CN104531814B

CN104531814B - 一种油茶粕酶法改性蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN104531814B
Application number: CN201410730653.5A
Authority: CN
Inventors: 龚吉军; 黄卫文; 王挥; 唐静; 卢锟
Original assignee: Central South University of Forestry and Technology
Current assignee: Central South University of Forestry and Technology
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2034-12-05
Also published as: CN104531814A

Abstract

一种油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)前处理；（2）超声波辅助水解；(3)超声波辅助复合蛋白酶水解；(4)第一次离心分离，收集第一上清液，第二次离心分离；(5)将离心分离所得沉淀物第二次加复合蛋白酶水解，离心分离，得第三上清液；(6)将第二、第三上清液合并，真空低温干燥，得到油茶粕酶法改性蛋白。本发明使油茶粕中蛋白的提取率提高至96.0%以上；所得油茶粕酶法改性蛋白中相对分子质量低于3000Da的多肽占85%‑90%；蛋白质效率比为3.04，生物效价高；具有较强的降血压生物活性；食用安全。

Description

一种油茶粕酶法改性蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种饼粕酶法改性蛋白的制备方法，尤其是涉及一种油茶粕酶法改性蛋白的制备方法。

背景技术

我国著名食品专家姚惠源教授指出，在今后一个相当长的时期内，膳食改进的核心问题是提高蛋白质的数量和质量，我国地少人多，不可能象西方发达国家那样靠发展畜牧业来提供足够的蛋白质资源，因此，质优价廉的植物蛋白质应是开发的重点，尤其是从粮油加工的大宗副产品中寻求新的蛋白质资源、增加副产品的附加值，将更具有现实意义。尽管油茶粕中蛋白质的质量分数(15%-20%)较低，但我国每年油茶粕的产量高达74万吨，因此其蛋白质资源的数量是不容忽视的。

从当今食品工业的发展趋势看，植物性来源的蛋白质在膳食补充和食品加工中的地位日益重要。人们为了减少饱和脂肪酸的摄入，对动物性蛋白质不敢过多食用。植物性蛋白质不仅可弥补膳食中蛋白质的不足，还含有一些有生理活性的物质（如大豆中的异黄酮，米糠中的γ-谷维醇，油茶中的角鲨烯），有一定的防治心血管疾病的功能，故植物性蛋白质可用于营养强化及保健食品的原料。

将蛋白质用蛋白酶进行改性，因酶的作用条件温和，在加工过程中不会产生有害物质；而蛋白酶处理，还能有效提高蛋白质的提取率，如米糠蛋白水解度(DH)为10%时，米糠蛋白质的提取率高达92%【Hamada J S. Characterization of protein fractions ofrice bran to device effective methods of protein solubilization[J]. CerealChem, 1997,74(5): 662-668.】；经过蛋白酶作用的米糠蛋白质，其功能性质也发生了一些有利的变化，如溶解性显著增加，乳化活性和乳化稳定性均有提高，可以在中等酸性的体系中使用等；更重要的是，蛋白质经复合蛋白酶水解后，能产生生物活性肽。

油茶粕蛋白经复合蛋白酶水解后，所得油茶粕多肽具有如下优点：(1)其富含谷氨酸、精氨酸、亮氨酸和天冬氨酸，且氨基酸组成全面，其生物价(BV)和蛋白质功效比(PER)接近鱼蛋白；(2)容易消化吸收；(3)具有良好的抗氧化、免疫调节等生物活性。因此，油茶粕酶法改性蛋白是一种极具开发利用价值的保健食品功能因子。

目前制备油料饼粕蛋白多肽常用的方法是“先用碱溶酸沉提取蛋白再用蛋白酶水解法”或“对饼粕直接用产蛋白酶的微生物接种发酵法”，这些方法的致命弱点有三个：(1)提取的蛋白质变性严重，水溶性差，导致后续蛋白酶酶解的效率低；(2)环境污染严重，碱溶酸沉法提取蛋白后，废液难处理，对环境影响大；(3)对饼粕直接用产蛋白酶的微生物接种发酵法，这种方法因为获得的蛋白酶活性不强，水解能力有限，且水解度不易控制，发酵时间长，生产效率低。在已经公开的专利“一种功能性饲料用添加剂油茶粕蛋白多肽的制备方法(ZL 201010572922.1，CN102048026A)”中，涉及到了油茶粕蛋白多肽的制备方法，其侧重点在于获得免疫活性多肽，蛋白质的得率低。在另一公开的专利“一种油茶饼粕蛋白的提取(申请号：201110031861)”，涉及到了一种油茶饼粕蛋白的提取方法，该方法采用超声波辐射结合酸碱法来提取蛋白质，未用蛋白酶酶法改性，不含蛋白多肽，且油茶饼粕中提取的油茶饼粕蛋白占油茶饼粕中总蛋白的比例为50%-85%(wt/wt)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足，提供一种蛋白质得率高，营养价值较高的油茶粕酶法改性蛋白的制备方法。

本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是，一种油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1) 前处理：将油茶粕粉碎，过60目筛，用水浸提法，按照固体质量与液体体积比为1:7-13g/mL(优选1:8-12g/mL)的比例，进行茶皂素分离，浸提温度为65-85℃(优选70-80℃)，浸提时间为6-10h(优选7-9h)，浸提液pH值为7.0，浸提完成后离心，使浸提液和茶粕分离，得到脱除茶皂素的油茶粕；按照固体质量与液体体积比为1:10-30g/mL (优选1:15-25g/mL)的比例将水加入脱除茶皂素的油茶粕中，浸泡2-4h；

(2) 超声波辅助细胞壁裂解酶水解：往步骤（1）所得混合液中加入相当于油茶粕干基质量0.1%-0.5wt%(wt/wt)【优选0.2%-0.4%(wt/wt)】的细胞壁裂解复合酶水解，所述细胞壁裂解复合酶由纤维素酶与果胶酶组成，其质量比为3:1-9(wt/wt)【优选3:1.5－6(wt/wt)】，水解温度为30-60℃(优选40-50℃)，pH值为4.0-6.0(优选4.5-5.5)，水解时间为6.0-12.0h(优选8-10h)，每间隔10-40min(优选15-35min)用超声波处理器处理20-50min(优选25-45min)，超声的频率为45-65KHz(优选50-60 KHz)，功率为50-200W(优选100-180 W)；

(3) 超声波辅助复合蛋白酶水解油茶粕：往步骤（2）所得混合液中加入相当于步骤(1)油茶粕浆液中蛋白质量【步骤(1)油茶粕浆液中蛋白质量用凯氏定氮法测定】0.1%-0.5%(wt/wt)【优选0.2%-0.4%(wt/wt)】的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶组成，其质量比为2-4:3-5:1-3(wt/wt/wt)【优选3-4:3-4:2-3(wt/wt/wt)】；置于温度35-60℃(优选40-50℃)水浴中水解6-14 h(优选8-12 h)，每间隔10-40min(优选20-30min)用超声波处理器处理20-50min(优选30-40 min)，超声的频率为45-65KHz(优选50-60 KHz)，功率为50-200W(优选80-160 W)；

(4) 将步骤(3)产生的混合物第一次离心分离，收集第一上清液，用0.6-1.2mol/L(优选0.8-1.0mol/L)的盐酸调节第一上清液的pH值至3.0-6.0(优选4.0-5.0)，第二次离心分离，收集第二上清液及第二次离心沉淀物；

(5) 按照固体质量(湿重)与液体体积比为1:5-10 g/mL (优选1:6-9 g/mL)的比例将水加入步骤(4)第二次离心分离所得沉淀物（第二次离心分离所得固体）中，制成混合物浆液，加入相当于混合物浆液中蛋白质量【蛋白质量用凯氏定氮法测定】0.1%-0.4%(wt/wt)【优选0.2%-0.3%(wt/wt)】的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量比为1-5:2-6(wt/wt)【优选2-4:3-5(wt/wt)】，置于温度35-60℃(优选40-50℃)水浴中水解6-14 h(优选8-12 h)，每间隔10-40min(优选20-30min)，用超声波处理器处理20-50min(优选30-40 min)，超声的频率为45-65KHz(优选50-60 KHz)，功率为50-200W(优选80-160 W)；再离心分离，得第三上清液，离心所得第三沉淀物则加入下一批油茶粕混合物中，从步骤(2)开始处理；

(6) 将步骤（4）所得第二上清液及步骤（5）所得第三上清液合并，经超滤膜过滤后，用0.3-0.7mol/L(优选0.4-0.6mol/L)的NaOH溶液调pH值至中性，低温真空干燥【温度为35-45℃(优选38-42℃)、真空度为0.02-0.04MPa(优选0.025-0.035MPa)】，干燥至含水量≤7wt%，得油茶粕酶法改性蛋白。

采用本发明，可以使油茶粕中的蛋白质充分浸出，使油茶粕中蛋白质的提取率提高至96.0%(wt/wt)以上。使用纤维素酶可以破坏细胞壁，有利于内容物的释放。超声波是频率大于20 kHz的声波，其对组织细胞产生独特的机械振动作用和空化作用，可加速原料中有效成分进入溶剂，提高有效成分的提取率；利用纤维素酶水解，结合超声波辅助处理，可以大幅提高油茶粕中蛋白质的溶出速度和溶出率。

所试油茶粕每100g(干基)中蛋白质含量为(15.9±0.1)g(n=6)，经本发明方法处理后，可得到酶法改性蛋白质(15.6±0.1)g(n=6)，其得率(以所得酶法改性蛋白质占油茶粕质量百分比计，均为干基质量，下同)比只用纤维素酶水解而不采用超声波辅助水浸提的得率提高(25.1±0.5)%【n=6，P<0.01】、比不用纤维素酶水解而只采用超声波辅助水浸提的得率提高(29.2±0.8)%【n=6，P<0.01】。

本发明在获得活性多肽的同时，尽可能使油茶粕中蛋白质提取出来，采用油茶粕酶法所得改性蛋白中相对分子质量低于3000Da的多肽达85%(wt/wt)以上，易消化吸收，常温下能100%溶于水；蛋白质效率比(PER)为3.04，生物效价高（通常认为，PER>2.0即表明该蛋白具有较高的营养价值【Abdul-Hamid A, Bakar J, Bee G H. Nutritional qualityof spray dried protein hydrolysate from black tilapia(Oreochromismossambicus)[J]. Food Chem., 2002, 78(1): 69-74.】），食用安全，且具有良好的降血压活性。本发明制备的油茶粕酶法改性蛋白，其生产成本低，可综合利用油茶加工的副产物，有利于环保，其经济和社会效益显著。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

(1) 前处理：将油茶粕粉碎，过60目筛，用水浸提法，按照固体质量与液体体积比为1:8（g/mL）的比例，进行茶皂素分离，浸提温度为70℃，浸提时间为9 h，浸提液pH值为7.0，浸提完成后离心，使浸提液和茶粕分离，得到脱除茶皂素的油茶粕；按照固体质量与液体体积比为1:15（g/mL）的比例将水加入脱除茶皂素的油茶粕中，浸泡3h；

(2) 超声波辅助细胞壁裂解酶水解：往步骤（1）所得混合液中加入相当于油茶粕干基质量0.2%(wt/wt)的细胞壁裂解复合酶水解，所述细胞壁裂解复合酶由纤维素酶与果胶酶组成，其质量比为2:1(wt/wt)，水解温度为40℃，pH值为4.5，水解时间为8.0h，每间隔15min用超声波处理器处理25min，超声的频率为50KHz，功率为100W；

(3) 超声波辅助复合蛋白酶水解油茶粕：往步骤（2）所得混合液中加入相当于步骤(1)油茶粕浆液中蛋白质量【蛋白质量用凯氏定氮法测定】0.2%(wt/wt)的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶组成，其组成按质量比为3:3:2(wt/wt/wt)，置于温度40℃水浴中水解8h，每间隔20min用超声波处理器处理30min，超声的频率为50KHz，功率为80W；

(4) 将步骤(3)产生的混合物第一次离心分离，收集第一上清液，用0.8mol/L的盐酸调节第一上清液的pH值至4.4-4.8，第二次离心分离，收集第二上清液及第二次离心沉淀物；

(5) 按照固体质量(湿重)与液体体积比为1:6（g/mL）的比例将水加入步骤(4) 离心分离所得沉淀物中（第二次离心分离沉淀物），制成混合物浆液，加入相当于混合物浆液中蛋白质量【蛋白质量用凯氏定氮法测定】0.2%(wt/wt)的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量比为4:5(wt/wt)，置于温度40℃水浴中水解8h，每间隔20min用超声波处理器处理30min，超声的频率为50KHz，功率为80W；再离心分离，得第三上清液，离心所得第三沉淀物则加入下一批油茶粕混合物中，从步骤(2)开始处理；

(6) 将步骤（4）所得第二上清液及步骤（5）所得第三上清液合并，经超滤膜过滤后，用0.4mol/L NaOH调pH值至中性，低温真空干燥(温度为38℃、真空度为0.035MPa)，含水量≤7wt%时终止），得油茶粕酶法改性蛋白。

本实施例所得油茶粕中，蛋白的提出率达97%(wt/wt)，酶法改性蛋白中相对分子质量低于3000Da的多肽占87%(wt/wt)。

本实施例制得的油茶粕酶法改性蛋白质生物效价高，蛋白效率比(PER)为3.04，而且对原发性高血压大鼠(SHR)具有显著降血压作用。

在油茶粕酶法改性蛋白降血压活性测试中（测定前将SHR在37-39 °C下保温10min，采用尾套式测定法，用电子血压测定仪进行测定，同一SHR测定5次。实施例2和3同此。），阴性对照组受试前SHR的血压为(132.75±1.88)mmHg，受试6周后SHR的血压为(133.46±1.76)mmHg；阳性对照组受试前SHR的血压为(132.72±1.81)mmHg，受试6周后SHR的血压为(116.31±1.57)mmHg；油茶粕酶法改性蛋白受试前SHR的血压为(132.79±1.19)mmHg，受试6周后SHR的血压为(110.65±1.55)mmHg。给受试物前，各组之间血压值均无显著差异(p>0.05)。给受试物第6周后，阳性对照组与油茶粕酶法改性蛋白受试组间存在显著差异(p<0.05)。

【注：上述结果均用±SD (n=10)表示；阴性对照组只灌喂生理盐水，阳性对照组采用100 mg/Kg·BW的蚕蛹降血压肽(常州康和生物技术有限公司)，大鼠的油茶粕酶法改性蛋白量饲喂剂量为100 mg/Kg·BW】。

实施例2

本实施例包括以下步骤：

(1) 前处理：将油茶粕粉碎，过60目筛，用水浸提法，按照固体质量与液体体积比为1:10（g/mL）的比例，进行茶皂素分离，浸提温度为75℃，浸提时间为8 h，浸提液pH值为7.0，浸提完成后离心，使浸提液和茶粕分离，得到脱除茶皂素的油茶粕；按照固体质量与液体体积比为1:20（g/mL）的比例将水加入脱除茶皂素的油茶粕中，浸泡3.5h；

(2) 超声波辅助细胞壁裂解酶水解：往步骤（1）所得混合液中加入相当于油茶粕干基质量0.3%(wt/wt)的细胞壁裂解复合酶水解，所述细胞壁裂解复合酶由纤维素酶与果胶酶组成，其质量比为1:1(wt/wt)，水解温度为45℃，pH值为5.0，水解时间为9.0h，每间隔30min用超声波处理器处理40min，超声的频率为55KHz，功率为140W；

(3) 超声波辅助复合蛋白酶水解油茶粕：往步骤（2）所得混合液中加入相当于步骤(1)油茶粕浆液中蛋白质量【蛋白质量用凯氏定氮法测定】0.3%(wt/wt)的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶组成，其组成按质量比为4:4:3，置于温度45℃水浴中水解10h，每间隔25min用超声波处理器处理35min，超声的频率为55KHz，功率为120W；

(4) 将步骤(3)产生的混合物第一次离心分离，收集第一上清液，用0.9mol/L的盐酸调节第一上清液的pH值至4.4-4.8，第二次离心分离，收集第二上清液及第二次离心沉淀物；

(5) 按照固体质量(湿重)与液体体积比为1:8（g/mL）的比例将水加入步骤(4)离心分离所得沉淀物（第二次离心分离所得固体）中，制成混合物浆液，加入相当于混合物浆液中蛋白【蛋白质量用凯氏定氮法测定】质量0.025%(wt/wt)的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量比为3:4(wt/wt)，置于温度45℃水浴中水解10h，每间隔25min用超声波处理器处理35min，超声的频率为55KHz，功率为120W；再离心分离，得第三上清液，离心所得第三沉淀物则加入下一批油茶粕混合物中，从步骤(2)开始处理；

(6) 将步骤（4）所得第二上清液及步骤（5）所得第三上清液合并，经超滤膜过滤后，用0.5mol/L NaOH调pH值至中性，低温真空干燥(温度为40℃、真空度为0.030MPa)，干燥至含水量≤7wt%时终止），得油茶粕酶法改性蛋白。

本实施例中，油茶粕中蛋白的提取率达97.5%(wt/wt)，酶法改性蛋白中相对分子质量低于3000Da的多肽占88%(wt/wt)。

本实施例制得的油茶粕酶法改性蛋白质生物效价高，蛋白效率比(PER)为3.04，且对原发性高血压大鼠(SHR)具有显著降血压作用。

在油茶粕酶法改性蛋白降血压活性测试中（测定前将SHR在37-39 °C下保温10min，采用尾套式测定法，用电子血压测定仪进行测定，同一SHR测定5次），阴性对照组受试前的血压为(132.74±1.87)mmHg，受试6周后血压为(133.51±1.69)mmHg；阳性对照组受试前的血压为(132.82±1.75)mmHg，受试6周后血压为(115.65±1.43)mmHg；油茶粕酶法改性蛋白受试前大鼠的血压为(132.72±1.56)mmHg，受试6周后血压为(110.45±1.23)mmHg。给受试物前，各组之间血压值均无显著差异(p>0.05)。给受试物第6周后，阳性对照组与油茶粕酶法改性蛋白受试组间存在显著差异(p<0.05)。

【注：上述结果均用±SD(n=10)表示；阴性对照组只灌喂生理盐水，阳性对照组采用100 mg/Kg·BW的蚕蛹降血压肽(常州康和生物技术有限公司)，大鼠的油茶粕酶法改性蛋白量饲喂剂量为100 mg/Kg·BW】。

实施例3

本实施例包括以下步骤：

(1) 前处理：将油茶粕粉碎，过60目筛，用水浸提法，按照固体质量与液体体积比为1:12（g/mL）的比例，进行茶皂素分离，浸提温度为80℃，浸提时间为7 h，浸提液pH值为7.0，浸提完成后离心，使浸提液和茶粕分离，得到脱除茶皂素的油茶粕；按照固体质量与液体体积比为1:25（g/mL）的比例将水加入脱除茶皂素的油茶粕中，浸泡4h；

(2) 超声波辅助细胞壁裂解酶水解：往步骤（1）所得混合液中加入相当于油茶粕干基质量0.4%(wt/wt)的细胞壁裂解复合酶水解，所述细胞壁裂解复合酶由纤维素酶与果胶酶组成，其质量比为1:2(wt/wt)，水解温度为50℃，pH值为5.5，水解时间为10.0h，每间隔35min用超声波处理器处理45min，超声的频率为60KHz，功率为180W；

(3) 超声波辅助复合蛋白酶水解油茶粕：往步骤（2）所得混合液中加入相当于步骤(1)油茶粕浆液中蛋白质量（蛋白质量用凯氏定氮法进行测定）0.4%(wt/wt)的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶组成，其组成按质量比为4:3:3，置于温度50℃水浴中水解12h，每间隔30min用超声波处理器处理40min，超声的频率为60KHz，功率为160W；

(4) 将步骤(3)产生的混合物第一次离心分离，收集第一上清液，用1.0mol/L的盐酸调节第一上清液的pH值至4.4-4.8，第二次离心分离，收集第二上清液及第二次离心沉淀物；

(5) 按照固体质量(湿重)与液体体积比为1:9（g/mL）的比例将水加入步骤(4) 第二次离心分离所得沉淀物（第二次离心分离所得固体）中，制成混合物浆液，加入相当于混合物浆液中蛋白质量【蛋白质量用凯氏定氮法测定】0.3%(wt/wt)的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量比为2:3(wt/wt)，置于温度50℃水浴中水解12h，每间隔30min用超声波处理器处理40min，超声的频率为60KHz，功率为160W；再离心分离，得第三上清液，离心所得第三沉淀物则加入下一批油茶粕混合物中，从步骤(2)开始处理；

(6) 将步骤（4）所得第二上清液及步骤（5）所得第三上清液合并，经超滤膜过滤后，用0.6mol/L NaOH调pH值至中性，低温真空干燥(温度为42℃、真空度为0.025MPa)，干燥至含水量≤7wt%，得油茶粕酶法改性蛋白。

本实施例中油茶粕中蛋白的提出率达97%(wt/wt)，酶法改性蛋白中相对分子质量低于3000Da的多肽占87.5%(wt/wt)。

在油茶粕酶法改性蛋白降血压活性测试中（测定前将SHR在37-39 °C下保温10min，采用尾套式测定法，用电子血压测定仪进行测定，同一SHR测定5次），阴性对照组受试前的血压为(132.78±1.91)mmHg，受试6周后血压为(133.55±1.49)mmHg；阳性对照组受试前的血压为(132.68±1.76)mmHg，受试6周后血压为(116.45±1.66)mmHg；油茶粕酶法改性蛋白受试前大鼠的血压为(132.84±1.32)mmHg，受试6周后血压为(110.77±1.61)mmHg。给受试物前，各组之间血压值均无显著差异(p>0.05)。给受试物第6周后，阳性对照组与油茶粕酶法改性蛋白受试组间存在显著差异(p<0.05)。

Claims

1.一种油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 前处理：将油茶粕粉碎，过60目筛，用水浸提法，按照固体质量与液体体积比为1:7-13的比例，进行茶皂素分离，浸提温度为65-85℃，浸提时间为6-10 h，浸提液pH值为7.0，浸提完成后离心，使浸提液和油茶粕分离，得到脱除茶皂素的油茶粕；按照固体质量与液体体积比为1:10-30的比例将水加入脱除茶皂素的油茶粕中，浸泡2-4h；

(2) 超声波辅助细胞壁裂解酶水解：往步骤（1）所得混合液中加入相当于油茶粕干基质量0.1%-0.5%的细胞壁裂解复合酶水解，所述细胞壁裂解复合酶由纤维素酶与果胶酶组成，其质量比为3:1-9，水解温度为30-60℃，pH值为4.0-6.0，水解时间为6.0-12.0h，每间隔10-40min用超声波处理器处理20-50min，超声的频率为45-65KHz，功率为50-200W；

(3) 超声波辅助复合蛋白酶水解油茶粕：往步骤（2）所得混合液中加入相当于步骤(1)油茶粕浆液中蛋白质量0.1%-0.5%的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶组成，其质量比为2-4:3-5:1-3；置于温度35-60℃水浴中水解6-14 h，每间隔10-40min用超声波处理器处理20-50min，超声的频率为45-65KHz，功率为50-200W；

(4) 将步骤(3)产生的混合物第一次离心分离，收集第一上清液，用0.6-1.2mol/L的盐酸调节第一上清液的pH值至3.0-6.0，第二次离心分离，收集第二上清液及第二次离心沉淀物；

(5) 按照固体质量与液体体积比为1:5-10的比例将水加入步骤(4)第二次离心分离所得沉淀物中，制成混合物浆液，加入相当于混合物浆液中蛋白质量0.1%-0.4%的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量比为1-5:2-6，置于温度35-60℃水浴中水解6-14 h，每间隔10-40min，用超声波处理器处理20-50min，超声的频率为45-65KHz，功率为50-200W；再离心分离，得第三上清液，离心所得第三沉淀物则加入下一批油茶粕混合物中，从步骤(2)开始处理；

(6) 将步骤（4）所得第二上清液及步骤（5）所得第三上清液合并，经超滤膜过滤后，用0.3-0.7mol/L 的NaOH溶液调pH值至中性，在温度35-45℃、真空度0.02-0.04MPa下低温真空干燥，干燥至含水量≤7wt%，得油茶粕酶法改性蛋白。

2.根据权利要求1所述的油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，按照固体质量与液体体积比为1:15-25的比例将水加入脱除茶皂素的油茶粕中。

3.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，往步骤（1）所得混合液中加入相当于油茶粕干基质量0.2%-0.4%的细胞壁裂解复合酶水解，所述细胞壁裂解复合酶由纤维素酶与果胶酶组成，其质量比为3:1.5-6，水解温度为40-50℃，pH值为4.5-5.5，水解时间为8-10h，每间隔15-35min用超声波处理器处理25-45min，超声的频率为50-60 KHz，功率为100-180 W。

4.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，往步骤（2）所得混合液中加入相当于步骤(1)油茶粕浆液中蛋白质量0.2%-0.4%的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由碱性蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶组成，其质量比为3-4:3-4:2-3；置于温度40-50℃水浴中水解8-12 h，每间隔20-30min用超声波处理器处理30-40min，超声的频率为50-60 KHz，功率为80-160 W。

5.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，调节第一上清液的pH值至4.0-5.0。

6.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，按照固体质量与液体体积比为1:6-9的比例将水加入步骤(4)第二次离心分离所得沉淀物中，制成混合物浆液，加入相当于混合物浆液中蛋白质量0.2%-0.3%的复合蛋白酶水解，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量比为2-4:3-5，置于温度40-50℃水浴中水解8-12 h，每间隔20-30min，用超声波处理器处理30-40 min，超声的频率为50-60KHz，功率为80-160 W；再离心分离，得第三上清液，离心所得第三沉淀物则加入下一批油茶粕混合物中，从步骤(2)开始处理。

7.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，低温真空干燥的温度为38-42℃、真空度为0.025-0.035MPa。

8.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，盐酸的浓度为0.8-1.0mol/L。

9.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，NaOH溶液的浓度为0.4-0.6mol/L。

10.根据权利要求1或2所述油茶粕酶法改性蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，用水浸提法，按照固体质量与液体体积比为1:8-12的比例，进行茶皂素分离，浸提温度为70-80℃，浸提时间为7-9h。