CN107841492A - 一种增强型Pfu DNA聚合酶及相关应用 - Google Patents

一种增强型Pfu DNA聚合酶及相关应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在于所述增强型Pfu DNA聚合酶除了本身具有的高保真特性外，还保持了速度快的特点。这种性能的改进是由于在Pfu DNA聚合酶中引入了一种非特异性双链DNA结合结构域。本发明公开了此非特异性双链DNA结合结构域编码序列，以及增强型Pfu DNA聚合酶的基因全序列；同时也公布了表达纯化此增强型Pfu DNA聚合酶的方法，以及相应的缓冲液。本发明提供的增强型Pfu DNA聚合酶能解决Pfu DNA聚合酶本身扩增速度慢的缺点，使其延伸速度达到了野生型的10倍，同时保持其保真性。

Description

一种增强型Pfu DNA聚合酶及相关应用
技术领域
本发明涉及一种Pfu DNA聚合酶，特别是涉及一种增强型Pfu DNA聚合酶。
背景技术
PCR反应是在分子水平研究基因的最基本也是最重要的体外技术。这一重要过程是由DNA聚合酶催化而成。常见的PCR酶按其忠实性可分为高保真聚合酶，如pfu DNA聚合酶；和一般聚合酶，如taq DNA聚合酶。
高保真聚合酶，如Pfu DNA聚合酶，除了有5'->3'DNA聚合酶活性外，由于有3'->5'外切酶活性，这种校正功能使其在体外扩增上有很好的保真性，但同时也使其延生速度受到限制。
一般聚合酶，如Taq DNA聚合酶，在功能域上没有像Pfu DNA聚合酶的3'->5'外切酶活性区域，使其没有校正功能，保真性大大降低，但其速度却大大强于Pfu DNA聚合酶。
目前，大量的研究工作者试图在PCR反应中去结合Pfu DNA聚合酶的保真性和TaqDNA聚合酶的延生速度，比如在同一体系中加入两种酶。但这对于目前复杂的PCR条件来说是不够的。
本发明提供一种增强型Pfu DNA聚合酶，解决现有技术Pfu DNA聚合酶延伸速度慢的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种增强型Pfu DNA聚合酶以及一种与上述增强型Pfu DNA聚合酶配合使用的反应缓冲液。本发明的目的通过以下技术方案实现：
(一)一种增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在于所述增强型Pfu DNA聚合酶中引入了一种非特异性双链DNA结合结构域。
优选的，其特征在于所述非特异性结合双链核酸结构域为Sso7d，所述Sso7d序列如Seq ID NO：1所示。
优选的，其特征在于所述非特异性结合双链核酸结构域为HMf类蛋白。
进一步优选的，其特征在于所述Pfu DNA聚合酶序列如Seq ID NO：2所示。
进一步优选的，其特征在于引入非特异性结合双链核酸结构域所需要的蛋白连接接头序列如Seq ID NO：3所示。
(二)一种重组核酸聚合酶，其特征在于所述聚合酶是带有根据权利要求5所述蛋白连接结构域的增强型Pfu DNA聚合酶。
(三)一种表达载体，其特征在于包括根据权利要求6所述重组核酸酶序列。
(四)一种宿主细胞，其特征在于可表达包括根据权利要求7所述的表达载体。
(五)一种生产根据权利要求1所述增强型Pfu DNA聚合酶的方法，其特征在于在适合编码DNA聚合酶的核酸表达的条件下培养根据权利要求8所述的宿主细胞。
(六)一种制备用于根据权利要求1、2、3所述增强型Pfu DNA聚合酶的反应缓冲液，其特征在于所述反应缓冲液由所述反应缓冲液包括30mM Tris-HCl(pH 8.8,25℃)、80mMKCl、2mM Mg(Cl)2、0.1％(w/v)BSA、0.5％(v/v)Triton x-100。
术语定义
除非有另外的定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有如同本发明所属技术领域的普通技术人员通常了解的含义。尽管仅仅描述了示例性的方法和物质，实质上与本文描述相似的任何方法和原料都可被用于本发明的实践或试验。对本发明来说，下列术语定义如下。
术语“一”，和“该”包括复数对象，除非上下文清楚地指出别的含义。
术语“重组体”指已经通过重组方法有意识地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。
术语“重组核酸”表示通常经由内切核酸酶的核酸操作，最初在体外产生的不同于自然中的常规形式的核酸。因此线性形式的分离的增强型Pfu DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子体外产生的表达载体都被认为是本发明的重组体。一旦重组核酸被制造以及重新引入宿主细胞，它将非重组地复制，即，使用宿主细胞体内的细胞机制而不是体外操作；然而，上述核酸一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是本发明的重组体。
术语“重组蛋白质”是使用重组技术，即通过上述的重组核酸的表达制造的蛋白质，重组蛋白质典型依据至少一个或更多个特征而不同于天然存在的蛋白质。
术语“载体”指一条DNA，典型是双链的，它可以是已经插入了一条外源DNA的。所述载体可以是例如来源于质粒的。载体包含在宿主细胞中促进自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA定义为异源的DNA，其不是在该宿主细胞中天然发现的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或者编码转基因。载体用于转运外来的或异源的DNA进入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，可以产生载体及其插入的DNA的若干拷贝。另外，载体还可以包含容许插入的DNA转录为mRNA分子或相反使插入的DNA复制为多拷贝RNA的必要元件。某些表达载体还包括插入的DNA附近的序列元件，其能增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译成蛋白分子。因此插入的DNA编码的许多mRNA和多肽分子能迅速地合成。
术语“核苷酸”除指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体之外，本文中还应当理解为涉及其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其对于使用该核苷酸的特定上下文(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等效的，除非上下文明确指出不同。
术语“核酸”或“多核苷酸”指聚合体，其可以相应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合体或其类似物。其包括核苷酸诸如RNA和DNA的聚合体，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰)形式，和混合聚合体(例如包括RNA和DNA亚单位)。示例性的修饰包括甲基化，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰诸如不带电的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等)，侧面部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的键(例如α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。虽然合成形式的核酸可以包括其它键(例如，Nielsen等(((Science254：1497-1500，1991)描述的肽核酸)，典型地核苷酸单体通过磷酸二酯键连接。核酸可以是或包括，例如，染色体或染色体片段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合体、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链、或三链的，并且不局限于任何特定的长度。除非另外指出，除任何明确指出的序列之外，特定的核酸序列任选地包含或编码互补序列。
术语“非特异性结合双链核酸结构域”是指可以与双链核酸非特异性结合的蛋白质、结构域或多肽。
术语“HMf类蛋白”是指来源于古细菌的组蛋白及其修饰重组蛋白，该类蛋白质与真核生物H4组蛋白具有同源性。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明的增强型Pfu DNA聚合酶包含非特异双链DNA结合结构域，性能得到改善；
(2)本发明优选的增强型Pfu DNA聚合酶包含Sso7d，延伸速度达到了野生型的10倍；
(3)本发明所述的表达载体和宿主细胞可以稳定地表达本发明的增强型Pfu DNA聚合酶；
(4)本发明提供的反应缓冲液与本发明的增强型Pfu DNA聚合酶配合使用，可以提高增强型Pfu DNA聚合酶的退火温度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为增强型Pfu DNA聚合酶的结构示意图。
其中，各附图标记的含义为：1、非特异双链DNA结合结构域；2、蛋白结构域连接接头；3、Pfu DNA聚合酶。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供一种增强型Pfu DNA聚合酶，本发明的增强型Pfu DNA聚合酶是相对于野生型Pfu DNA聚合酶具有大大提高的延伸速度，还具有伴随的扩增能力的增加，高浓度盐离了的耐受。本发明提供的增强型Pfu DNA聚合酶其延伸速度可达1kb/min；可在更高的盐浓度下、更高的退火温度下使用增强型Pfu DNA聚合酶，来达到超过亲本酶或与其等效的性能。
如图1所示，本发明提供的增强型Pfu DNA聚合酶由非特异性结合双链核酸结构域1、蛋白结构域连接接头2和Pfu DNA聚合酶3组成。所述蛋白结构域连接接头2序列如Seq IDNO：3所示，所述Pfu DNA聚合酶3全长序列如Seq ID NO：2所示。
在pET(或者其它)过表达载体上验证的增强型Pfu DNA聚合酶双链体可以用于转化大肠杆菌，例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS，来达到增强型Pfu DNA聚合酶的高水平生产，并用标准规程来纯化。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，所述非特异性双链DNA结合结构域1替换为Sso7d，所述Sso7d序列如Seq ID NO：1所示。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于，所述非特异性结合双链核酸结构域1替换HMf类蛋白，所述HMf类蛋白为来自超嗜热古菌(Pyrococcushori koshii)的重组古菌组蛋白HphA。
实施例4
本发明也相应地提供编码增强型Pfu DNA聚合酶的重组核酸。使用编码增强型PfuDNA聚合酶的核酸可以产生各种载体。包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的任何载体可被用于实施本发明。通常，表达载体包括与编码增强型Pfu DNA聚合酶的核酸可操纵连接的转录和翻译调控核酸区域。术语“控制序列”指的是在特定的宿主生物体中为可操纵连接的编码序列的表达所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地操纵基因序列，和核糖体结合位点。此外，载体可以包含正反向调控元件(PRE)以提高转录的mRNA的半衰期。转录和翻译调控核酸区域通常适合于用来表达聚合酶的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的许多合适的表达载体和合适的调节序列。大体上，转录和翻译调节序列可以包括，例如，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活序列。在典型的实施方式中，调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。载体典型地也包括含有若干用于外源DNA插入的限制性位点的多接头区域。在特定的实施方式中，“融合标志”用于帮助纯化和随后标签/标志序列的去除(如果需要的话)，例如“组氨酸标签(His-Tag)”。然而，当从嗜温宿主(例如大肠杆菌)中纯化热激活和/或热稳定蛋白质时这些通常是不必要的，其可使用“热步骤(heat-step)”。包括编码复制序列，调节序列，表型选择基因，和所关心的突变型聚合酶的DNA的合适的载体的构建使用标准重组DNA程序制备。分离的质粒、病毒载体和DNA片段的以特定的次序切割、裁剪和连接到一起以产生需要的载体，其是本领域所熟知的。
在特定的实施方式中，表达载体包括选择性标记基因以容许转化的宿主细胞的选择。选择基因是本领域所熟知的，其随使用的宿主细胞而变。合适的选择基因可以包括，例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，其使以这些载体转化的细胞能够在这些抗生素存在的情况下生长。
实施例5
在本发明的另一方面，本发明提供包括实施例4所述的编码增强型Pfu DNA聚合酶的核酸以单独或与载体结合的形式被引入的细胞。此处“引入”或语法上的等价物表示核酸以一种适于随后的核酸整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入的方法主要由靶细胞类型支配。示例性的方法包括CaPO4沉淀，脂质体融合，电穿孔，病毒感染等。
原核生物通常用作本发明最初的克隆步骤的宿主细胞。它们对于大量DNA的迅速生产，用作为定点诱变模板的单链DNA的生产，同时筛选许多突变体和产生的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌DH5α菌株、大肠杆菌JM109菌株、大肠杆菌K12菌株94(ATCC No.31，446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC No.27，325)、大肠杆菌K12菌株DG116(ATCC No.53，606)、大肠杆菌X1776(ATCC No.31，537)和大肠杆菌B；然而大肠杆菌的诸如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539的许多其它菌株，以及许多其它种和属的原核生物包括诸如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的杆菌、诸如鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)的其它肠杆菌科和各种假单胞菌属(Pseudomonas species)的菌种全部都能用作为宿主。许多其它合适的载体也都能用作为宿主。
实施例6
在本发明的另一方面，本发明提供与实施例1-3所述的增强型Pfu DNA聚合酶配合使用的反应缓冲液。所述缓冲溶液的成份及配制如下：
组份 储液浓度 终浓度 配制1L所需量
Tris-HCl(pH 8.8,25℃) 600mM 30mM 50ml
KCl 800mM 80mM 100ml
Mg(Cl)2 1Mol 2mM 2ml
BSA 1％(w/v) 0.1％(w/v) 100ml
Triton x-100 5％(v/v) 0.5％(v/v) 100ml
无菌水 648ml
对比实施例1
在pET(或者其它)过表达载体上验证的野生型Pfu DNA聚合酶双链体可以用于转化大肠杆菌，例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS，来达到野生型Pfu DNA聚合酶的高水平生产，并用标准规程来纯化。野生型Pfu DNA聚合酶3全长序列如Seq ID NO：2所示。
实验效果评价
本发明中的重组型Pfu DNA聚合酶具有极快的延伸速度，通常野生型Pfu DNA聚合酶延伸速度为600bp/min，而本发明中的重组型Pfu DNA聚合酶速度达到7200bp/min。因此在PCR反应应用中，可以节省较多的时间，更快地完成PCR扩增。
本发明中的重组型Pfu DNA聚合酶能耐受更高的变性温度，经测试在98℃温浴1h无明显活性变化，这比普通野生型Pfu DNA聚合酶有更优良的耐热性(94℃)。在PCR扩增时，本发明的重组型Pfu DNA聚合酶可在98℃条件下进行预变性及变性，较高的变性温度可使更多的模板DNA由双链转为单链DNA，为引物结合提供更多有效模板，因此增强了PCR扩增的效率。
本发明中的重组型Pfu DNA聚合酶还耐受较高的盐离子浓度，在本发明提供的反应缓冲液中K+浓度高达80mM，远高于一般的50mM浓度。对高盐离子的耐受性使本发明的DNA聚合酶能应用到各种不同方法制备的DNA模板中的同时，还能保证扩增反应不因反应体系中盐离子浓度变化而降低。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在于所述增强型Pfu DNA聚合酶中引入了一种非特异性双链DNA结合结构域。
2.根据权利要求1所述的增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在所述于非特异性双链DNA结合结构域结构域为Sso7d，所述Sso7d序列如Seq ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在于所述非特异性双链DNA结合结构域为HMf类蛋白。
4.根据权利要求1、2或3所述的增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在于所述Pfu DNA聚合酶结构域序列如Seq ID NO：2所示。
5.根据权利要求4所述的增强型Pfu DNA聚合酶，其特征在于所述非特异性双链DNA结合结构域引入时携带的蛋白连接结构域序列如Seq ID NO：3所示。
6.一种重组核酸聚合酶，其特征在于所述聚合酶是带有根据权利要求5所述蛋白连接结构域的增强型Pfu DNA聚合酶。
7.一种表达载体，其特征在于包括根据权利要求6所述重组核酸酶序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于可表达包括根据权利要求7所述的表达载体。
9.一种生产根据权利要求1所述增强型Pfu DNA聚合酶的方法，其特征在于在适合编码DNA聚合酶的核酸表达的条件下培养根据权利要求8所述的宿主细胞。
10.一种制备用于根据权利要求1、2、3所述增强型Pfu DNA聚合酶的反应缓冲液，其特征在于所述反应缓冲液包括30mM Tris-HCl(pH 8.8,25℃)、80mM KCl、2mM Mg(Cl)2、0.1％(w/v)BSA、0.5％(v/v)Triton x-100。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109679932A (zh) * 2018-12-05 2019-04-26 广州奇辉生物科技有限公司 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用
CN114015672A (zh) * 2021-12-06 2022-02-08 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004087868A2 (en) * 2003-03-25 2004-10-14 Stratagene Dna polymerase fusions and uses thereof
WO2004039947A3 (en) * 2002-08-19 2006-10-12 Stratagene Inc Dna polymerase mutants with reverse transcriptase activity
WO2007011891A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Strategene California Dna binding protein-polymerase chimeras
CN101519687A (zh) * 2008-02-29 2009-09-02 李凯 利用高保真dna聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法
CN105452451A (zh) * 2013-12-06 2016-03-30 生物辐射实验室股份有限公司 融合聚合酶

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004039947A3 (en) * 2002-08-19 2006-10-12 Stratagene Inc Dna polymerase mutants with reverse transcriptase activity
WO2004087868A2 (en) * 2003-03-25 2004-10-14 Stratagene Dna polymerase fusions and uses thereof
WO2007011891A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Strategene California Dna binding protein-polymerase chimeras
CN101519687A (zh) * 2008-02-29 2009-09-02 李凯 利用高保真dna聚合酶介导的替换性引物延伸反应进行序列分析的方法
CN105452451A (zh) * 2013-12-06 2016-03-30 生物辐射实验室股份有限公司 融合聚合酶

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JONG IL LEE ET AL.: ""Characterization and PCR application of a thermostable DNA polymerase from Thermococcus pacificus"", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *
SONOKO ISHINO ET AL.: ""DNA polymerases as useful reagents for biotechnology-the history of developmental research in the field"", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *
YAN WANG ET AL.: ""A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro"", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109679932A (zh) * 2018-12-05 2019-04-26 广州奇辉生物科技有限公司 一种dna聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用
CN114015672A (zh) * 2021-12-06 2022-02-08 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶
CN114015672B (zh) * 2021-12-06 2022-05-31 江南大学 一种Pfu DNA聚合酶

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