CN107793405B - 一种接力识别型荧光探针及其合成与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光化合物的制备及金属离子检测应用领域，具体涉及到一种接力识别型荧光探针及其合成与应用；本发明将一定量的化合物C₁₄H₁₃O₄N和5‑氯‑2‑羟基苯胺溶于乙醇，添加一定量的乙酸和ZnO后，一定温度下油浴锅中搅拌回流反应；反应结束，冷却至室温，过滤去沉淀杂质，滤液旋蒸得粗产物，重结晶得微黄色产物，即是本发明所述的新型喹啉衍生物荧光探针；本发明所得到的探针对Cu2+和Cd2+离子检测的灵敏度很高，测量的检出限低，效果好；本发明的制备方法，相较于其他繁琐的合成方法，合成路线更为简单，采用纳米ZnO材料作催化剂，产率更高，成本更低。

Description

一种接力识别型荧光探针及其合成与应用

技术领域

本发明涉及一种荧光化合物的制备及金属离子检测应用领域，具体涉及到一种接力识别型荧光探针及其合成与应用。

背景技术

众所周知，随着人类社会工业化进程的不断发展，环境污染问题亦日益严峻，金属离子对环境的污染问题也一直备受关注。铜是人体内仅次于铁元素和锌元素的第三丰富的过渡金属元素,铜离子在生理过程中起着至关重要的作用。但是生物体内铜离子浓度的失衡也会相应地引发一系列疾病,例如帕金森综合症、门克斯氏综合征、阿兹海默症、威尔逊氏症、家族性肌萎缩侧索硬化症等。而镉作为一种毒性很强的重金属，它能够在人类体内积累十年以上，早在1974年就被联合国环境规划署定为重点污染物。镉离子(Cd²⁺)具有富集作用，半衰期长，不易生物降解，富集在人体中的镉离子能对肾、肺、骨骼及神经系统造成严重伤害，能够诱发多种疾病，比如肾功能不全，新陈代谢紊乱，前列腺癌等等。因此，快速、灵敏的金属离子检测方法具有非常重要的意义。

传统的金属离子检测方法，比如高效液相色谱法。质谱法、电化学法、原子吸收光谱法、电子耦合等离子体原子发射光谱法等存在很多缺点，如仪器昂贵成本高、操作繁琐等。近年来，具有选择性好，灵敏度高，检出限低，高效便捷等特点的荧光传感器方法，在金属离子检测方面已经发挥了重要的作用。

喹啉衍生物由于其优异的光化学物理性能，是一类被广泛应用的荧光化合物，且一般都具备生物活性，可以作为良好的医药中间体。从结构上看，一种看法是喹啉由吡啶和苯环稠和而成，因此它也具有类似于吡啶的化学性质，难溶于水但易溶于大多数有机溶剂。另一方面讲，喹啉结构类似于萘基团，亦可以看成是N代萘化合物，因此也被称作为N杂萘。由喹啉特殊的化学结构可知喹啉具有弱碱性，因此可与亲电、亲核试剂反应合成多种衍生化合物。由于吡啶环上的电子云密度低于苯环上的电子云密度，因而苯环上易发生亲电反应，吡啶环侧易发生亲核反应。喹啉作为一种具备刚性结构，宽夹缝，高量子产率，且易配位的荧光团，被广泛应用于荧光化合物研究中。而8-羟基喹啉由于其独特的结构特点，是仅次于EDTA的一种金属螯合剂，通过对8-羟基喹啉的分子结构进行修饰，使其对单一金属具备更强的螯合能力，是目前基于喹啉结构的荧光探针的研究热点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的技术缺陷，提供一种新颖的荧光探针设计思路，即基于一个探针分子可用于接力识别两种金属离子Cu²⁺和Cd²⁺，并且克服现有技术中存在的缺陷，能够成功排除Zn²⁺对Cd²⁺识别的干扰，高选择性识别Cd²⁺。

本发明的另一目的是提供上述新型喹啉衍生物的荧光探针的制备方法和应用。

本发明采取的技术方案如下：

本发明首先提供一种新型的喹啉衍生物作为荧光探针，其分子式为C₂₀H₁₅O₄N₂Cl，结构式如下：

上述荧光探针的制备方法如下：

(1)化合物3---C₁₄H₁₅O₃N(英文名：ethyl 2-((2-methylquinolin-8-yl)oxy)acetate；中文名：2-((2-甲基喹啉-8-基)氧基)乙酸乙酯)的合成：

将一定量的8-羟基-2-甲基喹啉溶于丙酮中，加入碳酸钾，溴乙酸乙酯，一定温度下搅拌回流，反应一段时间后，将溶液过滤，并用丙酮冲洗滤饼三次，将所得滤液旋蒸，得到油状产物。

其中所述加入的8-羟基-2-甲基喹啉的量为1.5-2.0g；

所述碳酸钾的加入量为4-10g，加入的溴乙酸乙酯的量为1.5-2.5g，加入的丙酮的量为20-40mL；

所述油浴锅中搅拌的温度为40-70℃，搅拌反应时间为12-24h。

(2)化合物2---C₁₄H₁₃O₄N(英文名：ethyl 2-((2-formylquinolin-8-yl)oxy)acetate；中文名：2-((2-甲酰基喹啉-8-基)氧基)乙酸乙酯)的合成：

将一定量的二氧化硒SeO₂于1,4-二氧六环中一定温度下油浴搅拌，一段时间内逐滴加入化合物3，滴加完毕后，继续升温搅拌反应一定时间后，冷却至室温，过滤除去沉淀，将滤液旋蒸得固态粗产物，将粗产物在乙酸乙酯/正己烷中重结晶得产物-化合物2。

其中所述二氧化硒SeO₂的加入量为0.5-1.0g；化合物3的加入量为1.0-2.0g；1,4-二氧六环的量为20-40mL.搅拌加样时间为15-30mins，搅拌加样温度为40-70℃；升温后反应温度为80-100℃；反应时间为1.5-3.0h。

(3)化合物1---C₂₀H₁₅O₄N₂Cl的合成：

将一定量的上述所得化合物2和5-氯-2-羟基苯胺溶于乙醇，添加一定量的乙酸和ZnO后，一定温度下油浴锅中搅拌回流反应。反应结束，冷却至室温，过滤去沉淀杂质，滤液旋蒸得粗产物，重结晶得微黄色产物，即化合物1，也就是本发明所述的新型喹啉衍生物。

其中所述化合物2的加入量为1.04-3.12g；5-氯-2-羟基苯胺的加入量为0.58-1.75g；乙醇的用量为20-40mL；催化剂乙酸的滴加量为3-10滴，ZnO的量为5-20mg；反应温度为50-80℃；反应时间为4-8h。

本发明另一目的是将上述合成的荧光探针用于多种情况下Cu²⁺和Cd²⁺金属离子的检测，具体的检测方法为：

(1)用乙醇配制1mM的探针储备液，并储存于-4℃的冰箱中备用；在光谱测量前用乙醇和水(体积比1:9)的混合溶液稀释至所需浓度。10mMCu²⁺和Cd²⁺的储备液用蒸馏水配制成。向探针溶液中加入一定浓度的Cu²⁺和Cd²⁺离子，分别测量在不同pH条件下探针溶液在与Cu²⁺和Cd²⁺离子反应前后的荧光响应。

(2)向探针溶液中加入不同浓度的Cu²⁺和Cd²⁺离子，分别测量溶液的荧光和紫外光谱；

(3)10mM金属离子的储备液都由蒸馏水配制成，这些溶液包括Na⁺,Zn²⁺,Hg²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cu²⁺,Mn²⁺,Al³⁺,Cr³⁺,K⁺,Ca²⁺,Sr²⁺,Cs²⁺,Pb²⁺,Co²⁺,Li⁺,Cd²⁺离子和空白样。向配制好的探针溶液中分别加入一定体积上述的离子储备液，使各离子终浓度为100μM，分别测量其荧光和紫外光谱；

与现有技术相比较，本发明具有如下优点：

(1)本发明中所合成的新型荧光探针分子中含有多个N,O结合位点，本身呈现蓝色荧光，在加入Cu²⁺与其结合之后，本身的蓝色荧光猝灭，进而实现了其对Cu²⁺的荧光猝灭型识别，且随即加入Cd²⁺之后可以明显观察到荧光恢复到绿色，成功实现对Cd²⁺的接力识别，效果显著。

(2)本发明中荧光探针对Cu²⁺和Cd²⁺的识别有很强的抗干扰能力，即使是在一些其他离子的存在下，也能对Cu²⁺和Cd²⁺进行十分有效的识别。

(3)本发明中荧光探针对Cu²⁺和Cd²⁺离子检测的灵敏度很高，测量的检出限低，效果好。本发明中的探针对铜离子的检测限低至2.7×10^-8M，对Cd²⁺的检测限为1.7×10^-8，相较于目前已公开的一些Cu²⁺和Cd²⁺检测探针，它的检测限更低，灵敏度更高。并且最重要的是该探针对Cd²⁺的检测识别，选择性极佳，不被同族元素Zn²⁺所干扰，具备单一选择性，是目前已公开的识别Cd²⁺探针中极为罕见的。

(4)本发明的新型喹啉衍生物荧光探针可以基于一个探针分子根据不同的荧光现象去识别两个不同的金属离子，探针与金属离子反应结合时，唯有Cu²⁺会使探针本身具备的蓝色荧光猝灭，继而用于接力识别时，唯有Cd²⁺可以使荧光恢复至绿色。

(5)本发明中选用喹啉作为荧光检测基团，喹啉衍生物由于其优异的光化学物理性能，宽夹缝，高量子产率，且易配位，是一类被广泛应用的荧光化合物，相较于其他被广泛应用的罗丹明类衍生物，化学毒性更低且一般都具备生物活性，可以作为良好的医药中间体。本发明所设计的制备方法，相较于其他繁琐的合成方法，合成路线更为简单，采用纳米ZnO材料作催化剂，产率更高，成本更低。

附图说明

图1为中间体化合物2的核磁表征氢谱图。

图2为基于喹啉结构的荧光探针的核磁表征氢谱图。

图3为基于喹啉结构的荧光探针的核磁表征碳谱图。

图4为基于喹啉结构的荧光探针的质谱图。

图5为基于喹啉结构的荧光探针(a)，[1+Cu²⁺]+Cd²⁺(b)和1+Cu²⁺(c)在不同pH条件下的荧光强度(λex＝340nm)；其中，1表示本发明制备的基于喹啉结构的荧光探针。

图6为基于喹啉结构的荧光探针对金属离子的选择性测试荧光光谱图；其中，1表示本发明制备的基于喹啉结构的荧光探针。

图7为基于喹啉结构的荧光探针溶液加入金属离子后的紫外光谱图；其中，1表示本发明制备的基于喹啉结构的荧光探针。

图8为基于喹啉结构的荧光探针溶液加入Cu²⁺后的荧光光谱图。

图9为基于喹啉结构的荧光探针溶液的荧光强度随加入的Cu²⁺浓度变化图。

图10为本发明制备的探针对Cu²⁺、Cd²⁺接力检测的结果；其中图a为[1+Cu²⁺]后加入再加入Cd²⁺后的荧光变化光谱图；图b为[1+Cu²⁺]荧光强度随加入的Cd²⁺浓度变化图；其中，1表示本发明制备的基于喹啉结构的荧光探针。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：中间体化合物2的合成

(1)化合物3的合成

将8-羟基-2-甲基喹啉(1.6g，10.05mmol)，溴乙酸乙酯(1.7g，10.18mmol)和无水碳酸钾(5g，36.18mmol)在丙酮(20mL)中的混合物加热回流24小时。冷却后，将混合物过滤，所得滤液蒸发旋干，得到粗残余物。最终产物通过层析提纯(洗脱液，二氯甲烷/乙酸乙酯＝10:1)，得到浅黄色油状产物1.98g，即化合物3。

(2)化合物2的合成

在65℃下，将0.75g SeO 2加入到3(1.5g，6mmol)的1,4-二氧六环溶液(20mL)中，将上述混合物的温度升至80℃。反应2小时后，冷却至室温。滤出沉淀。有机相在真空中浓缩。最终产物通过从乙酸乙酯/己烷(1.167g，75％产率)重结晶获得黄色固体，即化合物2。核磁氢谱图如图1所示：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.14(d,1H),8.55(d,1H),8.01(d,1H),7.70(m,2H),7.25(m,1H),5.13(d,2H),4.26(m,2H),1.22(t,3H).

中间产物化合物3和2的合成方法参照文献(Wang H H,Gan Q,Wang X J,et al.Awater-soluble,small molecular fluorescent sensor with femtomolar sensitivityfor zinc ion[J].Organic Letters,2007,9(24):4995.)

实施例2：基于喹啉结构的荧光探针的合成

向100mL圆底烧瓶中加入0.58g(4mmol)5-氯-2-羟基苯胺和1.04g化合物2(4mmol)，再加入20mL乙醇溶剂溶解，加入3滴醋酸和5毫克ZnO作催化剂后，50℃搅拌反应4小时。反应过程用薄层色谱法TLC监测(展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝1:2)，化合物2反应完即为终点。粗产物用乙醇重结晶，再通过柱层析提纯(洗脱液：石油醚/二氯甲烷＝0.5：1)。最终得到淡黄色固体，即探针1共1.13g，产率为73.8％。

实施例3：基于喹啉结构的荧光探针的合成

向100mL圆底烧瓶中加入1.75g(12mmol)5-氯-2-羟基苯胺和3.12g化合物2(12mmol)，再加入40mL乙醇溶剂溶解，加入10滴醋酸和20毫克ZnO作催化剂后，80℃搅拌反应8小时。反应过程用薄层色谱法TLC监测(展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝1:2)，化合物2反应完即为终点。粗产物用乙醇重结晶，再通过柱层析提纯(洗脱液：石油醚/二氯甲烷＝0.5：1)。最终得到淡黄色固体，即探针1共3.25g，产率为70.8％。

其核磁图如图2和3所示：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.6(dd,1H),8.45(dd,1H),8.05(dd,1H),8.0(dd,1H),7.82–7.56(m,3H),7.23(dd,1H),5.18(s,2H),4.22(q,2H),1.24(t,3H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.15,163.40,154.35,150.01,143.01,139.62,138.10,130.21,129.91,129.30,127.05,121.31,120.81,120.62,113.41,111.31,65.82,61.21,14.51。

质谱如图4所示:C₂₀H₁₅O₄N₂Cl(M＝382.5),MS(M+Na⁺):m/z＝405.23.(M+H⁺):m/z＝383.24。

实施例4：基于喹啉结构的荧光探针的合成

向100mL圆底烧瓶中加入1.16g(8mmol)5-氯-2-羟基苯胺和2.10g化合物2(8.1mmol)，再加入25mL乙醇溶剂溶解，加入5滴醋酸和10毫克ZnO作催化剂后，60℃搅拌反应6小时。反应过程用薄层色谱法TLC监测(展开剂：石油醚/乙酸乙酯＝1:2)，化合物2反应完即为终点。粗产物用乙醇重结晶，再通过柱层析提纯(洗脱液：石油醚/二氯甲烷＝0.5：1)。最终得到淡黄色固体，即探针1共2.55g，产率为83.4％。

实施例5：pH对基于喹啉结构的荧光探针识别金属离子的影响

用乙醇配制1mM的荧光探针储备液，并储存于-4℃的冰箱中备用；在光谱测量前用乙醇和水(体积比1:9)的混合溶液稀释至所需浓度。10mMCu²⁺和Cd²⁺的储备液用蒸馏水配制成。分别向含不同pH(4-10)的荧光探针液的两组试管中加入金属离子，其中一组只加入Cu^{2 +}，另一组中先加入Cu²⁺再加入Cd²⁺，分别测量在不同pH条件下探针溶液在与Cu²⁺和Cd²⁺离子反应前后的荧光响应。如图5所示，本发明制备的荧光探针的荧光信号在4-10的pH范围内几乎保持恒定。同时，荧光探针识别Cu²⁺后与之结合形成的荧光探针(用1表示)+Cu²⁺体系(表示为1+Cu²⁺)的荧光强度随pH值高于8.0(图5红点)略有增加。这可能是由于Cu²⁺的水解反应所致。在不同pH条件下[1+Cu²⁺]+Cd²⁺体系的荧光强度没有明显变化。上述实验结果表明，本发明制备的荧光探针适用于较宽的pH范围内对Cu²⁺和Cd²⁺的识别检测。

实施例6：基于喹啉结构的荧光探针对金属离子的选择性影响

用乙醇配制1mM探针母液并置于-4℃冰箱中备用。用乙醇和水(体积比1:9)混合溶液稀释到终浓度为10μM的溶液，分别向探针中加入10当量的离子Na⁺,Zn²⁺,Hg²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cu²⁺,Mn²⁺,Al³⁺,Cr³⁺,K⁺,Ca²⁺,Sr²⁺,Cs²⁺,Pb²⁺,Co²⁺,Li⁺,Cd²⁺，加入后紫外和荧光光谱的变化分别如图7和图6所示。从图中可知，Cu²⁺和Cd²⁺加入后紫外和荧光光谱都发生了很大的变化；而其他的离子的加入和空白一样，荧光没有什么变化。随即，在各种离子存在下加入了10当量的Cu²⁺，发现荧光也发生了明显的猝灭，继续加入10当量的Cd²⁺，荧光恢复成绿色荧光，。这些结果说明了本探针能够实现对Cu²⁺和Cd²⁺的接力识别检测，在实际检测中即使有很多的其他离子干扰，本探针也能对Cu²⁺和Cd²⁺进行有效的识别。

实施例7：基于喹啉结构的荧光探针加入Cu²⁺和Cd²⁺金属离子后光谱性质的影响

用乙醇配制1mM的探针母液置于-4℃冰箱中备用；在检测前将其用乙醇和水(1:9)稀释到终浓度为10μM的溶液。10mM的Cu²⁺和Cd²⁺的储备液用蒸馏水配制成。

向按照上述方法配制的探针溶液中加入Cu²⁺和Cd²⁺离子，测量加入金属离子前后溶液的紫外光谱。如图7所示，可见光谱在276nm和330nm处显示出两个主要吸收峰。加入Cu²⁺(10当量)后，以276nm和334nm为中心的吸收带明显降低，而在262nm处出现新的吸收峰。另一方面，Cd²⁺发现从276到298nm和330～350nm的弱的红移变化，而在相同的条件下，其它金属离子没有产生任何显著的光谱变化。

向一系列按照上述方法稀释完的探针溶液中加入不同浓度的Cu²⁺离子，使其终浓度为0-100μM，测量溶液的荧光光谱。从图8中发现，在加入Cu²⁺之前，探针呈现蓝色荧光；Cu^{2 +}的加入使得体系荧光强度在490nm发射波长处有一个明显的减弱，且随着离子浓度的增加，荧光猝灭，说明Cu²⁺浓度确实会影响探针溶液的荧光强度。插图可知当Cu²⁺浓度达到探针浓度的1倍时，荧光强度几乎达到最小值不再减弱，这种荧光的变化可以在365nm紫外灯下清楚的看出。此外，从图9中发现在Cu²⁺浓度在0-10μM范围内，体系在490nm发射波长处荧光呈线性减弱，并计算出对Cu²⁺的检出限低至2.7×10^-8M，两者的结合常数为5.643×10⁴M^-1。

此外，本探针与Cu²⁺结合之后还将应用于对Cd²⁺的接力识别，生成的[1+Cu²⁺]直接用于检测Cd²⁺(1代表本发明制备的探针)。如图10(a)所示，随着Cd²⁺逐渐添加到溶液中，荧光强度显著增加并伴随一定程度的红移，当Cd²⁺的浓度为1.0当量时，发射强度达到最大值。当Cd²⁺浓度范围为1μM至10μM时，荧光强度呈线性响应，相应检测限计算为1.7×10^-8M，并且两者的结合常数为1.374×10⁴M^-1(图10(b))。

综上所述，本探针显示出良好的检测性能。该探针对Cu²⁺和Cd²⁺检测效果显著且有很低的检出限，是一个很有潜力的金属离子检测荧光探针。

实施例8：探针的实际应用能力

从长江边搜集长江水，用滤纸过滤掉杂质；采集校园玉带河中的湖水；从实验室搜集自来水直接使用。

分别用三种水样品与乙醇配置成体积比为9:1的混合溶液。用蒸馏水配制浓度为10mMCu²⁺和Cd²⁺标准液。用EtOH配制1mM合成的探针1母液置于-4℃冰箱中备用。分别用三种混合溶液稀释探针溶液到终浓度为10μM，分别测量荧光光谱得到荧光强度值，并根据实施例7中荧光强度和金属离子浓度的线性关系得到自来水、湖水和长江水里Cu²⁺浓度分别为0.052,0.152,0.191μM；Cd²⁺的浓度为0.032,0.055,0.085μM。

再分别向三种水样中加入一定体积的的标准浓度的Cu²⁺和Cd²⁺离子，使其终浓度分别为5μM，8μM。分别测量荧光得到荧光强度值。同样通过荧光强度标准曲线法得到了加标后样品溶液中的Cu²⁺和Cd²⁺浓度，将该值与加入的标准值对比得到加标离子的回收率，如表1所示，表中1代表本发明制备的基于喹啉结构的荧光探针；通过回收率可得该测量方法所得到的结果准确率较高，该探针可用于实际水样品中Cu²⁺和Cd²⁺的识别和浓度检测。

表1.本发明制备的探针检测实际水样中Cu²⁺和Cd²⁺浓度的结果

Claims (10)

1.一种基于喹啉结构的荧光探针，其特征在于，所述探针为接力响应型探针，其分子式为C₂₀H₁₅O₄N₂Cl，结构式如下：

。

2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

将一定量的化合物C₁₄H₁₃O₄N和5-氯-2-羟基苯胺溶于乙醇，添加一定量的乙酸和ZnO后，一定温度下油浴锅中搅拌回流反应；反应结束，冷却至室温，过滤去沉淀杂质，滤液旋蒸得粗产物，重结晶得微黄色产物，即是权利要求1所述的荧光探针；

所述化合物C₁₄H₁₃O₄N的结构式为：

。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物C₁₄H₁₃O₄N与5-氯-2-羟基苯胺的质量比为1.04-3.12 ：0.58-1.75 。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇与化合物C₁₄H₁₃O₄N、5-氯-2-羟基苯胺用量为20-40m L：1.04-3.12g ：0.58-1.75g。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂乙酸的滴加量与化合物C₁₄H₁₃O₄N、5-氯-2-羟基苯胺用量为3-10滴：1.04-3.12g ：0.58-1.75g。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述ZnO与化合物C₁₄H₁₃O₄N、5-氯-2-羟基苯胺的质量比为1-4：208-624 ：116-350。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述回流反应温度为50-80 ℃；反应时间为4-8 h。

8.权利要求1所述荧光探针在Cu²⁺和Cd²⁺金属离子的检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用为在pH在4-10范围的环境中Cu²⁺和Cd²⁺金属离子的检测。

10.根据权利要求8-9任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为单独对Cu²⁺和Cd²⁺的检测或对Cu²⁺和Cd²⁺的接力检测。

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