CN107794256B - cfDNA建库方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于cfDNA建库的随机接头、cfDNA建库方法及试剂盒。使用本发明的随机接头进行cfDNA建库,可以提高文库得率。
Description
发明领域
本发明涉及生物检测领域,具体涉及cfDNA建库方法及试剂盒。
背景技术
Illumina测序设备是现在新一代高通量测序(NGS)的常用设备之一,配套使用的是KAPA文库构建试剂盒。附带的DNA文库构建说明书提到的文库构建方法简述如下:(1)末端修复后纯化;(2)加A并纯化;(3)接头连接并纯化;(4)再次纯化;(5)文库扩增并纯化产物。
KAPA试剂盒配套的接头序列如下(F为正向序列,R为反向序列):
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACT---3’;
R:5’---ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC ATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTCTGC TTG---3’。
经修复加A后的cfDNA上的A碱基与接头上的T碱基配对连接,连接成功后的cfDNA就可以通过illumina设备进行测序。
现有的KAPA接头试剂的文库转化效率(建库前后DNA的比例)较低。
发明内容
本发明的目的是提供用于cfDNA建库的接头、cfDNA建库方法及试剂盒。
根据本发明的一个方面,提供用于cfDNA建库的随机接头,所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物:
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACGCT CTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T---3’(SEQ ID NO:1)
R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CACATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG---3’(SEQ ID NO:2)
其中,N为随机碱基(即随机核苷酸),每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个;N的数量,即x为选自3-20中的一个数;且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。
由于N是随机碱基,因此当N为不同碱基时可形成不同序列,这些不同序列退火形成的不同双链序列的混合物构成本发明的随机接头。因此,本发明中,所使用的随机接头是混合物,其中含有N为不同碱基时形成的不同序列退火而成的多条不同的双链序列。
在本发明中的随机接头混合物中,不同序列中的N的数量都是相同的,但N的碱基种类不同。例如,优选地,本发明的随机接头可以是由上述序列退火形成的多条不同双链序列的混合物,其中x为6。本发明的随机接头还可以是由上述序列退火形成的多条不同双链序列的混合物,其中x为8。
根据本发明的另一方面,提供上述随机接头的制备方法,包括:将合成好的两条序列分别稀释至10μM的浓度;然后分别取20μl混合均匀,转移至PCR管中;将混合好的溶液置于PCR仪中,设置温度为95℃,孵育5min;孵育完成后,直接关闭PCR仪,继续孵育2小时;获得制备好的随机接头。
根据本发明的另一方面,提供上述随机接头在cfDNA建库中的应用。
根据本发明的另一个方面,提供cfDNA建库方法,包括下述步骤:
(1)末端修复后纯化;
(2)在已修复的cfDNA片段的3'端加上一个“A”碱基,并纯化;
(3)用DNA连接酶将随机接头连接至已加A的cfDNA片段的两端,并纯化,所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物:
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACGCT CTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T---3’(SEQ ID NO:1)
R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CACATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG---3’(SEQ ID NO:2)
其中,N为随机碱基(即随机核苷酸),每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个;N的数量,即x为选自3-20中的一个数;且每一条序列中C+G含量保持在40-50%;
(4)再次纯化加接头的cfDNA片段;
(5)通过PCR扩增文库并纯化产物。
在优选的实施方案中,步骤(3)中所使用的随机接头的制备方法是:将合成好的两条序列分别稀释至10μM的浓度;然后分别取20μl混合均匀,转移至PCR管中;将混合好的溶液置于PCR仪中,设置温度为95℃,孵育5min;孵育完成后,直接关闭PCR仪,继续孵育2小时;获得制备好的接头。
在更优选的实施方案中,步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为5-300:1,更优选为10-100:1,最优选为10-50:1。所述比例为质量比。
在一些实施方案中,步骤(1)-(5)中任意一步或多步中所述的纯化是利用磁珠纯化。
根据本发明的又一方面,提供一种cfDNA建库试剂盒,所述试剂盒包含随机接头,所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物:
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACGCT CTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T---3’(SEQ ID NO:1)
R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CACATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG---3’(SEQ ID NO:2)
其中,N为随机碱基(即随机核苷酸),每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个;N的数量,即x为选自3-20中的一个数;且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。
在一些的实施方案中,所述试剂盒还包含cfDNA建库所需的一种或多种其它试剂。
本发明中,随机接头中N的数量,即x可以为3-20中的任何一个数,优选为6-8中的任何一个数,更优选为6或8。
利用本发明的随机接头和cfDNA建库方法获得的文库,可适用于Illumina测序平台。
使用本发明的随机接头进行cfDNA建库,可以提高文库转化效率。
附图说明
图1是由细胞系cfDNA构建的文库所得到的Caliper峰图,其中“KAPA”表示KAPA建库试剂盒配套接头的文库峰图;“随机引物”表示随机接头的文库峰图,在158bp位置出现一个dimer峰。其中细胞系cfDNA是由细胞系的基因组DNA经酶切成cfDNA大小的DNA,即模拟的cfDNA。
图2是由血浆cfDNA构建的文库所得到到Caliper峰图,其中“KAPA”表示KAPA建库试剂盒配套接头的文库峰图;“随机引物”表示随机接头的文库峰图,在169bp位置出现一个dimer峰。
具体实施方式
本发明所述的术语“文库构建”简称建库,是指,对于血液、体液或粪便等样本中存在的cfDNA进行修复并连接到一段已知DNA片段即adapter序列(也称为接头)上,从而可以用于Illumina设备上进行高通量DNA测序的过程。
本发明所述的术语“cfDNA”又称细胞游离DNA(cell free DNA),是体内处于游离状态的DNA。
本发明的“Random Adapter(随机接头)”是退火完成后的双链接头。
本发明所述的术语“退火”是游离的单链DNA通过一系列反应形成双链DNA的过程。
本发明所述的“LoBind离心管”是一种具有低吸附性的离心管。
本发明所述的“磁珠”是指超顺磁性纳米颗粒,能够帮助DNA产物核酸进行纯化。实施例中所使用的磁珠为Beckman Ampure XP Beads(来自Beckman)。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料和试剂,如无特殊说明,均可以从商业途径获得。
实施例1:NNNNNN随机接头与KAPA建库试剂盒配套接头的文库构建得率比较
1.1.文库得率
(1)末端修复后纯化
分别取25ng cfDNA于两个1.5ml LoBind离心管中,分别标记为A、B,按照KAPA建库试剂盒(KAPA LTP Library Preparation Kit,产品编号:KK8232,购买厂商:KAPABiosystems)操作说明进行末端修复和加A操作,具体步骤如下:
将cfDNA样品用Nuclease-free water补齐至58μl,按表1配制末端修复反应体系:
表1末端修复反应体系
反应组分 | 体积(μl) |
cfDNA | 58 |
KAPA End Repair Buffer(10X) | 7 |
KAPA End Repair Enzyme Mix | 5 |
总计 | 70 |
吹打混匀后,20℃孵育30min。
向上述反应体系中加入120μl(1.7×)Agencourt AMPure XP Beads试剂,吹打混匀后室温孵育15min。将离心管置于磁力架,待溶液完全澄清后,吸弃上清;加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清;再次加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清。开盖晾干,待乙醇完全挥发后,加入30μl Nuclease-free water(无酶水)重溶磁珠。
(2)在已修复的cfDNA片段的3'端加上一个“A”碱基,并纯化;
按表2配制末端加A反应体系:
表2末端加A反应体系
反应组分 | 体积(μl) |
含cfDNA的磁珠溶液 | 30 |
KAPA A-Tailing Buffer(10X) | 5 |
KAPA A-Tailing Enzyme | 3 |
Nuclease-free water | 12 |
总计 | 50 |
吹打混匀,30℃孵育30min。
向上述反应体系中加入90μl(1.8×)平衡至室温的KAPA PEG/NaCl SPRI溶液,吹打混匀,室温孵育15min。将离心管置于磁力架,待溶液完全澄清后,吸弃上清;加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清;再次加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清。开盖晾干,使乙醇完全挥发。
(3)用DNA连接酶将接头连接至已加A的cfDNA片段的两端,并纯化;
合成序列如下所示但N各不相同的多条序列,并分别稀释至10μM的浓度:
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACGCT CTT CCG ATC TNN NNN NGT CAG TAC T---3’(SEQ ID NO:1)
R:5’---GTA CTG CAN NNN NNA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGTCAC ATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG---3’(SEQ ID NO:2);
其中,每一个N随机为A、G、C或T中的任一个;且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。(上述接头序列购自生工生物工程(上海)股份有限公司)
然后分别取每一条序列20μl混合均匀,并转移至PCR管中;将混合好的溶液置于PCR仪中,设置温度为95℃,孵育5min;孵育完成后,直接关闭PCR仪,继续孵育2小时;孵育结束后,取出PCR管,得到随机接头溶液。
分别用35μl的该随机接头溶液和35μl的KAPA建库试剂盒配套的接头溶液重溶A和B中的磁珠。其中两种接头溶液的配制均按接头摩尔数:cfDNA摩尔数=50:1的比例取相应接头量,再用Nuclease-free water补齐至35μl。
按表3配制接头连接反应体系:
表3接头连接反应体系
反应组分 | 体积(μl) |
含cfDNA和接头的磁珠溶液 | 35 |
5X KAPA Ligation Buffer | 10 |
KAPA T4DNA Ligase | 5 |
总计 | 50 |
吹打混匀,16℃孵育16h。完成孵育后,20℃孵育15min。
向上述反应体系中加入50μl(1×)平衡至室温的KAPA PEG/NaCl SPRI溶液,吹打混匀,室温孵育15min。将离心管置于磁力架,待溶液完全澄清后,吸弃上清;加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清;再次加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清。开盖晾干,待乙醇完全挥发后,加入50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0–8.5)重溶磁珠。
(4)再次纯化加接头的cfDNA片段;
向上述反应体系中加入50μl(1×)平衡至室温的KAPA PEG/NaCl SPRI溶液,吹打混匀,室温孵育15min。将离心管置于磁力架,待溶液完全澄清后,吸弃上清;加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清;再次加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清。开盖晾干,待乙醇完全挥发后,加入20μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0–8.5)重溶磁珠。
(5)通过PCR扩增文库并纯化产物。
加入对应的index(Illumina测序过程中用于区分样本的index序列)与PCR反应液进行PCR,按表4配制文库PCR扩增反应体系:
表4文库扩增反应体系
反应组分 | 体积(μl) |
Adapter-ligated cfDNA(接头连接后的cfDNA) | 20 |
2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25 |
Universal PCR Primer for Illumina | 2.5 |
Index Primer for Illumina | 2.5 |
总计 | 50 |
吹打混匀后按表5程序进行PCR:
表5文库扩增PCR程序
向上述反应体系中加入90μl(1.8×)Agencourt AMPure XP reagent,吹打混匀,室温孵育15min。将离心管置于磁力架,待溶液完全澄清后,吸弃上清;加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清,再次加入400μl新鲜配制的80%乙醇,静置30s后,吸弃上清。开盖晾干,待乙醇完全挥发后,加入32.6μl Nuclease-free water,吹打混匀,室温静置5min后置于磁力架,待溶液完全澄清后,转移30μl上清至新的1.5ml离心管中。
用30μl ddH2O进行洗脱,并对A和B分别进行Qubit测试(用来测试文库浓度)与Caliper(文库片段分布)测试。
Qubit实验结果如表6所示:
表6 Qubit实验结果
样品 | 接头 | 文库(ng) |
A | 随机接头 | 3180 |
B | KAPA试剂盒配套接头 | 2386 |
此实验表明,在PCR循环为8的情况下,用KAPA试剂盒中配套的接头试剂可以得到2386ng的文库;使用随机接头可以得到3180ng文库,说明利用随机接头构建文库得率更高。
1.2 Caliper峰图比较
Caliper峰图比较结果如图1和图2所示,图中由随机接头所构建的文库中出现了dimer峰,dimer是指随机接头发生自连形成二聚体的状态,其分别出现在158bp和169bp的位置。但目标片段峰的面积和KAPA自带接头所构建文库的目标片段峰面积相当,占比比较大,大约为所有峰总面积的85%–95%。
1.3文库得率小结
由上述结果可以看出,随机接头是可用的,且用随机接头获得的文库转化率更高。但是随机接头连接建库的文库中会出现接头的dimer,影响后续的实验结果,需对接头比例进行调整。
实施例2:随机接头与cfDNA摩尔比例实验
2.1随机接头与cfDNA不同摩尔比获得的文库浓度如表7所示,文库构建方法同实施例1。
表7不同摩尔比的随机接头获得的文库浓度
样本编号 | 随机接头和cfDNA摩尔比 | 文库浓度(ng/μl) | Dimer(%) |
1 | 250:1 | 71.8 | 11.03 |
2 | 200:1 | 83.6 | 8.46 |
3 | 150:1 | 75.4 | 9.21 |
4 | 100:1 | 75 | 5.45 |
5 | 50:1 | 75.6 | 2.81 |
6 | 25:1 | 76.8 | 1.2 |
7 | 10:1 | 58.6 | 0.54 |
由于文库中的Dimer接头含量的增加,会导致文库质量的下降,因此需要将随机接头与cfDNA的摩尔比控制在10:1-200:1之间。
2.2随机接头和cfDNA摩尔比例实验小结
从不同摩尔比例建库的文库浓度来看,最优的随机接头和cfDNA的摩尔比为50:1-10:1。
实施例3:NNNNNNNN随机接头与KAPA建库试剂盒配套接头的文库构建得率比较
实验步骤与实施例1相同,除了所使用的接头序列为:
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GACGCT CTT CCG ATC TNN NNN NNN GTC AGT ACT---3’(SEQ ID NO:1)
R:5’---GT ACT GCA NNN NNN NNA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGTCAC ATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG---3’(SEQ ID NO:2);
其中,每一个N随机为A、G、C或T中的任一个;且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。(上述接头序列也购自生工生物工程(上海)有限公司)
Qubit实验结果如表8所示:
表8 Qubit实验结果
Claims (8)
1.cfDNA建库方法,包括下述步骤:
(1)末端修复后纯化;
(2)在已修复的cfDNA片段的3'端加上一个“A”碱基,并纯化;
(3)用DNA连接酶将随机接头连接至已加A的cfDNA片段的两端,并纯化;
(4)再次纯化加接头的cfDNA片段;
(5)通过PCR扩增文库并纯化产物;
其中,步骤(3)中所述的随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物:
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCTCTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T--- 3’ (SEQ ID NO:1)
R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC ATCACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG--- 3’ (SEQ ID NO:2)
其中,N为随机碱基,每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个;N的数量,即x为选自3-20中的一个数;且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。
2.根据权利要求1的建库方法,其中x为6或8。
3.根据权利要求1的建库方法,其中步骤(3)中所使用的随机接头的制备方法是:将合成好的多条序列分别稀释至10 μM的浓度;然后分别取20 μl混合均匀,转移至PCR管中;将混合好的溶液置于PCR仪中,设置温度为95 ℃,孵育5 min;孵育完成后,直接关闭PCR仪,继续孵育2 小时;获得制备好的随机接头。
4.根据权利要求1-3任一项的建库方法,其中步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为5-300:1。
5.权利要求4的建库方法,其中步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为10-100:1。
6.权利要求5的建库方法,其中步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为50-100:1。
7.随机接头在cfDNA建库中的应用,其中所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物:
F:5’---AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCTCTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T--- 3’ (SEQ ID NO:1)
R:5’---GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC ATCACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG--- 3’ (SEQ ID NO:2)
其中,N为随机碱基(即随机核苷酸),每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个;N的数量,即x为选自3-20中的一个数;且每一条序列中C+G含量保持在40-50%。
8.根据权利要求7的应用,其中x为6或8。
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CN107794256A (zh) | 2018-03-13 |
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