CN107828844A - 一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ace抑制肽产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，用以解决传统酶解谷朊蛋白制取ACE抑制肽过程中产生的产物转化率低、酶解时间长和产物活性低等问题。通过响应面实验设计，以ACE抑制率为衡量指标，优选出了超声协同碱液预处理谷朊蛋白、酶解的最佳工艺参数。该工艺重点解决传统酶解谷朊蛋白制取ACE抑制肽过程中产生的产物转化率低、酶解时间长和产物活性低等问题，采用该工艺后其ACE抑制率由46.56%提高到84.03%。本发明旨在提高谷朊蛋白水解功能肽的应用，且工艺简单，为促进小麦资源综合利用开发及谷朊功能性肽的产业化提供一定的技术基础。

Description

一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法

技术领域

本发明属于小麦精深加工及其副产物综合利用的技术领域，特别涉及一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法。

背景技术

高血压病是危害人类健康的现代流行病之一，在全世界范围里都有很高的发病率，非洲地区的发病率为10%，欧美国家的发病率为20%以上，中国的高血压发病率大约为14.58%，其中在成年人中的发病率为8%-18%。据国家卫计委疾控局和中国高血压联盟统计报告：中国18岁以上成年人中，高血压患者超过3.3亿人，血压在正常高值的人超过3个亿；有6-7亿的中国成年人“血压不理想”。研究表明，即使血压的小量下降也可以有效的降低心血管疾病的发病率，因此有效的医疗和防治高血压成为心血管疾病研究的热点。

血管紧张素转化酶（AngiotensinConvertingEnzyme，缩写为ACE）是一种在血压调节中起重要作用的含锌二肽羧酶，它在体内通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统（ReninAngiotensin System，简称RAS）和血管舒缓激肽-激肽-前列腺素系统（Bradykinin KininSystem，简称BKS）中对血压的调节起着重要的作用。因此抑制ACE的活性被认为是治疗高血压的一种重要而有效的方法。

虽然合成的ACE抑制剂有显著的降血压效果，但是在应用过程中往往会产生副作用，如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等。因此需要寻找更安全的ACE抑制剂，所以寻找和开发天然的ACE抑制剂成为了高血压和心血管疾病治疗和防治的研究热点。

目前食源性ACE抑制肽可以用来开发强化降血压的功能食品配料和作为天然的ACE抑制剂来替代化学合成ACE药物，植物类蛋白是一类非常丰富的提取降血压肽的资源。其中谷朊蛋白含量可以达到80%，富含Gln、Pro、Leu和Ala氨基酸，是制备ACE抑制肽的最佳原料蛋白。

小麦是我国主要的农作物，产量仅次于水稻，因此，小麦的深加工和综合利用对国民经济发展和社会稳定具有非常重要的作用。由于淀粉加工业的发展，有大量过剩的谷朊蛋白有待深加工和高值化利用。因此采用小麦面筋蛋白为原料，拓宽其应用范围，可解决小麦深加工中大宗副产品的出路问题，从而避免资源的浪费和对环境的污染。因此对于我国小麦生产的合理利用、提高产品的附加值具有十分重要的意义。

目前，关于利用谷朊蛋白制备生物活性肽的研究已被报道。但是普遍存在的问题是酶解时间过长（3~4 h），过度水解导致的酶解产物活性较低。本发明采用聚能超声波，将谷朊蛋白酶解环境提前到超声工序（本研究采用碱性蛋白酶，其最适pH值为9），那么谷朊蛋白预处理变为物理、化学和生物三种方法综合作用，缩短酶解时间，极大提高酶解效率和ACE抑制率。由于超声协同碱预处理谷朊蛋白的碱性环境和酶解环境pH值相同，因此该生产工艺简单，污染小，可进行谷朊蛋白多肽的批量生产，实现谷朊蛋白的工业化，从而大大提高了谷朊蛋白的经济效益及利用价值。

发明内容

本发明目的以水解产物ACE抑制肽的产量为衡量指标，通过响应面实验设计，优选出聚能超声协同碱液预处理工艺、碱性蛋白酶酶解谷朊蛋白工艺参数，使得聚能超声协同碱液预处理后的谷朊蛋白溶液在最优条件下酶解后，其ACE抑制肽的抑制率由46.56%提高到84.03%。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，经聚能超声协同碱液处理后的谷朊蛋白溶液，在碱性蛋白酶的最优条件下酶解，在90-120 min内，其水解产物ACE抑制率由46.56%提高到84.03%。

一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，步骤为：

（1）聚能超声协同碱液预处理过程：将谷朊蛋白(蛋白含量为82%)配成浓度为15-25 g/L的水溶液，用1M NaOH 将溶液的pH值调为8-10。利用聚能超声波进行处理，超声功率为560-700W，脉冲工作时间为1-4 s，脉冲间歇时间为2 s，超声初始温度为55-65℃，超声处理时间为20-30 min；

（2）酶解过程：将超声波协同碱液预处理后的谷朊蛋白溶液中加入碱性蛋白酶（量为E/S=5%，酶活约20万U/g）进行酶解，反应温度为55-65℃，pH为9，用1 M的NaOH控制酶解体系的pH值变化在±0.04内；

（3）灭酶过程：将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15 min，离心得到上清液，即为谷朊蛋白抑制肽溶液。

本技术方案能产生的有益效果：

1.以水解产物ACE抑制率为衡量指标，通过单因素和正交设计，优选出聚能超声协同碱液预处理工艺、碱性蛋白酶酶解谷朊蛋白的最佳工艺参数，使得聚能超声协同碱液预处理后的谷朊蛋白溶液经碱性蛋白酶在最优条件下酶解后，其产物ACE抑制率由46.56%提高到84.03%。

2.本技术方案所涉及的工艺简单、设备投资少、污染小，谷朊蛋白的水解产物多肽抑制率高，工业化推广可行，为促进谷朊蛋白资源综合利用开发功能性多肽的研究与其产业化推广提供一定的前期技术基础。

本发明所述的谷朊蛋白水解产物及多肽抑制率，及经预处理后谷朊蛋白的结构及水解性能等各项性能可采用以下指标进行检测：

可溶性蛋白溶出量的测量：将超声预处理后的谷朊蛋白悬浊液在离心力为10000 (×g)的冷冻离心机上离心15 min，收集上清液。上清液中蛋白溶出量的测量采用Folin-phenol法，记为Ct (μg/mL)。

谷朊蛋白水解上清液中多肽ACE的测量：10 µL酶解产物（双蒸水代替酶解产物作为空白样品）与25 µL ACE 溶液（酶活力为0.1 U/mL， ACE 溶于 pH 8.3 的 100 mmol/L硼酸钠缓冲溶液中，缓冲溶液中包含300 mmol/L NaCl）混合，在 37℃下预热 10 min，加入40 µL 5 mmol/L HHL 溶液（HHL 溶于 pH 8.3 的 100 mmol/L 硼酸钠缓冲溶液中，缓冲溶液中包含 300mmol/L NaCl），在 37℃反应 30 min，反应结束后立即加入 85 µL 1mol/LHCl 终止反应。反应液进行高效液相色谱分析，测定马尿酸的生成量。计算公式为：

ACE抑制率（%）=。

式中，B为酶解产物组中马尿酸的峰面积，mAU·s；A为空白对照组中马尿酸的面积，mAU·s。

经测定可知：相比于常规酶解，本申请所得谷朊蛋白的水解产物ACE的抑制率由46.56%提高到84.03%。

附图说明

图1为不同超声预处理条件下谷朊蛋白中可溶性蛋白溶出量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，步骤为：

称取原料谷朊蛋白12 g，按照蛋白浓度15 g/L配成水溶液，并用1 M的NaOH将溶液pH值调为8.0，然后采用频率为28 Hz的超声预处理。处理条件为：初始温度55℃、脉冲超声的工作时间1 s、间歇时间2 s、超声预处理时间20 min、单位体积超声功率650 W；将经过超声协同碱液处理后的谷朊蛋白溶液，置于显数恒温磁力搅拌水浴锅中，待其温度达到55℃，调节溶液到pH值为8.0后迅速加入0.48 mL Alcalase2.4L FG，水解90 min；将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15min，终止酶解，离心取上清液即为谷朊蛋白ACE抑制肽溶液。

谷朊蛋白溶液中的水解产物、谷朊蛋白水解溶液中多肽的抑制率及经预处理后谷朊蛋白的结构及水解性能等各项性能可采用以下指标进行检测：

可溶性蛋白溶出量的测量：将超声预处理后的谷朊蛋白悬浊液在离心力为10000 (×g)的冷冻离心机上离心15 min，收集上清液。上清液中蛋白溶出量的测量采用Folin-phenol法，记为Ct (μg/mL)。

谷朊蛋白水解上清液中多肽ACE的测量：10 µL酶解产物（双蒸水代替酶解产物作为空白样品）与25 µL ACE 溶液（酶活力为0.1 U/mL， ACE 溶于 pH 8.3 的 100 mmol/L硼酸钠缓冲溶液中，缓冲溶液中包含300 mmol/L NaCl）混合，在 37℃下预热 10 min，加入40 µL 5 mmol/L HHL 溶液（HHL 溶于 pH 8.3 的 100 mmol/L 硼酸钠缓冲溶液中，缓冲溶液中包含 300mmol/L NaCl），在 37℃反应 30 min，反应结束后立即加入 85 µL 1mol/LHCl 终止反应。反应液进行高效液相色谱分析，测定马尿酸的生成量。计算公式为：

ACE抑制率（%）=。

式中，B为酶解产物组中马尿酸的峰面积，mAU·s；A为空白对照组中马尿酸的面积，mAU·s。

测定谷朊蛋白抑制肽溶液的ACE抑制率为82.62%，比常规酶解产物ACE抑制率提高了81.34%。

实施例2

一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，步骤为：

称取原料谷朊蛋白12 g，按照蛋白浓度20.0 g/L配成水溶液，并用1 M的NaOH将溶液pH值调为9.0，然后采用频率为28 Hz的超声预处理。处理条件为：初始温度60℃、脉冲超声的工作时间3 s、间歇时间2 s、超声预处理时间25 min、超声功率650 W；将经过超声协同碱液处理后的谷朊蛋白溶液，置于显数恒温磁力搅拌水浴锅中，待其温度达到60℃，调节溶液到pH值为9.0后迅速加入0.6 mL Alcalase2.4L FG，水解100 min；将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15min，终止酶解，离心取上清液即为谷朊蛋白抑制肽溶液。

谷朊蛋白溶液中的水解产物、谷朊蛋白抑制肽溶液中多肽的抑制率及经预处理后谷朊蛋白的结构及水解性能等各项性能可采用以下指标进行检测：检测步骤见实施例1。

测定其ACE抑制率为84.03%，比常规酶解产物ACE抑制率提高了84.44%。

实施例3

一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，步骤为：

称取原料谷朊蛋白12 g，按照蛋白浓度25 g/L配成水溶液，并用1 M的NaOH将溶液pH值调为10，然后采用频率为28 Hz的超声预处理。处理条件为：初始温度65℃、脉冲超声的工作时间3 s、间歇时间2 s、超声预处理时间30 min、超声功率650 W；将经过超声协同碱液处理后的谷朊蛋白溶液，置于显数恒温磁力搅拌水浴锅中，待其温度达到60℃，调节溶液到pH值为10后迅速加入0.6 mL Alcalase2.4L FG，水解110 min；将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15min，终止酶解，离心取上清液即为谷朊蛋白抑制肽溶液。

谷朊蛋白溶液中的水解产物、谷朊蛋白水解溶液中多肽的抑制率及经预处理后谷朊蛋白的结构及水解性能等各项性能可采用以下指标进行检测：检测步骤见实施例1。

测定其ACE抑制率为83.38%，比常规酶解产物ACE抑制率提高了83.01%。

对比例1

谷朊蛋白加碱处理对照试验：

称取原料谷朊蛋白12 g，按照蛋白浓度15 g/L配成水溶液，并用1 M的NaOH将溶液pH值调为8.0，置于显数恒温磁力搅拌水浴锅中，待其温度达到55℃，搅拌25 min后迅速加入0.48 mL Alcalase2.4L FG，水解150 min；将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15min，终止酶解，离心取上清液即为谷朊蛋白抑制肽溶液。

谷朊蛋白溶液中的水解产物、谷朊蛋白抑制肽溶液中多肽的抑制率及经预处理后谷朊蛋白的结构及水解性能等各项性能可采用以下指标进行检测：具体检测操作见实施例1。

对比例2

谷朊蛋白超声处理对照试验：

称取原料谷朊蛋白12 g，按照蛋白浓度15 g/L配成水溶液，水浴温度到55℃，迅速加入0.48 mL Alcalase2.4L FG，谷朊蛋白溶液水解的同时辅助超声处理，超声处理的条件为：采用频率为28 Hz、工作时间1 s、间歇时间2 s、单位体积超声功率650 W的超声处理。超声辅助谷朊蛋白酶解时间为90 min；结束后将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15min，终止酶解，离心取上清液即为谷朊蛋白抑制肽溶液。

谷朊蛋白溶液中的水解产物、谷朊蛋白抑制肽溶液中多肽的抑制率及经预处理后谷朊蛋白的结构及水解性能等各项性能可采用以下指标进行检测：具体检测步骤见实施例1。

对比例3

谷朊蛋白空白对照试验：

称取原料谷朊蛋白12 g，按照蛋白浓度15 g/L配成水溶液，置于显数恒温磁力搅拌水浴锅中，待其温度达到65℃，调节溶液到pH值为7.0后迅速加入0.48 mL Alcalase2.4L FG，水解95 min；将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15min，终止酶解，离心取上清液即为谷朊蛋白ACE抑制肽溶液。

谷朊蛋白溶液中的水解产物、谷朊蛋白抑制肽溶液中多肽的抑制率及经预处理后谷朊蛋白的结构及水解性能等各项性能可采用以下指标进行检测：具体检测步骤见实施例1。

经实施例1与对比例1、2、3处理的谷朊蛋白中可溶性蛋白溶出量见图1，其中，加碱超声为实施例1的检测结果、加碱为对比例1的检测结果、超声为对比例2的检测结果、未处理的空白对照为对比例3的检测结果。

不同处理对谷朊蛋白水解度和多肽ACE抑制率的影响见表1。

表1不同超声预处理对谷朊蛋白水解度和多肽ACE抑制率的影响

其中，序号1为现已知的传统的酶解处理的水解度和ACE抑制率（对比例3），序号2为对比例1碱辅助处理酶解的水解度和ACE抑制率，序号3为对比例2超声辅助处理酶解的水解度和ACE抑制率，序号4为实施例1超声协同碱辅助酶解的水解度和ACE抑制率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，其特征在于步骤为：

（1）聚能超声协同碱液预处理过程：配制谷朊蛋白的水溶液，调pH为8-10，经聚能超声波进行处理得谷朊蛋白溶液；

（2）酶解过程：向谷朊蛋白溶液中加入碱性蛋白酶，在pH为8-10，温度为55-65℃的条件下，反应时间90-120 min，得酶解液；

（3）灭酶过程：将酶解液置于100℃的水浴锅中加热灭酶15 min，离心得到上清液，即为谷朊蛋白ACE抑制肽溶液。

2.如权利要求1所述的短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，其特征在于：所述步骤（1）中谷朊蛋白的水溶液中谷朊蛋白的浓度为15-25 g/L，聚能超声波的超声功率为560-700W，脉冲工作时间为1-4 s，脉冲间歇时间为2 s，超声初始温度为55-65℃，超声处理时间为20-30 min。

3.如权利要求1所述的短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，其特征在于：所述步骤（2）中碱性蛋白酶的量为E/S=5%，酶活20万U/g，其中用1 M的NaOH控制酶解体系的pH值变化在±0.04内。

4.一种短时高效提高谷朊蛋白水解产物ACE抑制肽产量的方法，其特征在于：所述水解产物ACE抑制肽的抑制率为84.03%。