CN101886131A - 用两性离子化合物提高核酸杂交特异性的方法 - Google Patents

用两性离子化合物提高核酸杂交特异性的方法 Download PDF

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Abstract

提供提高核酸杂交特异性的方法，包括在含有选自以下的两性离子化合物的溶液中杂交核酸：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。所述方法允许在多重PCRs中减小非特异性杂交产物的产率而同时保持目标杂交产物的产率，由此提高核酸杂交的特异性。因此，所述方法能够有效地用于特定病原体的鉴定、遗传性疾病的诊断、基因序列的分析等等。

Description

用两性离子化合物提高核酸杂交特异性的方法
本申请是中国申请200610168642.8的分案申请，该母案的申请日为2006年12月20日，本分案采用了与该母案一致的发明名称。
技术领域
本发明涉及用特定的两性离子化合物提高核酸杂交特异性的方法。
背景技术
杂交特异性(也称为杂交严格性)指当两条互补核酸和非互补核酸进行杂交时，互补核酸相互形成特异性杂合体的程度。总的来说，已试图通过调整缓冲液中的盐浓度和反应温度，或者通过加入添加剂如Denhart溶液，或添加非特异性DNA或RNA以诱导杂交竞争来获得更高的杂交特异性。
聚合酶链式反应(PCR)是扩增核酸的方法，包括核酸的变性、退火和延伸，在退火进程期间，发生探针与目标核酸的杂交。可以根据探针与目标核酸之间的同源程度更改PCR的条件。当在给定PCR条件下提高退火温度时，非特异性杂交产物的产率下降，然而，当降低退火温度时，非特异性杂交产物的产率增加。
杂交特异性对聚合酶链式反应(尤其是对多重PCR)有不利影响。多重PCR使待扩增的不同基因能够在同一反应中同时扩增。也就是说，将能够扩增各自的目标序列的不同引物组放在一个反应器中，目标序列的扩增在单个PCR中同时进行。用于多重PCR的引物应当只对目标DNA序列是特异性的，并且不应干扰其它引物的反应，这样目标DNAs可以充分地扩增。多重PCR产生许多目标杂交产物，它们由许多的电泳条带所显示。因此，如果退火过程中杂交特异性低，那么除了许多目标条带之外，在电泳凝胶上还会出现许多的条带，在多重PCR结果分析中带来问题。因此，强烈需要提高杂交特异性。
美国专利4,936,963公开了是使用两性离子物质组氨酸减少电泳所用时间以降低电泳中总传导率的方法。该发明利用两性离子物质，本发明也利用两性离子物质。然而，其使用两性离子物质的目的是减少电泳所用时间，不同于本发明的目的，本发明的目的是提高核酸杂交特异性。
出于这种考虑，本发明的发明人进行了研究，目的是解决相关领域现有技术所暴露出来的问题，发现核酸杂交特异性的提高可以通过向核酸杂交反应体系尤其是多重PCR中添加特定的两性离子化合物来诱导。
发明内容
本发明提供通过在含特定两性离子化合物的溶液中杂交核酸来提高核酸杂交特异性的方法。
根据本发明的一个方面，提供了提高核酸杂交特异性的方法，该方法包括在含两性离子化合物的溶液中杂交核酸，所述两性离子化合物选自3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propane sulfonate)(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
根据本发明的另一个方面，提供了扩增目标核酸的方法，该方法包括在含两性离子化合物的溶液中杂交引物和目标核酸，所述两性离子化合物选自3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
根据本发明的另一个方面，提供了用于核酸杂交的包含两性离子化合物的溶液，所述两性离子化合物选自3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
根据本发明的另一个方面，提供了包含用于核酸杂交的溶液的核酸杂交试剂盒，所述溶液包含两性离子化合物，所述两性离子化合物选自3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
更具体地，本发明涉及：
1.提高核酸杂交特异性的方法，所述方法包括：
在含有选自以下的两性离子化合物的溶液中杂交核酸：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
2.项1的方法，其中所述两性离子化合物的浓度以重量计为0.2至3％。
3.项1的方法，其中所述杂交选自：DNA与DNA之间的杂交、DNA与RNA之间的杂交，以及RNA与RNA之间的杂交。
4.扩增目标核酸的方法，所述方法包括在溶液中杂交引物和目标核酸，所述溶液含有选自以下的两性离子化合物：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
5.项4的方法，其中使用聚合酶链式反应(PCR)实施目标核酸的扩增。
6.项5的方法，其中所述聚合酶链式反应为多重PCR。
7.项4的方法，其中所述引物对于大量病原体的检测是特异性的。
8.项4的方法，其中所述两性离子化合物的浓度以重量计为0.2至3％。
9.用于核酸杂交的溶液，其含有选自以下的两性离子化合物：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
10.核酸杂交试剂盒，其包含项9的用于核酸杂交的溶液。
附图说明
通过参考附图详细描写其示例性实施方案，本发明上述以及其他特征和优势将更为明显，其中：
图1为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降；
图2为目标杂交产物和非特异性杂交产物的产率的定量评估中，用Agilent 2100 Bioanalyzer获得的谱图；
图3为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降；
图4为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降；和
图5为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加甜菜碱时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降。
具体实施方式
现在将参考附图更为充分地描述本发明，附图中显示本发明的示例性实施方案。然而，本发明可以许多不同形式来具体体现，而不应理解为限于本文所列出的实施方案；相反，提供这些实施方案将使本公开全面和完整，将充分地为本领域技术人员传达本发明的构思。
核酸杂交指不同来源的核酸之间的结合，杂交的条件可以根据所要结合的核酸的序列同源性而有所不同。换句话说，如果受试核酸之间的序列同源性高，则使用严格条件，如果序列同源性低，则使用温和条件。当杂交条件严格时，杂交特异性提高，此杂交特异性的提高导致非特异性杂交产物产率的下降。然而，在温和杂交条件下，杂交特异性下降，此杂交特异性的下降导致非特异性杂交产物产率的提高。尤其在后一种情况下，需要降低非特异性杂交产物的水平，因此，在本发明中，尝试通过在含特定两性离子化合物的溶液中杂交核酸而提高核酸杂交特异性。
核酸之间的杂交可以分为DNA与DNA之间的杂交、DNA与RNA之间的杂交、和RNA与RNA之间的杂交。核酸杂交反应通常分为Southern杂交反应或Northern杂交反应。核酸杂交反应对于DNA芯片尤其重要，因为实施杂交反应时，可能影响特异于探针的目标核酸的快速检测，其中所述探针固定在芯片上，且含目标核酸的样品添加到固定的探针上。
根据本发明的实施方案，提供通过在含特定两性离子化合物的溶液中杂交核酸来提高核酸杂交特异性的方法。两性离子化合物指在中性溶液中能够同时作为酸和碱起作用的化合物。两性离子化合物的例子包括甜菜碱、氨基酸、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)等。两性离子化合物甜菜碱和CAPS具有如下所示的结构。
Figure BSA00000182943600051
甜菜碱
大多数情况下，两性离子化合物在核酸杂交反应中都倾向于提高核酸杂交特异性，因此降低非特异性杂交产物的产率，但不幸的是，相同化合物也降低目标杂交产物的产率。然而，一些两性离子化合物显示出所期望的特征，即降低非特异性杂交产物的产率而提高核酸杂交特异性，同时维持目标杂交产物的产率。本发明的发明人发现了具有此期望特征的两性离子化合物，包括3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)等。
当将根据本发明实施方案的这种两性离子化合物添加到核酸杂交反应体系时，核酸杂交反应的特异性提高，结果可以减少假阳性条带的产生，假阳性条带的产生在杂交反应期间带来显著的问题。假阳性条带是分离目标基因方法的结果，其在核酸杂交反应的特异性下降时大量产生。这些假阳性条带使得目标杂交产物的分离很困难，在处理时间和操作成本方面给分离目标基因的方法带来不利影响。因此，目标基因的分离强烈需要消除这样的非特异性杂交产物。
根据本发明的实施方案，两性离子化合物的浓度以重量计可以为0.2至3％。当两性离子化合物的浓度以重量计低于0.2％时，核酸杂交特异性降低，降低非特异性杂交产物产率的效果将因此下降。当两性离子化合物的浓度以重量计高于3％时，目标杂交产物的产率下降。
根据本发明的另一实施方案，提供了扩增目标核酸的方法，包括在溶液中杂交引物和目标核酸，所述溶液含有选自以下的两性离子化合物：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。
根据本发明当前的实施方案，扩增目标核酸的方法包括变性、退火和延伸，探针与目标核酸之间的杂交发生在退火过程期间。当把根据本发明实施方案的两性离子化合物添加到杂交反应体系时，探针与目标核酸之间的杂交特异性增强。此核酸杂交特异性的增强导致非特异性扩增产物产率的降低，只有所需的目标杂交产物特异地扩增。
扩增目标核酸的方法的例子包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增、核酸依赖的扩增、修复链式反应(repair chain reaction)、解旋酶链式反应(helicase chain reaction)、QB复制酶扩增、以及连接(反应)激活的转录(ligation activated transcription)，优选使用聚合酶链式反应实施目标核酸的扩增。
根据本发明的实施方案，PCR为多重PCR。根据本发明当前实施方案的扩增目标核酸的方法预计用于增强核酸杂交反应的特异性，更具体地，预计用于消除目标基因扩增期间多重PCR的非特异性杂交产物，其可用于鉴定大量病原体。大多数情况下，两性离子化合物都倾向于提高核酸杂交反应中的核酸杂交特异性，因此降低非特异性杂交产物的产率，但不幸的是，同样的化合物也降低目标杂交产物的产率。然而，一些两性离子化合物显示出所期望的特征，即降低非特异性杂交产物的产率而提高核酸杂交特异性，同时维持目标杂交产物的产率。这些所期望的特征构成能够通过降低多重PCR中的假阳性条带正确鉴定特异性病原体的基本要素。
非特异性杂交产物的产生成为多重PCR中的特殊问题。多重PCR允许通过单一PCR检测大量基因，电泳凝胶上出现许多条带。在多重PCR中，如果除了所需大小的基因杂交产物的条带之外，还产生太多非特异性杂交产物的条带，则不可能进行特异性病原体的正确鉴定。因此，在多重PCR中，有必要减少非特异性杂交产物条带的数目。当把适量的根据本发明实施方案的两性离子化合物添加到多重PCR中时，非特异性杂交产物条带的数目明显减少。
根据本发明的另一实施方案，多重PCR消除非特异性杂交产物，而保留目标杂交产物。如以上所讨论的，当把适量的两性离子化合物添加到多重PCR和时，非特异性杂交产物条带的数目明显减少。然而，如果目标杂交产物的产率也随着非特异性杂交产物的减少而降低，则不能获得所需的效果。大多数情况下，两性离子化合物同时降低非特异性杂交产物的产率和目标杂交产物的产率。然而，当使用根据本发明实施方案的两性离子化合物时，有利地，同时减小非特异性杂交产物的产率和维持目标杂交产物的产率。
根据本发明的另一实施方案，可以以按重量计0.2至3％的浓度使用所述两性离子化合物。当两性离子化合物的浓度以重量计低于0.2％时，核酸杂交特异性降低，降低非特异性杂交产物产率的效果将因此降低。当两性离子化合物的浓度以重量计高于3％时，目标杂交产物的产率将降低。
根据本发明的另一实施方案，引物对大量病原体的检测来说是特异的。当使用根据本发明实施方案的两性离子化合物实施多重PCR时，非特异性杂交产物的条带数目减少，同时维持目标杂交产物的产率。因此，现在可以轻易地解决现有技术中存在的问题，所述问题即由于非特异性杂交产物的高产率而难以正确检测大量的基因。大量基因的检测包括与病原体、遗传性疾病等等相关的基因序列的分析。例如，导致人类呼吸性疾病的最常见的病毒包括麻疹病毒、肠道病毒、鼻病毒、SARS相关冠状病毒(SARS-coV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、腺病毒、人副流感病毒1(HPIV 1)、人副流感病毒2(HPIV2)、人副流感病毒3(HPIV 3)、流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、呼吸道合胞病毒A(RSVA)、和呼吸道合胞病毒B(RSVB)。快速特异地检测这些病毒对于诊断、预放和治疗呼吸性疾病是必需的，通过使用根据本发明实施方案的两性离子化合物实施多重PCR，可以快速正确地检测所述病毒。
根据本发明的另一实施方案，提供了用于核酸杂交的溶液，所述溶液含有选自以下的两性离子化合物：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。根据本发明当前实施方案的用于核酸杂交的溶液含有核酸杂交反应所需的多种化合物。当使用根据当前实施方案的用于核酸杂交的溶液实施核酸杂交反应时，核酸杂交的特异性增强，可以获得更好的杂交结果，其中除了所述的多种化合物之外，所述溶液还含有根据本发明实施方案的两性离子化合物。核酸杂交反应对于DNA芯片是尤其重要的。当探针固定在芯片上时，向其添加含有目标核酸的样品，用本实施方案的核酸杂交溶液实施核酸杂交反应，由此可以快速地检测特异于探针的目标核酸。
根据本发明的另一实施方案，提供包含用于核酸杂交的溶液的核酸杂交试剂盒，所述溶液含有选自以下的两性离子化合物：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)、和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。所述核酸杂交试剂盒可以包含核酸杂交必需的多种组成成分，所述组成成分可能是本领域普通技术人员所熟知的。
以下将参考实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于说明性目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：多重PCR中CAPS对核酸杂交特异性的影响
从呼吸道感染的主要病原体流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)(来自Samsung Medical Center)分离基因组DNA(gDNA)，作为多重PCR的模板，以0.2ng或1ng的量使用所分离的gDNA。以0.5％或1％的浓度使用作为根据本发明实施方案的两性离子化合物的3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)，以实施多重PCR。用GeneAmp PCR系统9700(ABI)、PCR混合物(模板gDNA0.2ng或1ng、CAPS 0.5％或1％、1×Taq Pol缓冲液、dNTP混合物每种200μM、PCR引物每种400nM(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10)、和Taq Pol 5个单位)，于95℃1分钟，使DNA完全变性，然后对所述PCR混合物进行25个PCR循环(95℃5秒、62℃13秒、72℃15秒)，72℃最后延伸1分钟，如此实施多重PCR。
图1为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加CAPS时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降。由图1可以看到，与没有添加CAPS的样品(称为-CAPS)相比，添加有CAPS的样品(称为+CAPS)中非特异性杂交产物条带的强度明显降低，当CAPS的浓度提高时，非特异性杂交产物条带的强度显著降低。在添加有CAPS(+CAPS)的情况下，非特异性杂交产物条带的强度显著降低，但保持了目标杂交产物条带的强度。此外，当如预期的增加模板DNA的量时，目标杂交产物的量和非特异性杂交产物的量也增加。
在用CAPS处理期间，为了定量评估产生目标杂交产物和非特异性杂交产物的程度，使每种PCR产物都进行电泳，然后用Agilent 2100Bioanalyzer检测荧光。
图2为目标杂交产物和非特异性杂交产物的产率定量评估中用Agilent2100Bioanalyzer获得的谱图。参见图2，在图2主图下面的放大图中所示的两条曲线当中，上曲线对应于用0.2ng gDNA而未经CAPS处理所获得的图线，下曲线对应于用经0.5％CAPS处理的0.2ng gDNA获得的图线。箭头指示非特异性杂交产物的条带位置。如图2所示，无论gDNA是否经由CAPS处理过，目标杂交产物条带的强度都几乎是一致的。然而，当用CAPS处理时，非特异性杂交产物的条带大部分被消除。
因此，可以看到，当把根据本发明实施方案的两性离子化合物CAPS添加到多重PCR中时，非特异性杂交产物的产率明显降低，同时保持了目标杂交产物的产率。由此发现添加CAPS可用于检测特定病原体。
实施例2：多重PCR中CAPSO和CHES对核酸杂交特异性的影响
为研究多重PCR中不同类型两性离子化合物的核酸杂交特异性，还使用了CAPSO和CHES。以与实施例1中相同的方式进行相同的试验，不同之处是分别向多重PCR添加浓度为0.2％、0.4％、0.8％和1.6％的CAPSO和CHES，并使用1ng的流感嗜血杆菌gDNA模板。
图3为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加CAPSO时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降。参见图3，对对照物进行不添加CAPSO的多重PCR。由图3可以看到，与不添加CAPSO的情况相比，在添加CAPSO的情况下，非特异性杂交产物条带的强度显著降低，并且更高的CAPSO浓度导致条带强度更显著的降低。图4为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加CHES时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降。如图4所示，CHES产生与CAPSO类似的结果。
实施例3：多重PCR中两性离子化合物的类型对核酸杂交特异性的影响
使用甜菜碱研究多重PCR中不同类型两性离子化合物的核酸杂交特异性。以与实施例1中相同的方式实施相同的试验，不同之处是用Solgent，Inc.的5×频带辅助器具(band doctor)以2.5μl(0.25×)、5μl(0.5×)、10μl(1×)、和15μl(1.5×)的量将甜菜碱添加到多重PCR中，并且分别以1ng、0.1ng和0.01ng的量使用流感嗜血杆菌gDNA模板。
图5为显示PCR产物电泳分析结果的照片，所述PCR产物在向多重PCR添加甜菜碱时获得，结果显示非特异性杂交产物的产率下降。参见图5，对照实施不添加甜菜碱的多重PCR，数字″1″、″2″和″3″指用于PCR的模板gDNA的量，例如分别为1ng、0.1ng和0.01ng。由图5可以看到，与不添加甜菜碱的情况相比，在添加甜菜碱的情况下，非特异性杂交产物条带的强度显著降低，并且更高的甜菜碱浓度导致条带强度更显著的降低。然而，可以看到，与CAPS的情况不同，虽然随着甜菜碱浓度的不断增加，非特异性杂交产物条带的强度显著降低，但目标杂交产物条带的强度也显著降低。因此，显示甜菜碱不适合于提高核酸杂交特异性以检测特定病原体的目的。
因此，并非所有的两性离子化合物都显示本发明的效果，只有特定的两性离子化合物如CAPS能够导致非特异性杂交产物条带强度的降低，同时保持目标杂交产物条带的强度。
如以上所讨论的，根据本发明实施方案的方法允许在多重PCR中减小非特异性杂交产物的产率，同时保持目标杂交产物的产率，因此提高核酸杂交的特异性，可以有效地用于特定病原体的鉴定、遗传性疾病的诊断、基因序列的分析等等。
虽然已经详细地展示了本发明并参考其示例性实施方案描述了本发明，但本领域普通技术人员会了解可以在其中作出多种形式上和细节上的改变，而不背离下述权利要求确定的本发明的精神和范围。
Figure ISA00000182943800011
Figure ISA00000182943800021

Claims (2)

1.提高核酸杂交特异性的方法，所述方法包括：
在含有选自以下的两性离子化合物的溶液中杂交核酸：3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)和2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)，其中CAPS在溶液中的浓度以重量计为0.2至3％，CAPSO和CHES在溶液中的浓度以重量计为0.8至3％。
2.权利要求1的方法，其中所述杂交选自：DNA与DNA之间的杂交、DNA与RNA之间的杂交，以及RNA与RNA之间的杂交。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2692894T3 (es) 2011-06-08 2018-12-05 Life Technologies Corporation Diseño y desarrollo de nuevos detergentes para su uso en sistemas de PCR
US9567628B2 (en) 2011-06-08 2017-02-14 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points
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JP2018068268A (ja) * 2016-11-04 2018-05-10 株式会社Ｇｓｐ研究所 染色体の構造異常を迅速に検出するための方法、促進剤およびそれを含むキット
CN109486909A (zh) * 2018-11-08 2019-03-19 中国医科大学 普鲁兰多糖对于提高核酸扩增特异性的应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4936963A (en) 1987-05-27 1990-06-26 Abbott Laboratories Polycationic buffers and method for gel electrophoresis of nucleic acids
WO1990002204A1 (en) 1988-08-31 1990-03-08 Research Development Foundation Manual in situ hybridization assay
US5853986A (en) * 1990-04-02 1998-12-29 Becton Dickinson And Company Chemical promotion of nucleic acid hybridization
US6045996A (en) * 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5935825A (en) 1994-11-18 1999-08-10 Shimadzu Corporation Process and reagent for amplifying nucleic acid sequences
US6114150A (en) * 1995-11-29 2000-09-05 Yale University Amplification of nucleic acids
JP4213216B2 (ja) * 1996-09-06 2009-01-21 ナノゲン・インコーポレイテッド エレクトロニック・ハイブリダイゼーション反応の最適化のための方法および物質
US6210881B1 (en) * 1996-12-30 2001-04-03 Becton, Dickinson And Company Method for reducing inhibitors of nucleic acid hybridization
US6914137B2 (en) 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
US6130040A (en) 1998-01-08 2000-10-10 Lin; Shi-Lung Method for generating directly covalent bonding between interstrand nucleotides
US6441152B1 (en) * 1998-12-08 2002-08-27 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for the identification of nucleic acids electrostatically bound to matrices
US20020137060A1 (en) * 2000-08-09 2002-09-26 Brown-Augsburger Patricia Lea Combined hybridization-detection assays for determining nucleic acid concentrations in biological fluids
CA2428757A1 (en) 2000-11-15 2002-07-18 Roche Diagnostics Corporation Methods and reagents for identifying rare fetal cells in the maternal circulation
US6812341B1 (en) * 2001-05-11 2004-11-02 Ambion, Inc. High efficiency mRNA isolation methods and compositions
EP1706502A4 (en) * 2003-11-26 2007-05-23 Eppendorf Ag METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN VITRO AMPLIFICATION OF EXTRACHROMOSOMIC NUCLEIC ACID
EP1584923A3 (en) * 2004-04-07 2006-01-04 Roche Diagnostics GmbH Stabilization of biomolecules in samples

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