见表2)相比更高来解释。

表4.在不存在亚硝酸钠的情况下在22℃下培育1小时之后，组合物针对灰葡萄孢的孢子的杀孢子效应。暴露于蒸馏水1小时的孢子是对照组*。在经处理的孢子悬浮于马铃薯葡萄糖琼脂中6天之后评定真菌生长。

2.考虑到使用的高浓度，表4中示出的实验中测试的4种组合物的杀孢子效应是相对弱的(组合物经设计在<1％的储备溶液下使用)。然而，因为组合物由于亚磷酸的存在而是酸性的，所以预期它们在与亚硝酸钠组合时可以示出增加的杀孢子活性，因为接着发生的反应将产生亚硝酸，所述亚硝酸释出已知是杀孢子的高度反应性的氮氧化物。

表5中的结果示出单独的亚硝酸钠(NaNO₂+DW)和所有的单独的组合物(NaNO₂＝0)在任何测试浓度下不具有针对灰葡萄孢的孢子的杀孢子活性(所有评分为2＝对照组生长)。硫酸铜(Cu)、硫酸锌(Zn)、硫酸铜与硫酸锌(CuZn)仅在存在100mM亚硝酸钠的情况下示出杀孢子活性，而亚磷酸在1％(等于其在1％的3种组合物中的浓度)下是活性的，但在较低的浓度下示出极小的活性。在具有亚硝酸钠的情况下，所有3种组合物在杀孢子活性方面均示出浓度相关性增加。最活性的组合物是Cu#28，之后是CuZn#12和Zn#4。CuZn#12的杀孢子活性大于从其组分Cu-Zn和亚磷酸中所预期的(如杀真菌实验中所论述-参见表3)，尽管均在存在和不存在100毫摩尔亚硝酸钠的情况下后者具有比CuZn#12低的pH。由于Cu#28的杀孢子性显著高于CuZn#l2和Zn#4(尽管3种组合物的pH值类似)，其显现在存在亚硝酸钠的情况下，组合物Cu#28和CuZn#12(后者的活性比Cu#28低，可能是由于存在仅一半浓度的铜离子-参见表2)中铜的存在，结合亚磷酸一起导致杀孢子活性的出人意料的增强，这与简单的pH问题不相关。

时程实验揭示(i)在混合100毫摩尔亚硝酸钠和CuZn#12(1％的储备溶液)的1分钟内产生有效的杀孢子活性，和(ii)在混合反应物之后大约6小时杀孢子活性被用尽(数据未示出)。

用各种组合物和硝酸钠或脲进行的实验未示出对灰葡萄孢的孢子的杀孢子活性的迹象(数据未示出)，因此用于在与组合物组合时产生杀孢子活性的优选的化合物是亚硝酸钠。

表5.在有和没有亚硝酸钠(NaNO₂)的情况下三种组合物以及其组分：硫酸铜(Cu)、硫酸锌(Zn)、硫酸铜和硫酸锌(CuZn)以及亚磷酸(H₃PO₃)针对灰葡萄孢的孢子的杀孢子活性。还示出在有和没有100毫摩尔亚硝酸钠的情况下的选择的1％溶液的pH值。

表6中的结果示出硫酸铜和氯氧化铜-WP在与在至多30毫摩尔浓度下的亚硝酸钠(单独的100毫摩尔亚硝酸钠对尖孢镰刀菌孢子是杀孢子的，数据未示出)组合时不具有杀孢子活性。2种测试的组合物(Cu-31和Cu-32)分别含有作为其铜盐的硫酸铜和CuOCl-WP，与17.5克/分升的亚磷酸(表2)，并且当相比于在与在相等浓度下的亚硝酸钠组合时两种组合物的单独的组分时，两种组合物在与亚硝酸钠组合时展示协同杀孢子活性。

通过示出在与亚硝酸钠组合时，甚至在简单组合物中的2种不同的铜盐与亚磷酸一起展示与其单独的组分相比协同增强的杀孢子活性，这些结果证实和扩大在表5中的结果。

表6.在有和没有亚硝酸钠(NaNO₂)的情况下两种组合物和其组分：硫酸铜(CS；在Cu-31中)、氯氧化铜-WP(CuOCl；在Cu-32中)和亚磷酸(H₃PO₃)针对尖孢镰刀菌的孢子、针对灰葡萄孢的孢子的杀孢子活性。

综合而言，这些结果对在田地中这些杀孢子组合物的潜在用途具有重要暗示。众所周知，酸化的亚硝酸钠产生亚硝酸，所述亚硝酸继而分解成杀孢子的氮氧化物。然而，此处呈现的结果示出在与亚硝酸钠组合时，含有亚磷酸的基于铜(和基于铜-锌的组合物出人意料地比单独的相等浓度的亚磷酸具有更大的杀孢子活性。

此外，使用本发明组合物(在有亚硝酸钠的情况下)作为例如叶面喷雾剂将不仅发挥可在孢子释放到空气中之前杀灭孢子并从而降低相关联真菌感染的传播的杀孢子效应，而且当杀孢子反应用尽时(在大约6小时之后)，将存在由保持在经处理的植物上的基于铜或铜-锌和亚磷酸的组合物提供的继续、持久性抗微生物和植物防御刺激活性。

当将含有1％的组合物CuZn#12和50毫摩尔亚硝酸钠的叶面喷雾剂混合物持续5天，每日两次喷雾到10天龄的水稻幼苗上时，与用单独的水喷雾的对照组水稻幼苗相比，不存在对幼苗生长的明显效应，并且未观测到萎黄病。有趣的是，当对其玫瑰花蕾受蚜虫(绿蚜虫和豆蚜)侵染的玫瑰植物使用相同的叶面喷雾剂时，发现昆虫在喷雾5分钟内死亡；在接下来几天对经喷雾的玫瑰植物的观测结果示出植物和玫瑰花蕾两者都不被喷雾剂破坏。

综合而言，这些结果示出与亚硝酸钠组合的组合物对水稻幼苗或玫瑰植物不是植物毒性的，同时喷雾剂是针对蚜虫的有效杀昆虫剂。因此，本发明的各种实施例包括本文描述的用作杀昆虫剂的组合物。

实例4.用组合物和亚硝酸钠进行杀菌核分析。

杀菌核分析。从培养6天到8天的水稻纹枯病菌切割含有白色未成熟菌核(3毫米×3毫米)的琼脂棒，而从13天龄的水稻纹枯病菌培养物切下成熟黑化的(黑色)菌核(大约10毫米×3毫米)并用刮刀将其切割成2毫米×3毫米块。然后将菌核样品放置于含有75微升的各种浓度的亚硝酸钠或无菌蒸馏水(DW)(作为对照组)的96孔培养板的孔中。为了开始反应，将75微升的CuZn#3l(稀释于DW中)添加到孔。在小心地去除液体时，小心地摇晃培养板并在室温下培育10分钟，并且添加150微升的CM-1介质5分钟，以终止反应。去除CM-1介质，并且将琼脂棒小心地插入到切入9cm皮氏培养皿中的PDA的孔洞中(每个皮氏培养皿4根棒)，然后将其在室温下培养，直到在90°角度下使用直尺两次测量真菌生长，并且计算平均直径(以毫米为单位)。如果通过眼睛不可检测到真菌生长，则通过相位显微法(40X)观测培养物以证实如通过视觉检验判定的不存在生长(NG)。

结果：

图2中的结果示出通过仅10分钟暴露，CuZn#31(1％)和亚硝酸钠(1毫摩尔到100毫摩尔)的组合对水稻纹枯病菌的未成熟(白色)和成熟(着黑色的)菌核均是浓度相关性地杀菌核的。白色菌核对试剂的组合比黑色菌核更敏感。由于真菌生长类似于对照组(0)中所见的，单独的CuZn#31(1％+0)和单独的亚硝酸钠(0+100)对白色菌核或黑色菌核的杀菌核效应极小或不明显，示出产生氮氧化物对于观测到的杀菌核活性是必需的。

值得注意的是，天然存在于马铃薯田地中的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae(V.dahliae))的微菌核大部分(约90％)在直径上小于125微米(Smith VL和Rowe RC.《植物病理学》74:553-556,1984)，并且很可能微菌核将比此处使用的2毫米×3毫米成熟菌核块更易受与亚硝酸钠组合的Cu-Zn#31的杀菌核效应的影响。

表7中的结果示出在存在和不存在增加浓度的亚硝酸钠的情况下，四种类似的组合物(其组分在表7中示出)针对水稻纹枯病菌的黑化的(黑色)菌核的杀菌核活性。在没有亚硝酸钠(0+1％)的情况下，没有组合物是杀菌核的，并且同样地，在最高浓度的测试的亚硝酸钠(30+0)不是杀菌核的。然而，所有四种组合物示出杀菌核活性随着亚硝酸钠浓度的增加而剂量相关性地增加，指示产生氮氧化物对于观测到的杀菌核活性是必需的。总体上，四种组合物具有类似的杀菌核活性(通过菌核在处理之后在PDA上培养时产生菌丝的能力进行测量)，其中含有硫酸铜的两种组合物的活性比含有氯氧化铜的那些稍高。在有30毫摩尔亚硝酸钠的情况下，所有四种组合物是完全杀菌核的，如用组合物CuZn#31所见(图2)。

表7.在有和没有亚硝酸钠(NaNO₂)的情况下，四种组合物针对水稻纹枯病菌的黑色(黑化的)菌核的杀菌核活性。将经处理的菌核在PDA上培养2天，在此期间测量径向菌丝生长(以毫米为单位)。在表的底部处示出组合物的组分。

**两种化合物在指示的浓度下都提供2.5g/dL的元素铜

实例5.真菌菌核形成的抑制。

真菌生长抑制和菌核形成抑制分析：将在这些实验中使用的水稻纹枯病菌菌株从马铃薯上的菌核中分离，并将其在室温(22℃)下维持在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上培养。为了评定组合物对真菌生长的效应，将10微升的测试组合物(稀释于无菌蒸馏水中)放置于12孔组织培养板的孔中，并通过移液管将1毫升的PDA添加到每个孔。摇动培养板以使测试组合物均匀地分布在整个琼脂中(单独的蒸馏水用作对照组)，并且然后使琼脂凝结。使用刮刀从建立的真菌培养物切割出含有真菌菌丝(3毫米×3毫米)的琼脂棒，并将其插入到切入12孔培养板的每个孔中的琼脂中心的孔洞中，然后在室温(22℃)下对其进行培养。为了评定组合物对径向真菌生长的效应，在90°角度下使用直尺两次测量真菌菌丝的直径，并且计算平均直径(以毫米为单位)。如果通过眼睛不可检测到真菌生长，则通过相位显微法(40X)观测培养物以证实如通过视觉检验判定的不存在生长(NG)。

为了评定化合物和组合物对菌核形成的效应，每日检验水稻纹枯病菌培养物，并测量径向真菌生长直到培养物汇合，在这之后记录白色(未成熟)菌核和成熟(着黑色的)菌核的发育，并在培养的第10天计数成熟菌核的数量。

结果：

表8中的结果示出组合物Cu-32(含有亚磷酸)完全抑制水稻纹枯病菌培养物中未成熟和成熟菌核的形成。尽管Cu-32在培养的第1天(和第2天)部分地抑制水稻纹枯病菌的径向生长，在培养的第3天生长汇合，但是在所有三种浓度下菌核形成完全不存在。组合物Cu-32-PO4(含有磷酸)还部分地抑制水稻纹枯病菌的生长，但是一旦达到汇合，就在两种较低的测试浓度下形成白色菌核，并且然后形成黑色菌核，如在对照组培养物(在有蒸馏水的情况下)中所见。在最高测试浓度下，在抑制生长和防止白色和黑色菌核形成上，Cu-32-PO4类似于Cu-32。组合物Cu-36(含有硫酸)是水稻纹枯病菌生长的最低效抑制剂，并且在所有3种测试浓度下，在时程和数量方面，菌核形成非常类似于对照组培养物。

这些结果明显地示出Cu-32是菌核形成的最强效抑制剂，其中Cu-32-PO4在最高测试浓度下具有相同的效应，并且Cu-36对菌核形成的效应极小。由于除了使用的酸以外，三种组合物是相同的，并且具有类似的pH值(表8图例)，结果出人意料地示出为了最佳地抑制水稻纹枯病菌的菌核形成，组合物中需要存在亚磷酸。

表8.三种组合物(仅在它们含有的酸方面不同)对水稻纹枯病菌的径向生长和菌核形成的效应。

组合物pH(以1:1000稀释于蒸馏水中，等于0.1％vol/vol的储备溶液)：Cu-32＝2.69；Cu-32-PO4＝2.63；Cu-36＝2.46。

*除使用的酸以外，组合物是相同的-参见表1；(％)＝储备溶液％。**白色/黑色SCL＝未成熟/成熟(着色的)菌核。

表9中的结果示出在40毫克/升和更高的浓度下，亚磷酸和其碱金属盐(亚磷酸钾)两者都完全抑制水稻纹枯病菌形成成熟(着黑色的)菌核。在这些浓度下，两种产品仅是真菌生长的适中抑制剂，因此不管真菌生长如何，发生亚磷酸盐对菌核形成的抑制性效应。

商业亚磷酸钾产品通常在大约4克/升的浓度下用作叶面喷雾剂，以刺激植物针对病原体侵袭的防御；此浓度高于完全防止培养基中水稻纹枯病菌的菌核形成所需要的浓度(40毫克/升)100倍。

表9.亚磷酸和亚磷酸钾对水稻纹枯病菌的径向生长和菌核形成的效应。

*白色/黑色SCL＝未成熟/成熟(着色的)菌核。

表10中的结果示出Hortiphyte和乙磷铝(分别含有亚磷酸钾和三乙膦酸铝(膦酸盐)的商业产品)在调节到相等的亚磷酸盐浓度时具有与亚磷酸几乎相同的对水稻纹枯病菌的生长和菌核形成的效应。

Hortiphyte作为液体肥料出售，其提供氮的来源并以亚磷酸钾的形式提供钾以及磷的来源。乙磷铝作为杀真菌剂出售，并且其含有呈三O-乙基膦酸铝形式的PO₃ ^3-基团。

这些结果表明对于亚磷酸盐/膦酸盐基团(PO₃ ^3-)抑制培养基中水稻纹枯病菌的菌核形成重要的是其浓度，而不是其存在的形式。

表10.3种不同形式的磷酸盐(PO₃ ^3-)对培养基中水稻纹枯病菌的径向生长和菌核形成的效应。

*所有组合物经调节具有等量的磷酸盐/膦酸盐基团(PO₃ ^3-)。Hortiphyte含有亚磷酸钾(25％)。乙磷铝是三O-乙基膦酸铝或三乙膦酸铝(80重量％)。**白色/黑色SCL＝未成熟/成熟(着色的)菌核。

表11中的结果示出亚磷酸是比草甘膦或氨甲基膦酸(AMPA)(其是草甘膦的土壤微生物分解产品)更强效的真菌生长(在培养的第1天)和菌核形成(在培养的第10天)的抑制剂。由于可溶性问题，AMPA仅可在1克/升的最高浓度下进行测试，在所述最高浓度下，其在对水稻纹枯病菌生长和菌核形成的活性方面类似于草甘膦，但是其活性显著低于亚磷酸。

图3示出在亚磷酸、草甘膦和AMPA的情况下根据2到3次重复实验形成的黑色菌核的数量。显而易见，在抑制水稻纹枯病菌的黑色菌核形成上，亚磷酸的活性比草甘膦高大约20倍并且比AMPA高大约30倍。

亚磷酸和亚磷酸盐通常在4g/l的浓度下用作叶面喷雾剂，但是如表9和表11中所示，在此浓度的1/100(40毫克/升)下，两种产品完全抑制菌核形成。推荐在这些实验中测试的草甘膦产品在8克/升(含有6.8克/升的活性成分)下用作叶面喷雾剂，但是仅在此浓度的l/3到l/10下发生菌核形成(尽管与对照组相比在降低的水平)。

然而，尽管草甘膦(除草剂)和亚磷酸盐(杀真菌剂/植物防御诱导剂)在农业中具有非常不同的用途，但是实际上潜在重要的是，单独使用的任一产品可相应地在比作为叶面喷雾剂用于产品的最初农业应用所使用的浓度低10倍到100倍的浓度下明显地抑制菌核形成。

在其中组合亚磷酸和草甘膦的其它实验中，不存在对于任一化合物对另一种化合物的协同或抑制性效应的证据(数据未示出)；组合的效应是叠加的，并且由亚磷酸主导，如从表11和图3中示出的结果可以预期的。由于发现草甘膦和亚磷酸以及其钾盐在溶液中是相容的，例如草甘膦和亚磷酸钾的组合还可在田地中用作有效的除草剂/菌核形成抑制剂产品，这尤其是因为两种产品在作为叶面喷雾剂施加在植物上时是高效的。

表11.亚磷酸、草甘膦和氨甲基膦酸(AMPA)对培养基中水稻纹枯病菌的径向生长和菌核形成的效应。

*推荐草甘膦在8g/L(其表示6.8g/L的活性成分)下用作叶面喷雾剂。^$AMPA是氨甲基膦酸。**白色/黑色SCL＝未成熟/成熟(着色的)菌核。

众所周知，亚硝酸钠的酸化导致产生反应性、杀生物的氮氧化物，尽管亚硝酸钠组合的单独的铜盐或单独的铜盐和锌盐的溶液仅是弱抗微生物(表3)或杀孢子(表5)的，但是本文呈现的结果明显地展示新颖的具有亚磷酸的基于铜和铜-锌的离子组合物出人意料地比相等浓度的单独的亚磷酸在与亚硝酸钠组合时，具有更大的协同抗微生物活性(表3)、杀孢子活性(表6)和杀菌核活性(表7)。

描述的各种基于铜和铜-锌的离子组合物是有效的抗微生物产品，如由其抑制真菌水稻纹枯病菌的生长的能力所示，其中IC₅₀值在储备溶液的0.14％到0.28％的范围内(表2)，指示制备组合物的方法不极大地影响组合物的强效的抗微生物活性。另外，基于氯氧化铜和硫酸铜的铜(和铜-锌)组合物可在维持充分的抗微生物活性的同时，在广泛的浓度范围上制备或混合在一起。出乎意料地，含有铜离子或铜和锌离子以及亚磷酸的组合物比制备它们的组分更抗微生物(参见表2)。综合而言，这些结果展示组合物相比于其组分的协同活性，并指示如“具体实施方式”部分中所描述来配制的组合物的抗微生物效力出人意料地增强。

重要的是，当组合物与亚硝酸钠组合时，其抗微生物活性和杀孢子活性都协同地增强(相应地，表3和表5)。用作例如叶面喷雾剂的这类组合物将不仅发挥可在真菌孢子释放到空气中之前杀灭所述真菌孢子并从而降低相关联真菌感染的传播的杀孢子效应，而且当杀孢子反应用尽时(在大约6小时之后)，将存在由保持在经处理的植物上的组合物的铜或铜-锌和亚磷酸组分提供的继续、持久性抗微生物和植物防御刺激活性。还应当可以通过包括缓慢释放形式的亚硝酸钠延长组合物的杀孢子反应。如果制备和施加杀孢子组合物所需要的时间大于6小时，则这将是有益的。

此外，组合物与亚硝酸钠的组合(单独的两者中的任一个都不是杀菌核的)还出人意料地展现协同杀菌核活性(表7)。实际上，通过仅10分钟暴露，用组合物(以1:100稀释(1％)的其储备溶液)和30毫摩尔亚硝酸钠的组合实现完全的杀菌核活性。这些结果表明这类组合物可以有效地在田地中，不仅通过首先抑制真菌生长，而且通过在耕耘之前杀灭死亡植物材料中的菌核(否则其将导致有害、长期的土壤菌核污染)，来用于防止菌核形成。

菌核形成真菌(如水稻纹枯病菌、大丽轮枝菌和菜豆壳球孢菌(M.Phaseolina)是用于生产莴苣、马铃薯、菠菜和草莓的田地的土壤中的主要问题。现在禁止或正淘汰通过熏蒸杀灭土壤中的菌核，但是不存在当前可用的有效替代策略。组合物与亚硝酸钠的组合是杀菌核的，并且强有力地抑制真菌生长，使得首先不可形成菌核；另外，组合物中的亚磷酸示出在一定的浓度(≥40毫克/升)下抑制菌核形成，所述浓度显著低于在杀真菌浓度的组合物中存在的浓度(在1％的储备溶液下，亚磷酸的浓度通常在400毫克/升到1,750毫克/升的范围内-参见表2)。

除了亚磷酸以外，还展示的是，含有亚磷酸盐或膦酸盐(PO₃ ^3-)基团的广泛使用的农用化学品的亚磷酸钾、草甘膦和乙磷铝全部都是菌核形成的抑制剂。然而，亚磷酸、亚磷酸钾和乙磷铝是最强效的菌核形成抑制剂，并且由于这些是便宜和广泛使用的产品，可合理地预期的是，每日以低浓度在供水系统(如喷雾器、滴洒管线或枢轴件)中将这些产品施加到作物可提供防止田地中真菌形成菌核的方便和有成本效益的方法。

包含含有亚磷酸盐或膦酸盐(PO₃ ^3-)的化合物的杀菌核组合物已经出人意料地示出防止真菌形成菌核。化合物可以是例如亚磷酸或其盐，例如亚磷酸钾、亚磷酸钠、亚磷酸钙、亚磷酸铜、亚磷酸铝、亚磷酸锌或亚磷酸铵，或其组合。在本发明的一些实施例中，化合物还可以是草甘膦(N-(膦酰甲基)甘氨酸)。

在本发明的一些实施例中，组合物还可以是草甘膦与亚磷酸或其盐的组合。

在本发明的另一个实施例中，与用于产生亚硝酸和氮氧化物的亚硝酸钠组合的具有亚磷酸的铜或铜-锌组合物产生具有农业应用的抗微生物(杀细菌、杀真菌)和杀孢子以及杀菌核组合物。

在本发明的一些实施例中，亚硝酸盐是亚硝酸钠或亚硝酸钾。在本发明的一些实施例中，铜盐可以是氯氧化铜或硫酸铜。在本发明的一些实施例中，铜盐可以是呈可湿性产品形式的氯氧化铜。在本发明的一些实施例中，锌盐可以是硫酸锌、乙酸锌或硝酸锌。在本发明的一些实施例中，碱性铵盐可以是氢氧化铵、氢氧化钠或氢氧化钾，优选氢氧化铵。在本发明的一些实施例中，水可以是蒸馏水、去离子水、纯化水、经过滤水、医药级水、医疗级水和反渗透水，在本发明的一些实施例中，用于制备溶液的铜盐和/或锌盐是水合的。在本发明的一些实施例中，组合物中铜与锌的比率在100:1到1:100，更优选地10:1到1:10，并且甚至更优选地1:1的范围内。在本发明的一些实施例中，组合物进一步包含助剂、佐剂、载剂、表面活性剂或增量剂。

出人意料地，不管是单独使用还是在与亚硝酸盐混合时，具有亚磷酸(PA)的Cu/CuZn组合物存在比仅具有亚磷酸(PA)的组合物更强效的抗微生物/杀真菌和杀孢子活性。亚磷酸还刺激植物防御。

在使用亚磷酸作为NaNO₂的活化剂时，由铜离子的存在产生的出人意料的杀孢子效应的增强对于农业应用是不可预见的。此外，本文的杀真菌实验示出由铜与亚磷酸的存在提供的增强的抗微生物效应是不可预测的协同效应。

然而，虽然单独的亚磷酸和亚磷酸钾(在40mg/L和更高的浓度下)是非常有效的水稻纹枯病菌的菌核形成抑制剂，但是它们是相对弱的真菌生长抑制剂(关于水稻纹枯病菌的IC₅₀值分别为大约250mg/L和400mg/L)，并且在小于通常用作叶面喷雾剂的4克/升的浓度下，单独的两种产品都不是杀孢子或杀菌核的。因此，在田地中使用本文描述的组合物(在有或没有亚硝酸钠的情况下)中的一种存在显著的优点。

有趣的是，当用作对于水稻幼苗和玫瑰植物的叶面喷雾剂时，与亚硝酸钠组合的组合物不是植物毒性的，并且对于受蚜虫侵染的玫瑰植物，发现组合物是快速杀昆虫的。

理想地，农用化学品应当在使用上容易和安全、环保以及便宜和有效。就此而言，与亚硝酸钠组合的本组合物是有利的，因为组合物便宜和使用相对安全，并且由于它们含有的铜的水平比大多数当前可用的基于铜的农用化学品低得多(在1％的储备溶液稀释液下低大约10倍)，组合物是环保的。

Claims (20)

1.一种还抑制真菌菌核形成的抗微生物组合物，包含：

含有在1到50克/升范围内的元素铜的氯氧化铜水悬浮液；

按40到800克/升添加到所述氯氧化铜水悬浮液中的亚磷酸；

与水中的氢氧化物盐组合。

2.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含五水合硫酸铜，其中所述组合物中总的元素铜在1到50克/升的范围内。

3.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含水中的锌盐。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述锌盐选自七水合硫酸锌、无水硫酸锌、乙酸锌和硝酸锌，所述锌盐向所述组合物提供总共1到50克/升的元素锌。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述组合物中铜与锌的比在1:1的范围内。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述水选自蒸馏水、去离子水、纯化水、过滤水、医药级水、医疗级水和反渗透水。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氢氧化物盐的水溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵，其中将1到80毫升/升的氢氧化物盐溶液或更小或更大摩尔溶液或固体的等效物添加到所述组合物中，以增加所述组合物的pH。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氯氧化铜呈包含膨润土的可湿性粉剂形式，并且其中根据权利要求1所述的组合物中的所述氢氧化物盐在20到50摄氏度范围内的温度下增强膨润土的沉淀，以提供稳定的仅有铜的组合物。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氯氧化铜是需要将锌盐添加到所述组合物中以提供稳定性的技术产品。

10.一种还抑制真菌菌核形成的抗微生物、杀孢子和杀菌核组合物，包含：

含有在1到50克/升范围内的元素铜的氯氧化铜水悬浮液；

按40到800克/升添加到所述氯氧化铜水悬浮液中的亚磷酸；

与水中的氢氧化物盐组合；与以下组合：

在组合溶液中的最终浓度为10到100毫摩尔的亚硝酸或亚硝酸盐或固体亚硝酸盐的水溶液。

11.根据权利要求10所述的组合物，进一步包含五水合硫酸铜，其中所述组合物中总的元素铜在1到50克/升的范围内。

12.根据权利要求10所述的组合物，进一步包含水中的锌盐。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述锌盐选自七水合硫酸锌、无水硫酸锌、乙酸锌和硝酸锌，所述锌盐向所述组合物提供总共1到50克/升的元素锌。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物中的铜与锌的比在1:1的范围内。

15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述水选自蒸馏水、去离子水、纯化水、过滤水、医药级水、医疗级水和反渗透水。

16.根据权利要求10所述的组合物，其中所述氢氧化物盐的水溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化铵，其中将1到80毫升/升的氢氧化物盐溶液或更小或更大摩尔溶液或固体的等效物添加到所述组合物中，以增加所述组合物的pH。

17.根据权利要求10所述的组合物，其中所述氯氧化铜呈包含膨润土的可湿性粉剂形式，并且其中根据权利要求1所述的组合物中的所述氢氧化物盐在20到50摄氏度范围内的温度下增强膨润土的沉淀，以提供稳定的仅有铜的组合物。

18.根据权利要求10所述的组合物，其中所述氯氧化铜是需要将锌盐添加到所述组合物中以提供稳定性的技术产品。

19.根据权利要求10所述的组合物，其中所述亚硝酸盐是亚硝酸钠，并且其中根据权利要求10所述的组合物中的铜离子增强亚硝酸钠产生NO。

20.一种抑制真菌菌核形成的组合物，包含含有亚磷酸盐或膦酸盐(PO₃ ^3-)的化合物。