CN107824232B - 用于肌酐检测的微流控芯片、其制备方法及肌酐检测方法 - Google Patents

用于肌酐检测的微流控芯片、其制备方法及肌酐检测方法 Download PDF

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Abstract

一种用于肌酐检测的微流控芯片、其制备方法及肌酐检测方法，属于临床体外诊断技术领域。所述微流控芯片集成有微流控单元和光纤探测单元，通过3D打印与改进的模塑法工艺相结合制备得到。该芯片通过磺化杯[4]芳烃‑纳米金复合物对肌酐进行选择性识别，从而引起纳米金复合物光谱的红移，再结合微型光谱仪模块可实现对溶液吸光度的测量。这种分子识别微流控芯片因为集成有分子识别技术而具有较好的检测特异性，其3D打印和改进的模塑工艺相结合的制备方法简单经济，在检测肌酐乃至其他标志物方面具有临床应用价值。

Description

用于肌酐检测的微流控芯片、其制备方法及肌酐检测方法
技术领域
本发明涉及临床体外诊断技术领域，尤其涉及一种用于肌酐检测的微流控芯片、其制备方法及肌酐检测方法。
背景技术
肾脏是维持内环境稳定的重要器官，由于肾损害或肾功能下降引起的慢性肾脏病(CKD)，是继肿瘤、心脑血管病之后又一威胁人类健康的重要疾病，患病率高，且CKD患者最终会进展至肾衰竭甚至尿毒症，需要透析治疗或肾移植来维持正常生命。肾小球滤过率是肾脏功能最好最直接的评判指标，也是慢性肾脏病诊断及分期的重要依据。肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外且完全不被肾小管吸收，血肌酐基本不受饮食、高代谢等肾外因素影响，临床上常根据血肌酐、病人年龄以及体重来估算得到肾小球滤过率，因此，可以血肌酐作为反映肾小球滤过功能的主要指标。目前，肌酐的检测方法主要有苦味酸法、酶法、高效液相色谱法和毛细管电泳法。其中，苦味酸法最为常用，但特异性不高，易受AA、葡萄糖、丙酮、蛋白质等干扰；其余方法的特异性虽高，酶试剂昂贵且不易保存，高效液相色谱法和毛细管电泳法则需用特殊设备和标本预处理，临床常规使用困难。近年来也有报道新的检测方法，如Shobhana K.Menon课题组尝试将分子识别技术引入到肌酐检测研究中，能提高检测特异性；但目前的研究需结合紫外-可见光光度计实现检测，并没有适合临床应用的器件。
微流控芯片技术是当前世界上最前沿的科技领域之一，其基本特征和最大优势是将多种单元技术在微小可控平台上灵活组合、规模集成，有望为肾功能评估应用方面提供简便快速有效的新方法和新器件。如Temsiri Songjaroen等人基于微机电系统(MEMS)技术研制了肌酐检测微流控芯片，但芯片制备需要用到光刻、刻蚀、键合等复杂的微机电系统工艺，检测样本需要稀释，且主要基于碱性苦味酸动力学反应，并不能避免对葡萄糖、白蛋白等对血清中肌酐的干扰，检测特异性有待提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用于肌酐检测的微流控芯片，其制备方法及肌酐检测方法，以期解决上述提及的技术问题中的至少之一。
作为本发明的一方面，提供一种用于肌酐检测的微流控芯片，包括用于使微流体混合及反应的微流控单元和用于微流体光学探测的光纤探测单元，
所述光纤探测单元包括一检测通道、两个光纤通道和一废液出口，所述检测通道的一端连接所述微流控单元，所述检测通道的另一端连接所述废液出口，所述检测通道包含一直形通道，所述两个光纤通道分别位于所述直形通道的两端、且与所述直形通道在同一中心线上，所述两个光纤通道内分别固定有一能够与光源连接的入射光纤和一能够与光谱仪模块连接的出射光纤。
优选地，所述检测通道为Z形检测通道或直角U形检测通道，所述直形通道为所述Z形检测通道或直角U形检测通道的中间通道。
优选地，所述微流控单元包括至少两个溶液入口、至少一个Y形微沟道和一蛇形微沟道，每个所述Y形微沟道的其中一端均与所述蛇形微沟道的一端相连，每个所述Y形微沟道的另外两端分别连接所述溶液入口，所述蛇形微沟道的另一端连接所述检测通道的一端。
作为本发明的又一方面，提供一种用于肌酐检测的微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：对所述微流控单元和光纤探测单元的微沟道进行3D打印图形设计，并使用牺牲层材料对所述微沟道的模板进行3D打印，其中，所述光纤探测单元的微沟道包括一含直形通道的检测通道和两个光纤通道，对所述两个光纤通道的模板独立打印；
步骤2：将所述微沟道的模板转移至基底上，将所述两个光纤通道的模板分别置于所述直形通道的模板的两端，且与所述直形通道的模板在同一中心线上放置，浇注聚二甲基硅氧烷(PDMS)溶液并加热固化后，浸入可使牺牲层材料溶解但对PDMS惰性的溶剂中去除牺牲层，并打孔形成溶液入口和废液出口，所述基底为玻璃皿基底或钢板片基底；
步骤3：分别在所述两个光纤通道中插入光纤，将未固化的PDMS溶液作为密封胶渗入光纤与光纤通道的间隙中，继续加热固化以固定光纤。
优选地，所述步骤1中，所述牺牲层材料选自水溶性聚合物，优选选自聚乙烯醇、麦芽糖醇、聚乳酸树脂、聚丙烯酰胺、丙烯酸树脂中的一种。
优选地，所述步骤1中，所述微流控单元内的微沟道包括至少一Y形微沟道和一蛇形微沟道，打印时，对所述Y形微沟道的模板、蛇形微沟道的模板和检测通道的模板一体打印；
优选地，所述步骤1中，所述微流控单元内的微沟道包括至少一Y形微沟道和一蛇形微沟道模板，打印时，对所述Y形微沟道的模板、蛇形微沟道的模板和检测通道的模板独立打印；
所述步骤2中，在浇注PDMS溶液前，将每个所述Y形微沟道的模板的其中一端与所述蛇形微沟道的模板的一端通过加热组装拼接在一起，所述蛇形微沟道的模板的另一端与所述检测通道的模板的一端通过加热组装拼接在一起；
优选地，所述步骤3中，通过打孔得到与每个所述Y形微沟道的另外两端相连的溶液入口，以及与所述检测通道的另一端相连的废液出口。
优选地，所述步骤2和3中，加热温度为60-80℃，加热时间为0.5-6h。
作为本发明的又一方面，提供一种使用如上所述的微流控芯片进行肌酐检测的方法，包括：
步骤1：待测样品与分子识别试剂通过所述微流控单元流动混合并进行特异性反应，所述分子识别试剂为磺化杯[4]芳烃-纳米金复合物，其中磺化杯[4]芳烃为下缘酚羟基被巯基单元修饰、上缘苯环对位被羟磺酰基取代的杯[4]芳烃；
步骤2：所述入射光纤传递的入射光被所述检测通道的直形通道内流动混合液所吸收，并通过出射光纤传递至光谱仪模块进行吸光度检测而得出肌酐浓度。
优选地，所述微流控单元包括至少两个溶液入口、至少一个Y形微沟道和一蛇形微沟道，所述样品和分子识别试剂分别通过其中两个溶液入口进入Y形微沟道，经混合后进入所述蛇形微沟道进行特异性反应。
基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：
1、本发明的微流控芯片不需要配备复杂昂贵的设备，通过结合现有市场上的微型光谱仪模块，即可完成肌酐乃至其他标志物的检测应用。
2、采用3D打印制作微流控芯片的方式，无需常规MEMS工艺的专用加工设备，降低了工艺制作难度和成本。
3、本发明将分子识别技术与微流控芯片技术相结合，利用磺化杯[4]芳烃-纳米金复合物对肌酐进行选择性识别，能克服常规苦味酸法检测肌酐特异性差以及其他方法需要特殊设备、标本预处理的缺陷，可以实现对样本中肌酐的高特异、高灵敏的快速检测。
4、本发明的使用分子识别微流控芯片检测肌酐的方法，特异性高且试剂耗样量少(几十微升)、操作快速简单、成本低，且检测结果由仪器自动读出，受主观因素影响小，便于现场检测应用。
附图说明
图1为本发明一实施例中用于肌酐检测的分子识别微流控芯片的结构示意图；
其中，A-微流控单元；B-光纤探测单元；其上的各部件名称为：
1-样品入口；2-分子识别试剂入口，3-Y形微沟道，4-蛇形微沟道，5-检测通道，6-废液出口，7-入射光纤通道，8-出射光纤通道，9-入射光纤，10-出射光纤。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
图1为根据本发明一实施例的用于定量检测肌酐的分子识别微流控芯片的结构示意图。
如图1所示，该分子识别光纤微流控芯片是集成有微流动混合、分子识别反应以及长光程光纤探测的微流控芯片，包括微流控单元A和光纤探测单元B，其中包括：
微流控单元A包括两个溶液入口、一个Y形微沟道3和一个蛇形微沟道4；所述溶液入口包括样品入口1和分子识别试剂入口2，二者分别与Y形微沟道3的起始端连接，用于将样品、分子识别试剂等溶液引入到同一微沟道内；蛇形微沟道4的起始端与Y形微沟道3的末端连通，以使溶液在蛇形微沟道4内充分混合并发生特异性反应；容易理解的是，可以配置至少两个Y形微沟道，并且每个Y行微沟道的其中两端均可设置相应的溶液入口，另一端与蛇形微沟道4连接，以适应需要使用多种试剂进样的情况。
光纤探测单元B由Z形检测通道5、废液出口6、内部分别固定有入射光纤9和出射光纤10的两段光纤通道组成，入射光纤9与一光源相连，出射光纤10与一光谱仪模块相连，Z形检测通道5的中间通道与入射光纤通道7和出射光纤通道8位于同一中心线上用于光学信号的传输和检测，Z形检测通道5的尾端与废液出口6连通，当然，可以理解，如果将Z形检测通道5替换为直角U形检测通道，也可同样实现光学信号的传输和检测。
作为一具体实施例，本发明将分子识别技术与微流控技术相结合，提供一种使用微流控芯片进行肌酐检测的方法，其中所述分子识别技术使用的所述分子识别试剂，是连接有负性磺酸基团的磺化杯[4]芳烃-纳米金复合物，其结构式如下式1所示，是将巯基单元、磺酸基分别连接到杯[4]芳烃的下边缘上的羟基、上边缘之后，进一步通过纳米金与巯基之间的作用力将纳米金连接到杯[4]芳烃下边缘制备得到的复合物；该复合物可与肌酐进行选择性结合并聚集而导致吸收光谱红移。
使用上述微流控芯片进行检测时，肌酐待测样品与所述分子识别试剂在所述微流控单元A内混合并进行特异性反应，具体地，所述肌酐待测样品和分子识别试剂利用蠕动泵或注射器等常规手段分别通过样品入口1和分子识别试剂入口2进入Y形微沟道，并汇入同一微沟道进行混合，之后在所述蛇形微沟道4内充分混合并进行特异性反应，经特异性反应后的溶液进入光纤探测单元B的Z形微沟道内，通过光纤探测单元B的光纤进行光学信号传输，与光源连接的入射光纤9传递入射光，该入射光被Z行微沟道5内的溶液吸收后通过出射光纤10传递至一光谱仪模块，进而可结合现有的小型光纤光谱仪来实现对肌酐浓度的测量。
在一具体实施例中，所述分子识别微流控芯片的制备，是以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为基材，利用3D打印技术加工得到，包括如下步骤：
(1)设计连有溶液入口的Y形微沟道3、蛇形微沟道4、Z形检测通道5以及入射光纤通道7、出射光纤通道8的图形，并以牺牲层材料为原料，利用熔融沉积3D打印分别制作模板，在此过程中，聚合物材料的线材通过齿轮等机构被送入3D打印平台内具有加热装置的金属喷头，聚合物材料被加热到玻璃转换温度以上，软化了的聚合物材料熔丝从喷头喷出到底板上降温固化成型，因3D打印技术为现有常规技术，故在此不再赘述其结构和使用参数；
(2)将打印的模板转移至玻璃皿基底上进行拼接，100-300℃加热20-300s，将各模块单元组装连接成一体后，浇注PDMS溶液并在60-80℃加热固化0.5-6h，浸入可使牺牲层材料溶解但对PDMS惰性的溶剂中去除牺牲层，并打孔形成溶液入口和废液出口，所述基底为玻璃皿基底或钢板片基底，其中玻璃皿基底可以用钢板片等材料替代，拼接时，将Y形微沟道3的模板的其中一端与蛇形微沟道4的模板的一端通过加热组装拼接在一起，所述蛇形微沟道4的模板的另一端与Z形检测通道5的模板的一端通过加热组装拼接在一起，将所述两个光纤通道7和10的模板分别位于所述Z形检测通道5的中间通道的模板的两头，且与所述中间通道的模板在同一中心线上放置；
(3)将两根光纤分别插入到两段中空的光纤通道7、10，利用未固化的PDMS溶液为密封胶渗入光纤与中空光纤通道的间隙，60-80℃加热0.5-6h使PDMS固化，从而实现光纤的固定。
可以理解，上述步骤(1)中，可以对入射光纤通道7和出射光纤通道8独立地3D打印，而对其余微沟道进行模板图形设计并进行一体式3D打印，如此一来，增加了3D打印的复杂程度，但在步骤(2)中无需对Y形微沟道3、蛇形微沟道4和Z形检测通道5加热组装拼接。
进一步地，步骤(1)中的所述牺牲层材料，为水溶性聚合物，可以从聚乙烯醇、麦芽糖醇、聚乳酸树脂、聚丙烯酰胺、丙烯酸树脂中选一种。
以下列举具体实施例以对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
一种用于肌酐检测的分子识别微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用计算机AutoCAD三维绘图软件设计图形，并以麦芽糖醇为材料，利用熔融沉积3D分别打印出带有微流控单元、芯片混合、芯片检测的模板以及入射光纤通道和出射光纤通道模板。
(2)将打印出的模板转移至玻璃皿基底上进行拼接，固定到基底上；
(3)配置PDMS胶，在模板上浇注PDMS，70℃加热2h使其固化后，利用水为溶剂去除模板形成微沟道，并打孔；
(4)将两根光纤分别插入到入射光纤通道和出射光纤通道，将未固化的PDMS溶液渗入光纤与光纤通道的间隙，70℃加热1h以固定光纤，即制备获得分子识别光纤微流控芯片。
通过上述制备方法制得的分子识别微流控芯片的使用方法如下：
该芯片可结合HL2000卤素灯为入射光光源、滨松C12880MA微型光谱仪头为光学探测模块来实现对肌酐的定量检测。当待测样本和磺化杯[4]芳烃-纳米金复合物溶液分别由蠕动泵经进样孔导入分子识别微流控芯片，两者在蛇形微沟道内充分混合，磺化杯[4]芳烃-纳米金复合物溶液会对待测样本中的肌酐进行选择性结合并聚集而导致吸收光谱红移，通过光纤探测单元的出射光纤进行光学信号传输，结合滨松C12880MA微型光谱仪头测出溶液的吸光度，根据吸光度与肌酐浓度之间的关系反算出肌酐浓度，进而实现对肾小球滤过功能的定量检测。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于肌酐检测的微流控芯片，包括用于使微流体混合及反应的微流控单元和用于微流体光学探测的光纤探测单元，其特征在于，
所述光纤探测单元包括一检测通道、两个光纤通道和一废液出口，所述检测通道的一端连接所述微流控单元，所述检测通道的另一端连接所述废液出口，所述检测通道包含一直形通道，所述两个光纤通道分别位于所述直形通道的两端、且与所述直形通道在同一中心线上，所述两个光纤通道内分别固定有一能够与光源连接的入射光纤和一能够与光谱仪模块连接的出射光纤。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述检测通道为Z形检测通道或直角U形检测通道，所述直形通道为所述Z形检测通道或直角U形检测通道的中间通道。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控单元包括至少两个溶液入口、至少一个Y形微沟道和一蛇形微沟道，每个所述Y形微沟道的其中一端均与所述蛇形微沟道的一端相连，每个所述Y形微沟道的另外两端分别连接所述溶液入口，所述蛇形微沟道的另一端连接所述检测通道的一端。
4.一种如权利要求1至3中任意一项所述的用于肌酐检测的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：对所述微流控单元和光纤探测单元的微沟道进行3D打印图形设计，并使用牺牲层材料对所述微沟道的模板进行3D打印，其中，所述光纤探测单元的微沟道包括一含直形通道的检测通道和两个光纤通道，对所述两个光纤通道的模板独立打印；
步骤2：将所述微沟道的模板转移至基底上，将所述两个光纤通道的模板分别置于所述直形通道的模板的两端，且与所述直形通道的模板在同一中心线上放置，浇注PDMS溶液并加热固化后，浸入可使牺牲层材料溶解但对PDMS惰性的溶剂中去除牺牲层，并打孔形成溶液入口和废液出口，所述基底为玻璃皿基底或钢板片基底；
步骤3：分别在所述两个光纤通道中插入光纤，将未固化的PDMS溶液作为密封胶渗入光纤与光纤通道的间隙中，继续加热固化以固定光纤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述牺牲层材料选自水溶性聚合物。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牺牲层材料选自聚乙烯醇、麦芽糖醇、聚乳酸树脂、聚丙烯酰胺、丙烯酸树脂中的一种。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述微流控单元内的微沟道包括至少一Y形微沟道和一蛇形微沟道，打印时，对所述Y形微沟道、蛇形微沟道和检测通道的模板一体打印；
所述步骤2中，通过打孔得到与每个所述Y形微沟道的另外两端相连的溶液入口，以及与所述检测通道的另一端相连的废液出口。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述微流控单元内的微沟道包括至少一Y形微沟道和一蛇形微沟道模板，打印时，对所述Y形微沟道的模板、蛇形微沟道的模板和检测通道的模板独立打印；
所述步骤2中，在浇注PDMS溶液前，将每个所述Y形微沟道的模板的其中一端与所述蛇形微沟道的模板的一端通过加热组装拼接在一起，所述蛇形微沟道的模板的另一端与所述检测通道的模板的一端通过加热组装拼接在一起；
所述步骤2中，通过打孔得到与每个所述Y形微沟道的另外两端相连的溶液入口，以及与所述检测通道的另一端相连的废液出口。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3中，加热温度为60-80℃，加热时间为0.5-6h。
10.一种使用如权利要求1至3中任意一项所述的微流控芯片进行肌酐检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：待测样品与分子识别试剂通过所述微流控单元流动混合并进行特异性反应，所述分子识别试剂为磺化杯[4]芳烃-纳米金复合物，其中磺化杯[4]芳烃为下缘酚羟基被巯基单元修饰、上缘苯环对位被羟磺酰基取代的杯[4]芳烃；
步骤2：所述入射光纤传递的入射光被所述检测通道的直形通道内的流动混合液所吸收，并通过出射光纤传递至光谱仪模块进行吸光度检测而得出肌酐浓度。
11.根据权利要求10所述的肌酐检测的方法，其特征在于，所述微流控单元包括至少两个溶液入口、至少一个Y形微沟道和一蛇形微沟道，所述样品和分子识别试剂分别通过其中两个溶液入口进入Y形微沟道，经混合后进入所述蛇形微沟道进行特异性反应。
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