CN107801567A - 一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法 - Google Patents
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Abstract
一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，包括步骤1）：母种制备，将子实体菌丝体转接到装有液体培养基的试管内培养，接入假根菌丝体，培养得到成熟母种；步骤2）：原种制备，将母种接入原种培养基，培养制得原种；本发明通过对子实体菌丝体和假根菌丝体组合培养制备母种，两种菌丝体组合培养能够有效促进菌丝生长、增强母种品质；本发明的原种培养基采用植物杆粉、杂粮粉和蔗糖为菌丝生长发育提供碳源和能量物质，金属盐类为菌丝生长发育提供必需的金属离子，酸类化合物为菌丝生长发育提供必需的酸性环境，促进其生长；愈创木酚为菌丝生长发育过程中的漆酶分泌提供信号，水为菌丝生长发育提供必需的水份和维持必需的湿度。
Description
技术领域
本发明属于鸡纵菌培养技术领域，具体涉及一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法。
背景技术
鸡枞菌肉质细嫩，气味浓香，味道鲜美，是著名的野生食用菇之一，味道尤以黑皮鸡枞菌最好。中医认为鸡枞菌性平味甘，有健脾益气，开胃提神，止痛水肿之功效，是治疗痔疮的极理想食物。现代医学发现，鸡枞除对痔疮有特效外，还能预防肠癌、降低血压、增强人体免疫力，但单纯采摘野生黑皮鸡枞菌已难以满足巨大的市场需求，人们开始人工培养。然而由于黑皮鸡枞菌的生长发育与土白蚁的活动有密切关系，且对生长地依赖性强，人工培养要求高难度大。虽然人们对黑皮鸡枞菌的人工培养做了大量研究，知道黑皮鸡枞菌在人工条件下培养需要一定的CO2浓度、高湿度及酸性的条件，但迄今为止，由于对植物种类组成、金属离子种类及浓度、酸的种类及浓度、菌圃共生细菌等在鸡枞菌生长发育过程中的作用还缺乏了解，因此在黑皮鸡枞菌原种培养过程中培养基成分不科学、制得的原种品质差，无法实现黑皮鸡枞菌的大规模生产。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种科学优化原种培养过程中培养基的组分，从而提高黑皮鸡枞菌原种品质的制种方法，以解决现有技术中黑皮鸡枞菌原种培养过程中培养基成分不科学、制得的原种品质差的问题。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，包括以下步骤：
步骤1)：母种制备，具体包括：
步骤1.1)：在无菌条件下对黑皮鸡枞菌的子实体做组织分离，分离得子实体菌丝体；
步骤1.2)：对黑皮鸡枞菌的假根做组织分离，分离得假根菌丝体；
步骤1.3)：将子实体菌丝体转接到装有液体培养基的试管内，22-25℃下培养，待菌丝长至1.3-1.8cm时接入假根菌丝体，继续培养5-8日即得成熟母种；
步骤2)：原种制备，将步骤1)制得的成熟母种接入原种培养基，培养20-25天即可成熟，制得原种；
所述原种培养基的成分及质量份数配比为：植物杆粉50份、杂粮粉5-20份、共生菌液0.5-5份、蔗糖0.5-2份、有机酸0.5-2份、金属盐0.5-3份、无机矿物质粉0.5-2份、愈创木酚0.01-0.05份、适量水。
进一步的，所述液体培养基成分为：土豆汁1000ml、琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐3-5g。
进一步的，所述液体培养基的制备方法为：将土豆100g放入1000ml水中加热，煮沸后继续加热20-30分钟，趁热过滤，滤液中加水补足1000ml后，并加入琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐3-5g，待完全溶化后，高压灭菌，灭菌后分装试管即得母种培养基。
进一步的，所述植物杆粉为棉籽壳、木屑、玉米芯中的一种或多种。
进一步的，所述杂粮粉为米糠、麸皮、玉米粉、小麦粉、吞豆粉中的一种或多种。
进一步的，所述有机酸为氨基酸、硬脂酸、棕榈酸、甘油酸酯中的一种或多种。
进一步的，所述金属盐为磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钙、氯化钴、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸铝钾中的一种或多种。
进一步的，所述无机矿物质粉为石膏粉、轻质碳酸钙、滑石粉、石灰粉中的一种或多种。
进一步的，所述共生菌液的制备方法为：将从野外挖巢获得的黑翅土白蚁菌圃用工具碾碎，然后按照菌圃：无菌水＝1：9的质量比混合，搅拌均匀，静置2小时，取上清液即为共生菌液。
本发明的黑皮鸡枞菌原种的制备方法中，首先对子实体菌丝体和假根菌丝体组合培养制备母种，两种菌丝体组合培养能够有效促进菌丝生长、增强母种品质。之后以植物杆粉、杂粮粉、共生菌液、蔗糖、有机酸、金属盐、无机矿物质粉、愈创木酚和适量水作为原种培养基的组成成分来培养原种，其中植物杆粉、杂粮粉和蔗糖为菌丝生长发育提供碳源和能量物质，金属盐类为菌丝生长发育提供必需的金属离子，酸类化合物为菌丝生长发育提供必需的酸性环境，促进黑皮鸡枞菌对糖类的吸收，从而促进其生长；愈创木酚为菌丝生长发育过程中的漆酶分泌提供信号，水为菌丝生长发育提供必需的水份和维持必需的湿度，使得黑皮鸡枞菌的培养环境更为接近野生环境，从而提高黑皮鸡枞菌的质量，使其接近野生黑皮鸡枞菌。
本发明中原种培养基中的共生细菌液为从黑翅土白蚁菌圃中分离、培养得到的共生细菌，这些细菌包括：苏云金杆菌、芽孢杆菌属的4种菌和双酶梭菌等，用于清除菌丝生长发育过程中产生的某些有害的次生化合物，同时抑制其它真菌的滋生并促进黑皮鸡枞菌菌丝的生长。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
1.本发明通过对子实体菌丝体和假根菌丝体组合培养制备母种，两种菌丝体组合培养能够有效促进菌丝生长、增强母种品质；
2.本发明的原种培养基采用植物杆粉、杂粮粉和蔗糖为菌丝生长发育提供碳源和能量物质，金属盐类为菌丝生长发育提供必需的金属离子，酸类化合物为菌丝生长发育提供必需的酸性环境，促进黑皮鸡枞菌对糖类的吸收，从而促进其生长；愈创木酚为菌丝生长发育过程中的漆酶分泌提供信号，水为菌丝生长发育提供必需的水份和维持必需的湿度，使得黑皮鸡枞菌的培养环境更为接近野生环境，从而提高了黑皮鸡枞菌的质量，使其接近野生黑皮鸡枞菌。
3.本发明的原种培养基内还加入愈创木酚，可诱导鸡枞菌产生漆酶，促进作为菌种的鸡枞菌菌丝能迅速破坏植物干粉混合物中的木质素，使得黑皮鸡枞菌菌丝能有足够的营养进行生长、发育和繁殖，从而实现黑皮鸡枞菌菌丝的快速生产；
4.本发明的原种培养基内还加入由多种菌圃共生细菌构成的共生细菌液，一方面抑制了培养过程中果蝇等微小昆虫的生长和其它杂菌的生长，另一方面共生细菌在生长发育过程中消耗了鸡枞菌菌丝生长发育过程中产生的对其本身生长发育有害的次生化合物，使鸡枞菌菌丝能正常生长和发育。
具体实施方式
参照以下具体实施例对本发明的黑皮鸡枞菌的原种培养料及其制备方法作详细地说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，包括以下步骤：
步骤1)：母种制备，具体包括：
步骤1.1)：在无菌条件下对黑皮鸡枞菌的子实体做组织分离，分离得子实体菌丝体；
步骤1.2)：对黑皮鸡枞菌的假根做组织分离，分离得假根菌丝体；
步骤1.3)：将子实体菌丝体转接到装有液体培养基的试管内，25℃下培养，待菌丝长至1.3-1.8cm时接入假根菌丝体，继续培养6日得到成熟母种；
步骤2)：原种制备，将步骤1)制得的成熟母种接入原种培养基，培养22天即成熟，制得原种；
其中原种培养基的成分及质量份数配比为：棉籽壳50份、麸皮15份、共生菌液2份、蔗糖1份、氨基酸1份、氯化钠0.5份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾0.5、石灰粉2份、愈创木酚0.02份、水40份。
其中液体培养基成分为：土豆汁1000ml、琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐4g。
液体培养基的制备方法为：将土豆100g放入1000ml水中加热，煮沸后继续加热25分钟，趁热过滤，滤液中加水补足1000ml后，并加入琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐4g，待完全溶化后，高压灭菌，灭菌后分装试管即得母种培养基。
其中共生菌液的制备方法为：将从野外挖巢获得的黑翅土白蚁菌圃用工具碾碎，然后按照菌圃：无菌水＝1：9的质量比混合，搅拌均匀，静置2小时，取上清液即为共生菌液。
实施例2
一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，包括以下步骤：
步骤1)：母种制备，具体包括：
步骤1.1)：在无菌条件下对黑皮鸡枞菌的子实体做组织分离，分离得子实体菌丝体；
步骤1.2)：对黑皮鸡枞菌的假根做组织分离，分离得假根菌丝体；
步骤1.3)：将子实体菌丝体转接到装有液体培养基的试管内，22℃下培养，待菌丝长至1.3-1.8cm时接入假根菌丝体，继续培养8日得到成熟母种；
步骤2)：原种制备，将步骤1)制得的成熟母种接入原种培养基，培养25天即成熟，制得原种；
其中原种培养基的成分及质量份数配比为：木屑50份、玉米粉3份、米糠3份、共生菌液3份份、蔗糖1份份、硬脂酸0.5份、甘油酸酯0.5份、磷酸二氢钾0.3份、氯化钴0.3份、硫酸亚铁0.3份、石膏粉0.5-2份、愈创木酚0.01-0.05份、水45份。
其中液体培养基成分为：土豆汁1000ml、琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐5g。
液体培养基的制备方法为：将土豆100g放入1000ml水中加热，煮沸后继续加热28分钟，趁热过滤，滤液中加水补足1000ml后，并加入琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐5g，待完全溶化后，高压灭菌，灭菌后分装试管即得母种培养基。
其中共生菌液的制备方法为：将从野外挖巢获得的黑翅土白蚁菌圃用工具碾碎，然后按照菌圃：无菌水＝1：9的质量比混合，搅拌均匀，静置2小时，取上清液即为共生菌液。
实施例3
一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，包括以下步骤：
步骤1)：母种制备，具体包括：
步骤1.1)：在无菌条件下对黑皮鸡枞菌的子实体做组织分离，分离得子实体菌丝体；
步骤1.2)：对黑皮鸡枞菌的假根做组织分离，分离得假根菌丝体；
步骤1.3)：将子实体菌丝体转接到装有液体培养基的试管内，24℃下培养，待菌丝长至1.3-1.8cm时接入假根菌丝体，继续培养6日得成熟母种；
步骤2)：原种制备，将步骤1)制得的成熟母种接入原种培养基，培养24天即成熟，制得原种；
所述原种培养基的成分及质量份数配比为：玉米芯50份、小麦粉5份、吞豆粉5份、共生菌液3份、蔗糖2份、棕榈酸2份、氯化钙0.5份、硫酸铜0.5份、硫酸锌0.5份、轻质碳酸钙0.5份、滑石粉1份、愈创木酚0.05份、水66份。
其中液体培养基成分为：土豆汁1000ml、琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐3g。
液体培养基的制备方法为：将土豆100g放入1000ml水中加热，煮沸后继续加热20分钟，趁热过滤，滤液中加水补足1000ml后，并加入琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐3g，待完全溶化后，高压灭菌，灭菌后分装试管即得母种培养基。
其中共生菌液的制备方法为：将从野外挖巢获得的黑翅土白蚁菌圃用工具碾碎，然后按照菌圃：无菌水＝1：9的质量比混合，搅拌均匀，静置2小时，取上清液即为共生菌液。
对比组1：一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，除液体培养基和原种培养基组成成分外培养方法与实施例3相同，其中液体培养基成分为：土豆汁1000ml、琼脂20g、葡萄糖20g；原种培养基的成分及质量份数配比为：木屑50份、麸皮10份、石灰粉1份、水66份。
对比组2：一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，除原种培养基组成成分外培养方法与实施例3相同，其中原种培养基的成分及质量份数配比为：木屑50份、麸皮10份、石灰粉1份、水66份。
对实施例1-3及对比组1、2培养的原种生长情况进行测试，菌丝生长均一性的测试结果如下表1所示，菌丝长势及污染率的测试结果如下表2所示。
表1
| 测试项目 | 平均生长速度(mm/d) | 标准差 | 变异系数 |
| 实施例1 | 3.24 | 0.05 | 1.68 |
| 实施例2 | 3.45 | 0.06 | 1.64 |
| 实施例3 | 3.64 | 0.05 | 1.58 |
| 对比组1 | 2.46 | 0.16 | 2.24 |
| 对比组2 | 2.85 | 0.12 | 1.86 |
表2
| 测试项目 | 菌丝密度 | 菌丝形态 | 污染率(％) |
| 实施例1 | ++++ | 粗壮 | 0 |
| 实施例2 | ++++ | 粗壮 | 0 |
| 实施例3 | ++++ | 粗壮 | 0 |
| 对比组1 | ++ | 细弱 | 8 |
| 对比组2 | +++ | 较粗 | 3 |
注:“++++”表示菌丝浓密，“+++”表示菌丝较密，“++”表示菌丝稀疏，“+”表示菌丝极稀。
由上表1可见，本发明实施例1-3制得的黑皮鸡纵菌原种的平均生长速度均大于3mm/d，且其中实施例3的生长速度最快，明显高于对比组1、2；实施例1-3制得的黑皮鸡纵菌原种的标准差均小于0.1，而对比组1、2的标准差均高于0.1，证明本发明的原种制备方法制得的原种不仅生长速度快，且均一性好；实施例1-3制得的黑皮鸡纵菌原种的变异系数均小于1.7，明显低于对比组1、2。
由上表2可见，本发明实施例1-3制得的黑皮鸡纵菌原种的菌丝浓密、形态粗壮、且污染率为0，均优于对比组1、2。
综上所述，通过本发明的原种制备方法制得的菌种生长速度快、整齐度高、菌丝浓密粗壮、质量高，解决了现有技术中黑皮鸡纵菌菌丝生长速度慢、产量低、品质差的问题。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）：母种制备，具体包括：
步骤1.1）：在无菌条件下对黑皮鸡枞菌的子实体做组织分离，分离得子实体菌丝体；
步骤1.2）：对黑皮鸡枞菌的假根做组织分离，分离得假根菌丝体；
步骤1.3）：将子实体菌丝体转接到装有液体培养基的试管内，22-25℃下培养，待菌丝长至1.3-1.8cm 时接入假根菌丝体，继续培养5-8日即得成熟母种；
步骤2）：原种制备，将步骤1）制得的成熟母种接入原种培养基，培养20-25天即可成熟，制得原种；
所述原种培养基的成分及质量份数配比为：植物杆粉50份、杂粮粉5-20份、共生菌液0.5-5份、蔗糖0.5-2份、有机酸0.5-2份、金属盐0.5-3份、无机矿物质粉0.5-2份、愈创木酚0.01-0.05份、适量水。
2.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述液体培养基成分为：土豆汁1000ml、琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐3-5g。
3.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述液体培养基的制备方法为：将土豆100g 放入1000ml 水中加热，煮沸后继续加热20-30 分钟，趁热过滤，滤液中加水补足1000ml 后，并加入琼脂20g、葡萄糖20g、有机酸盐3-5g，待完全溶化后，高压灭菌，灭菌后分装试管即得母种培养基。
4.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述植物杆粉为棉籽壳、木屑、玉米芯中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述杂粮粉为米糠、麸皮、玉米粉、小麦粉、吞豆粉中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述有机酸为氨基酸、硬脂酸、棕榈酸、甘油酸酯中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述金属盐为磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钙、氯化钴、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸铝钾中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述无机矿物质粉为石膏粉、轻质碳酸钙、滑石粉、石灰粉中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的黑皮鸡枞菌原种的制种方法，其特征在于，所述共生菌液的制备方法为：将从野外挖巢获得的黑翅土白蚁菌圃用工具碾碎，然后按照菌圃：无菌水=1：9的质量比混合，搅拌均匀，静置2小时，取上清液即为共生菌液。
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