CN104232619A - 一种扩增游离dna的方法 - Google Patents
一种扩增游离dna的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104232619A CN104232619A CN201410468186.3A CN201410468186A CN104232619A CN 104232619 A CN104232619 A CN 104232619A CN 201410468186 A CN201410468186 A CN 201410468186A CN 104232619 A CN104232619 A CN 104232619A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- dna
- base
- free dna
- dissociative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明涉及一种扩增游离DNA的方法，包括如下步骤：设计并合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3’端为T碱基，从寡核苷酸甲3’端的第二个碱基与寡核苷酸乙5’端开始互补；将寡核苷酸乙5’端用磷酸根修饰；经退火反应得到接头DNA。另将游离DNA末端补平后经加A反应，得到有A粘性末端的游离DNA；以接头DNA和有A粘性末端的游离DNA进行连接反应得到的产物为模板，利用寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增。本方法能够最大程度上保留DNA片段的完整性，防止游离DNA进一步片段化，利用该方法能够获得足以满足常规检测的游离DNA模板。
Description
技术领域
本发明属于DNA扩增领域，具体涉及一种扩增游离DNA的方法。
背景技术
游离DNA存在于血浆、血清或其他体液中的含量较少，且多为DNA分子片段，致使其在提取过程中容易丢失，提取难度增大，提取量较少，难以满足常规检测的要求，导致检测灵敏度较低。如何获得足以满足常规检测的游离DNA已经成为亟待解决的问题。
常规的基因组扩增方法主要有以下两种：一是利用随机引物与DNA的任意位置相结合并扩增，从而获得大量的随机长度的DNA；二是先利用限制性内切酶切割DNA，使其形成长度不等的酶切DNA片段，然后在其酶切形成的粘性末端连接接头，最后以接头DNA为模板进行DNA扩增。这两种方法的缺点是，扩增产物DNA分子长度小于原来的DNA分子，DNA分子的完整性遭到破坏，不能保证基因组DNA分子的全长扩增，尤其是对于由小片段DNA分子构成的基因组DNA样本，很难保证在一条基因组DNA分子片段上同时存在2个酶切位点；常规的基因组扩增还会使得基因组，小片段产物过多，导致用于常规检测的有效DNA模板量不足。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种扩增游离DNA的方法，保证常规检测的有效DNA模板量充足，并且保证基因组DNA分子的全长扩增，步骤如下：
1.制备接头DNA：合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3’端为T碱基，从寡核苷酸甲3’端的第二个碱基与寡核苷酸乙5’端开始互补；将寡核苷酸乙5’端用磷酸根修饰；经退火反应得到接头DNA；
2.游离DNA的预处理：将游离DNA末端补平后经加A反应，得到有A粘性末端的游离DNA；
3.将步骤1得到的接头DNA和步骤2得到的有A粘性末端的游离DNA进行连接反应，得到连接产物；
4.利用步骤3所述的连接产物为模板，利用步骤1中的寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增。
以下对本发明做进一步说明。
所述游离DNA取自于血浆、血清、其他体液中。
所述的寡核苷酸甲长度为10-50个碱基，所述的寡核苷酸乙长度为5-47个碱基，寡核苷酸甲的碱基数比寡核苷酸乙多3-30个。
在上述方法中，步骤1所述的磷酸根修饰是通过T4多聚核苷酸激酶实现的。
在上述方法中，步骤2所述的末端补平是通过T4 DNA聚合酶实现的。
在上述方法中，步骤所述的加A是通过Taq DNA聚合酶实现的。
在上述方法中，步骤3所述的接头DNA和有A粘性末端的游离DNA的连接是通过T4DNA连接酶实现的。
在上述方法中，步骤4中PCR扩增反应过程如下：
(a)60～73℃下接头延伸5～10min，
(b)90～100℃下预变性3～10min，
(c)90～100℃下变性10～30s，
(d)68～73℃下退火(每个循环较前一循环降低0.5℃)10～30s，
(e)68～73℃下延伸1～5min，
(f)重复(c)～(e)30个循环，
(g)90～100℃下变性10～30s，
(h)53～58℃下退火10-30s，
(i)68～73℃下延伸1-5min，
本发明方法具有以下优越性：1、解决了利用随机引物与DNA的任意位置相结合并扩增方法中产物DNA分子的完整性遭到破坏，不能保证基因组DNA分子全长扩增的问题。2、 解决了先利用限制性内切酶切割DNA，后在其粘性末端连接接头，最后以接头DNA为模板进行扩增的方法中DNA分子进一步片段化的问题，本方法能够在扩增的同时最大程度上保留DNA片段的完整性，防止游离DNA进一步片段化，利用该方法能够获得足以满足常规检测的游离DNA模板。
附图说明
图1是实施例1和实施2中游离DNA起始量和获得量对比图。
图2是实施例1和实施2的电泳图像。
图3中A为实施例1和实施2荧光定量PCR扩增曲线，B为未经处理的血浆游离DNA荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实验对本发明进行进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
(1)设计并合成甲乙二条寡核苷酸：寡核苷酸甲：5’-GCG GTG ACC CGG GAG ATC TGA ATT CT-3’，寡核苷酸乙：5’-GAA TTC AGA TC-3’。
(2)寡核苷酸乙5’端磷酸根修饰，反应如下(总体系50μl)：
轻柔吹打混匀，37℃水浴60min，75℃水浴10min灭活。
(3)退火反应(总体系100μl)：
反应条件如下：
95℃ 2min
95℃(每90sec下降1℃，降至25℃)
4℃保温
所得产物即为接头DNA。
(4)游离DNA的末端补平：利用100ng经过酚/氯仿/异戊醇法提取的游离DNA，进行如下反应(总体系10μl)：
使用AxyPrepPCR清洁试剂盒纯化DNA，溶解于25μlEluent溶液中。
(5)经末端补平后的游离DNA的加A反应：利用步骤(4)所得产物，进行如下反应(总体系50μl)：
使用AxyPrepPCR清洁试剂盒纯化DNA，样品溶解于25μlEluent溶液中。
(6)将步骤(3)得到的接头DNA和步骤(5)得到有A粘性末端的游离DNA进行连接反应，反应体系如下(总体系30μl)：
反应条件如下：
4℃ 12h
70℃ 10min
(7)以步骤(6)产物为模板，步骤(1)中的寡核苷酸为引物，进行PCR扩增反应：
PCR扩增反应体系(20μl)：
PCR扩增反应过程如下：
(a)60～73℃下接头延伸5～10min，
(b)90～100℃下预变性3～10min，
(c)90～100℃下变性10～30s，
(d)68～73℃下退火(每个循环较前一循环降低0.5℃)10～30s，
(e)68～73℃下延伸1～5min，
(f)重复(c)～(e)30个循环，
(g)90～100℃下变性10～30s，
(h)53～58℃下退火10-30s，
(i)68～73℃下延伸1-5min，
(j)重复(g)～(i)10个循环，
(k)68～73℃下延伸5～10min，
(l)-20～37℃下保温。
如图1所示步骤(7)的产物经纯化后游离DNA的获得量为1775ng。
实施例2
步骤(4)中游离DNA为10ng，其它步骤同实施例1。
如图1所示步骤(7)的产物经纯化后游离DNA的获得量为1050ng。
实施例1和实施例2扩增前后游离DNA起始量和获得量对比如图1所示。
取实施例1和实施2产物进行电泳，结果如图2所示，其中泳道1为DL2000 DNA Marker，泳道1为实施例1产物，泳道2为实施例2产物。
实施例1产物、实施例2产物以及血浆游离DNA经过qPCR扩增GAPDH基因，上游引物：5’-GGA CTG AGG CTC CCA CCT TT-3’，下游引物：5’-GCA TGG ACT GTG GTC TGC AA-3’；反应体系：10μl的2×qPCR Mix、0.5μl的上游引物(10mM)、0.5μl的下游引物(10mM)、2μl的实施例产物、7μl的ddH2O；反应条件：95℃5min，95℃15s，58℃15s，72℃30s，50个循环，72℃检测荧光，72℃5min。扩增曲线如图3所示，其中A为实施例1产物和实施例2产物扩增曲线，B为未经处理的血浆游离DNA扩增曲线。
结果表明：本方法可保证常规检测的有效DNA模板量充足，提高了检测灵敏度，并且保证基因组DNA分子的全长扩增。
Claims (8)
1.一种扩增游离DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3’端为T碱基，从寡核苷酸甲3’端的第二个碱基与寡核苷酸乙5’端开始互补；将寡核苷酸乙5’端用磷酸根修饰；经退火反应得到接头DNA；
(2)将游离DNA末端补平后经加A反应，得到有A粘性末端的游离DNA；
(3)将步骤(1)得到的接头DNA和步骤(2)得到的有A粘性末端的游离DNA进行连接反应，得到连接产物；
(4)利用步骤(3)得到的连接产物为模板，步骤(1)中的寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述游离DNA取自于血浆、血清、其他体液中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的寡核苷酸甲长度为10-50个碱基，所述的寡核苷酸乙长度为5-47个碱基，寡核苷酸甲碱基数比寡核苷酸乙多3-30个。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的磷酸根修饰是通过T4多聚核苷酸激酶实现的。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的末端补平是通过T4 DNA聚合酶实现的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的加A是通过Taq DNA聚合酶实现的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的连接是通过T4 DNA连接酶实现的。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中PCR扩增反应过程如下：
(a)60～73℃下接头延伸5～10min，
(b)90～100℃下预变性3～10min，
(c)90～100℃下变性10～30s，
(d)68～73℃下退火(每个循环较前一循环降低0.5℃)10～30s，
(e)68～73℃下延伸1～5min，
(f)重复(c)～(e)30个循环，
(g)90～100℃下变性10～30s，
(h)53～58℃下退火10-30s，
(i)68～73℃下延伸1-5min，
(j)重复(g)～(i)10个循环，
(k)68～73℃下延伸5～10min，
(l)-20～37℃下保温。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410468186.3A CN104232619A (zh) | 2014-09-12 | 2014-09-12 | 一种扩增游离dna的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410468186.3A CN104232619A (zh) | 2014-09-12 | 2014-09-12 | 一种扩增游离dna的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104232619A true CN104232619A (zh) | 2014-12-24 |
Family
ID=52221517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410468186.3A Pending CN104232619A (zh) | 2014-09-12 | 2014-09-12 | 一种扩增游离dna的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104232619A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567684A (zh) * | 2016-01-21 | 2016-05-11 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法及应用 |
| CN107794256A (zh) * | 2016-09-01 | 2018-03-13 | 埃提斯生物技术（上海）有限公司 | cfDNA建库方法及试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001085932A2 (en) * | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Aventis Pasteur Limited | Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof |
| CN103602726A (zh) * | 2013-10-21 | 2014-02-26 | 田埂 | 同时对多种核酸样本进行测序的方法 |
-
2014
- 2014-09-12 CN CN201410468186.3A patent/CN104232619A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001085932A2 (en) * | 2000-05-10 | 2001-11-15 | Aventis Pasteur Limited | Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof |
| CN103602726A (zh) * | 2013-10-21 | 2014-02-26 | 田埂 | 同时对多种核酸样本进行测序的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| MATTHEW J. OBERLEY 等: "High-Throughput Screening of Chromatin Immunoprecipitates Using CpG-Island Microarrays", 《METHODS IN ENZYMOLOGY》 * |
| SHINYA OKANO 等: "Genetic Analysis of Jumbled Spine and Ribs (Jsr) Mutation Affecting the Vertebral Development in Mice", 《BIOCHEMICAL GENETICS》 * |
| 张虎成 主编: "《基因操作技术》", 30 September 2010, 化学工业出版社 * |
| 李小波: "孕妇血浆游离DNA的定量分析及在产前诊断中的应用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 医药卫生科技辑》 * |
| 胡福泉 主编: "《现代基因操作技术》", 31 October 2000, 人民军医出版社 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567684A (zh) * | 2016-01-21 | 2016-05-11 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法及应用 |
| CN107794256A (zh) * | 2016-09-01 | 2018-03-13 | 埃提斯生物技术（上海）有限公司 | cfDNA建库方法及试剂盒 |
| CN107794256B (zh) * | 2016-09-01 | 2021-10-22 | 上海思路迪医学检验所有限公司 | cfDNA建库方法及试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Martens-Uzunova et al. | Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer | |
| CN110191961B (zh) | 制备经不对称标签化的测序文库的方法 | |
| ES2749463T3 (es) | Captura, detección y cuantificación de ARN pequeño | |
| CN113330121A (zh) | 用于循环细胞分析的方法 | |
| Krishnan et al. | The challenges and opportunities in the clinical application of noncoding RNAs: the road map for miRNAs and piRNAs in cancer diagnostics and prognostics | |
| JP2016511007A (ja) | 鎖になったｒｎａまたはｄｎａのライブラリを生成するための方法、組成物およびキット | |
| HRP20201744T1 (hr) | Novi postupci proizvodnje oligonukleotida | |
| Khawar et al. | MicroRNAs: Recent insights towards their role in male infertility and reproductive cancers | |
| RU2017132895A (ru) | Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая микроРНК в качестве активного ингредиента | |
| CN107075513A (zh) | 分离的寡核苷酸及其在核酸测序中的用途 | |
| EP3730628A1 (en) | Polynucleotide adapter design for reduced bias | |
| USRE49207E1 (en) | Transposase-random priming DNA sample preparation | |
| EP3685386A1 (en) | Methods and systems for differentiating somatic and germline variants | |
| Conn et al. | SplintQuant: a method for accurately quantifying circular RNA transcript abundance without reverse transcription bias | |
| CN103509789B (zh) | 一种用于扩增短链rna的引物及其相关方法 | |
| Bansal et al. | Common genetic variants in pre-microRNAs and risk of breast cancer in the North Indian population | |
| CN104232619A (zh) | 一种扩增游离dna的方法 | |
| CN105247071A (zh) | 使用等位基因特异的反应性引物的核酸扩增方法 | |
| Johannsen et al. | Enzymatic polymerisation involving 2′-amino-LNA nucleotides | |
| CN1763223B (zh) | miRNA检测方法 | |
| EP3044326B1 (en) | Application of oligo-dt molecules to avoid generation of high molecular pcr products induced by polya-carrier | |
| CN105441426A (zh) | 一种外周血游离dna靶向富集的方法及试剂盒 | |
| CN107406891A (zh) | Pcr方法 | |
| CN101886131A (zh) | 用两性离子化合物提高核酸杂交特异性的方法 | |
| CN104878101A (zh) | 一种基于定位探针介导剪切和扩增的核酸检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141224 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |