RU2221867C2 - Очищенная термостабильная днк-полимераза из thermococcus gorgonarius, ее получение и применение - Google Patents
Очищенная термостабильная днк-полимераза из thermococcus gorgonarius, ее получение и применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2221867C2 RU2221867C2 RU99109110/13A RU99109110A RU2221867C2 RU 2221867 C2 RU2221867 C2 RU 2221867C2 RU 99109110/13 A RU99109110/13 A RU 99109110/13A RU 99109110 A RU99109110 A RU 99109110A RU 2221867 C2 RU2221867 C2 RU 2221867C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna polymerase
- dna
- thermostable
- sequence
- polymerase
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
Abstract
Изобретение относится к области энзимологии и генной инженерии и обеспечивает получение нативной или рекомбинантной формы термостабильной ДНК-полимеразы, применяемой в диагностических и других исследованиях, основанных на ПЦР-амплификации нуклеиновых кислот. Из архебактерии Thermococcus gorgonarius выделена и очищена термостабильная ДНК-полимераза, характеризующаяся способностью практически полностью сохранять активность в течение 2 ч инкубации при t=95oС в присутствии стабилизатора и отличающаяся высокой точностью репликации. Выделена и охарактеризована последовательность ДНК, кодирующая новую ДНК-полимеразу. В результате экспрессии этой нуклеотидной последовательности в Е.coli получена рекомбинантная форма фермента. Показана возможность использования новой ДНК-полимеразы из Thermococcus gorgonarius в методах амплификации и/или секвенирования ДНК, при котором обеспечивается точность копирования, более чем вдвое превышающая этот показатель для любой из известных ДНК-полимераз. 8 с. и 3 з.п.ф-лы, 10 ил., 1 табл.
Description
Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)
Claims (11)
1. Очищенная термостабильная ДНК-полимераза, получаемая из Тhermococcus gorgonarius, которая катализирует матрично-направленную полимеризацию ДНК, обладает 3’-5’-экзонуклеазной (корректорной) активностью, сохраняет около 90% своей активности после инкубации в течение двух часов при температуре около 95°С в присутствии стабилизатора, имеет кажущуюся молекулярную массу около 92000-96000 дальтон и характеризуется, по крайней мере, в два раза более высокой точностью репликации, нежели ДНК-полимераза, получаемая из Pyrococcus furiosus.
2. ДНК-полимераза по п.1, отличающаяся тем, что указанным стабилизатором является неионный детергент.
3. ДНК-полимераза по п.1 или 2, отличающаяся тем, что стабилизатором является Thesit и/или Nonident P40.
4. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3, которая имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:6 и нуклеотидной последовательности, генетически выраженной по отношению к SEQ ID NO: 6.
5. Выделенная последовательность ДНК по п.4, отличающаяся тем, что имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6.
6. Вектор для экспрессии термостабильной ДНК-полимеразы Thermococcus gcrgonarius, представляющий собой плазмиду рВТас2, в которую встроена последовательность ДНК по п.4.
7. Рекомбинантный штамм Е. coli (LE392 pUBS520/pBtac2Tgo, депонированный под номером DSM №11328) - продуцент термсотабильной ДНК-полимеразы Thermococcus gorgonarius.
8. Способ получения термостабильной ДНК-полимеразы, охарактеризованной в любом из пп.1-3, включающий стадии культивирования природного штамма-продуцента, суспендирования и разрушения клеток, выделения и очистки фермента при помощи многостадийной хроматографической обработки надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм Thermococcus gorgonarius, а хроматографическую обработку осуществляют путем пропускания надосадочной жидкости через колонку с гепарин-сефарозой С1 6В (Pharmacia) с последующим снятием фермента с колонки и дальнейшей его очистки путем последовательного пропускания через колонку с ДЭАЭ-сефацелем (Pharmacia) и колонку с фосфоцеллюлозой (Whatman).
9. Способ получения термостабильной ДНК-полимеразы, охарактеризованной в любом из пп.1-3, включающий культивирование рекомбинантного штамма по п.7, и очистку его ДНК-полимеразы.
10. Способ амплификации ДНК, предусматривающий добавление термостабильной ДНК-полимеразы к подлежащей амплификации матричной ДНК в присутствии двух специфичных к последовательности олигонуклеотидов и дНТФ, отличающийся тем, что указанная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3.
11. Способ секвенирования ДНК, характеризующийся тем, что термостабильную ДНК-полимеразу добавляют к подлежащей cеквенированию матричной ДНК в присутствии дезоксинуклеотидов и дидезоксинуклеотидов и, по крайней мере, одного специфичного к последовательности олигонуклеотида, причем или дНТФ, или ддНТФ, или специфичный к последовательности олигонуклеотид является меченым, отличающийся тем, что указанная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, охарактеризованную в любом из пп.1-3.
Приоритет по пунктам: 03.10.96 по пп.1-11.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP96115874A EP0834570A1 (en) | 1996-10-03 | 1996-10-03 | Thermostable nucleic acid polymerase from Thermococcus gorgonarius |
EP96115874.8 | 1996-10-03 | ||
EP97100584.8 | 1997-01-16 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU99109110A RU99109110A (ru) | 2001-06-10 |
RU2221867C2 true RU2221867C2 (ru) | 2004-01-20 |
Family
ID=8223263
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU99109110/13A RU2221867C2 (ru) | 1996-10-03 | 1997-10-01 | Очищенная термостабильная днк-полимераза из thermococcus gorgonarius, ее получение и применение |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0834570A1 (ru) |
RU (1) | RU2221867C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111733145A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-10-02 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 重组酶的纯化方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE395420T1 (de) | 2000-02-17 | 2008-05-15 | Qiagen Gmbh | Thermostabile chimäre nucleinsäurepolymerasen und ihre verwendungen |
DE10049211A1 (de) | 2000-10-05 | 2002-04-18 | Qiagen Gmbh | Thermostabile Polymerase aus Thermococcus pacificus |
EP1757698B1 (en) * | 2004-06-04 | 2012-05-23 | Takara Bio, Inc. | Polypeptides having dna polymerase activity |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5374553A (en) * | 1986-08-22 | 1994-12-20 | Hoffmann-La Roche Inc. | DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima |
US5756334A (en) * | 1990-04-26 | 1998-05-26 | New England Biolabs, Inc. | Thermostable DNA polymerase from 9°N-7 and methods for producing the same |
WO1992009689A1 (en) * | 1990-12-03 | 1992-06-11 | Stratagene | PURIFIED THERMOSTABLE $i(PYROCOCCUS FURIOSUS) |
-
1996
- 1996-10-03 EP EP96115874A patent/EP0834570A1/en not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-10-01 RU RU99109110/13A patent/RU2221867C2/ru active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111733145A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-10-02 | 济南国科医工科技发展有限公司 | 重组酶的纯化方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0834570A1 (en) | 1998-04-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU773536B2 (en) | Method for amplifying nucleic acid sequence | |
KR100735131B1 (ko) | 핵산 증폭 방법 | |
AU2002325538B2 (en) | Nucleic acid amplification methods | |
US5674738A (en) | DNA encoding thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermus species Z05 | |
CA2071213C (en) | High temperature reverse transcriptases | |
US6399320B1 (en) | Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction | |
RU2260055C2 (ru) | Способ амплификации днк и композиция для его осуществления | |
US20030092018A1 (en) | Cloned DNA polymerases from thermotoga neapolitana | |
US20030073081A1 (en) | Method for amplifying nucleic acid sequence | |
EP0892058A2 (en) | Mutant chimeric DNA polymerases | |
JPH05506364A (ja) | 熱安定性 dnaポリメラーゼの5→3′のエキソヌクレアーゼ突然変異 | |
CA2092317A1 (en) | Purified thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermosipho africanus | |
KR20030071854A (ko) | 증폭 핵산 및 그의 고정화물 | |
EP1154017B1 (en) | Modified thermostable dna polymerase from pyrococcus kodakarensis | |
RU2221867C2 (ru) | Очищенная термостабильная днк-полимераза из thermococcus gorgonarius, ее получение и применение | |
RU2297454C2 (ru) | СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ ДНК, СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ВТОРОЙ кДНК И СПОСОБ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ДНК | |
WO2007076461A1 (en) | Thermostable dna polymerase from thermus scotoductus | |
WO2007117331A2 (en) | Novel dna polymerase from thermoanaerobacter tengcongenesis | |
JPS63102677A (ja) | 熱安定性dnaポリメラーゼ | |
WO2007076464A2 (en) | Thermostable dna polymerase from thermus filiformis | |
RU99109110A (ru) | Термостабильная полимераза из thermococcus gorgonarius | |
EP0922765B1 (en) | Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction | |
AU2004205118B2 (en) | Method for amplifying nucleic acid sequence | |
KR100372777B1 (ko) | 아퀴펙스 파이로필러스로부터 분리된 내열성 디엔에이중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열 | |
WO2007117857A2 (en) | Novel dna polymerase from caldicellulosiruptor kristjanssonii |