CN107778347A - 一种利用氨基酸类离子液体从蚕蛹中溶解分离蚕蛹蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物质资源再生利用领域，涉及一种利用氨基酸类离子液体溶解分离蚕蛹蛋白的方法。首先将鲜蛹、干蛹或脱脂干蛹经烘干，粉碎，过筛后得到蚕蛹粉；蚕蛹粉与氨基酸类离子液体混合均匀，加热搅拌充分溶解，离心分离得到蚕蛹蛋白离子液体溶液；向蚕蛹蛋白离子液体溶液中加入反萃剂，振荡后静置，离心得再生蚕蛹蛋白沉淀；用反萃剂洗涤再生蚕蛹蛋白沉淀至无离子液体残留，冷冻干燥后得到再生蚕蛹蛋白。本发明所用离子液体的特征在于其阴阳离子均为自然界中具有生物可降解性的天然产物，相对于常规离子液体具有更好的环境友好性和生物相容性，是一种更加绿色的溶剂。
Description
技术领域
本发明属于生物质资源再生利用领域，涉及一种溶解分离蚕蛹粉制备蚕蛹蛋白的方法，尤其涉及一种利用氨基酸类离子液体溶解分离蚕蛹蛋白的方法。
背景技术
蚕蛹蛋白是一种球状蛋白质，属于天然生物高分子，蚕蛹中的蚕蛹蛋白含量高达50％以上。蚕蛹蛋白富含18种氨基酸，其中8种人体必需氨基酸含量占氨基酸总量的42％以上，是一种优质的动物蛋白。我国蚕茧年产量高达到70亿吨，缫丝后所得蚕蛹资源极其丰富，然而长期以来，蚕蛹大多直接用作饲料甚至作为肥料使用，造成了资源的极大浪费。蚕蛹蛋白具有良好的生物相容性和细胞亲和性，可广泛应用于保健食品、医药化工、农业饲料及纺织等领域。因此，蚕蛹蛋白的开发和利用具有重要的应用价值。蚕蛹蛋白为球蛋白，属酪蛋白类，不溶于水和酸，可溶于稀碱。常见的蚕蛹蛋白制备工艺主要有碱法制备工艺、酶法制备工艺及有机溶剂法制备工艺。这些方法会产生大量的废酸、废碱等，回收利用困难，造成严重的环境污染，且溶解过程蛋白质分子降解严重，利用附加值不高。
作为一种新型绿色溶剂，离子液体具有溶解能力强、极性强、不易挥发、热稳定性好和可设计性等优点，近年来，广大技术人员对利用离子液体溶解高分子聚合物和生物质资源绿色新技术进行了有益探索，例如专利CN102492155A利用咪唑类离子液体溶解废旧尼龙，设备工艺简单，离子液体可回收重复使用，获得的尼龙再生粉末可用于聚合物的成核剂等。专利CN 105384665A应用胆碱牛磺酸盐及胆碱乙酰丙酸盐离子液体对小麦秸秆进行预处理，后进行酶解得到还原糖为主的糖液，该发明有效增强了小麦秸秆的酶解效率，同时还提高了可发酵还原糖的收率。专利CN 106118578A使用含磺酸阴离子基的离子液体溶解和提纯生物质原料中或经工业处理后的木质素，该方法对实验设备要求低，木质素溶解速度快、效率高且离子液体可以重复利用。随着离子液体应用范围的不断拓展，近年来已有科研人员应用离子液体进行蛋白质的溶解分离或样品预处理，例如专利CN 105970346A应用杂双环离子液体溶解动物毛中的角蛋白和助剂制备纺丝液，所得纺丝液可纺性能高，溶解过程易操作、清洁环保。专利CN 106323705A利用咪唑或吡啶类离子液体对生物体细胞、组织及器官等蛋白质组样品进行快速预处理，该方法具有高效、高通量及高回收率的优点。专利CN 105348369A利用咪唑类离子液体为溶剂提取分离蚕蛹蛋白，操作简单无污染，且所得蚕蛹蛋白中脂肪含量低。
从以上可以看出，离子液体俨然成为一种绿色新型溶剂广泛应用于高分子及生物大分子的溶解当中，但现有专利鲜有应用可降解离子液体溶解蛋白质的工艺报道，更未见应用氨基酸类离子液体溶解分离蚕蛹蛋白技术，由于氨基酸类离子液体具备毒性低、可生物降解等优点，因此开发一种利用氨基酸类离子液体溶解分离蚕蛹蛋白的方法对推进蚕蛹蛋白资源利用具有极其重要的战略意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于避免在溶解过程中使用酸和碱，同时克服常规离子液体可生物降解性差的缺点，提供一种从蚕蛹中溶解分离蚕蛹蛋白质的方法，尤其是提供一种利用氨基酸类离子液体从蚕蛹中溶解分离蚕蛹蛋白的方法。为达此目的，本发明采用以下技术方案：
(1)溶解：以鲜蛹、干蛹或脱脂干蛹为原料，氨基酸类离子液体为溶剂。蚕蛹经干燥、粉碎、过筛制得一定粒径大小的蚕蛹粉；氨基酸类离子液体在一定温度下干燥至含水量0.5％以下。所得蚕蛹粉与干燥后的氨基酸类离子液体按照一定比例混合均匀，在一定温度下加热搅拌一定时间，充分溶解后趁热离心取上层清液，即为蚕蛹蛋白离子液体混合溶液。
(2)再生：向步骤(1)所获得的蚕蛹蛋白离子液体混合溶液加入一定量的反萃剂，振荡后静置过夜，生成絮状沉淀。
(3)洗涤干燥：离心分离步骤(2)再生所得沉淀，加反萃剂洗涤至无离子液体残留，后冷冻干燥得到蚕蛹蛋白。
优选地，所述蚕蛹粉粒径为50～200目。
优选地，所述氨基酸类离子液体为胆碱甘氨酸离子液体、胆碱丙氨酸离子液体、胆碱亮氨酸离子液体、胆碱丝氨酸离子液体、胆碱赖氨酸离子液体、胆碱谷氨酸离子液体、胆碱天冬氨酸离子液体、胆碱苯丙氨酸离子液体、胆碱色氨酸离子液体、胆碱异亮氨酸离子液体、胆碱苏氨酸离子液体、胆碱缬氨酸离子液体、胆碱精氨酸离子液体、胆碱组氨酸离子液体、胆碱谷酰氨酸离子液体、胆碱脯氨酸离子液体、胆碱甲硫氨酸离子液体或胆碱天冬酰氨酸离子液体中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述胆碱氨基酸离子液体的名称和离子结构如下表所示：
优选地，溶解反应温度为30～110℃。
优选地，溶解反应时间为2～24小时。
优选地，蚕蛹粉与氨基酸类离子液体质量比为1：10～1：30。
优选地，所述反萃剂为甲醇、乙醇、乙腈、水、丙酮、四氢呋喃、二氧六环、N-N二甲基甲酰胺中的一种或几种以任意比例混合。
优选地，氨基酸类离子液体与反萃剂质量比为1：10～1：40。
优选地，再生后蚕蛹蛋白沉淀的干燥方法为冷冻干燥。
本发明与现有技术相比有如下优点：
(1)制得的蚕蛹蛋白蛋白质含量高于80％，脂肪含量低于0.5％。
(2)工艺简单，易于操作，氨基酸类离子液体的阴阳离子均为可生物降解离子，具有更好的环境友好性和生物相容性，绿色无污染。
(3)与现有离子液体法相比溶解所需温度低，脱脂效果更好。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
称取0.2512g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.43％的胆碱甘氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为62.09％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为84.26％，脂肪含量为0.18％。
实施例2
称取0.2506g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入10g含水量为0.48％的胆碱丙氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为56.79％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为76.45％，脂肪含量为0.21％。
实施例3
称取0.2509g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入2.5g含水量为0.46％的胆碱丝氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为35.67％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为72.95％，脂肪含量为0.33％。
实施例4
称取0.2502g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.49％的胆碱苏氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约25ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为48.21％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为75.81％，脂肪含量为0.26％。
实施例5
称取0.2493g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.47％的胆碱赖氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约75ml乙醇作为作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为46.84％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为76.55％，脂肪含量为0.16％。
实施例6
称取0.2502g粒径为200目的干燥后的脱脂蚕蛹粉，与5g含水量为0.43％的胆碱异亮氨酸离子液体，混合均匀，30℃搅拌溶解24小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml四氢呋喃作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为23.13％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为79.36％，脂肪含量为0.24％。
实施例7
称取0.2501g粒径为50目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.52％的胆碱天冬酰氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml二氧六环作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为59.86％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为81.43％，脂肪含量为0.56％。
实施例8
称取0.2508g粒径为500目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.52％的胆碱甲硫氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50mlN-N二甲基甲酰胺作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为63.28％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为82.47％，脂肪含量为0.36％。
实施例9
称取0.2503g粒径为200目的干燥后的脱脂蚕蛹粉，与5g含水量为0.43％的胆碱脯氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解2小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml水作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为33.03％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为81.24％，脂肪含量为0.47％。
实施例10
称取0.2497g粒径为200目的干燥后的脱脂蚕蛹粉，与5g含水量为0.43％的胆碱谷酰氨酸离子液体，混合均匀，110℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙腈作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为34.68％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为80.29％，脂肪含量为0.42％。
实施例11
称取0.2506g粒径为200目的干燥后的脱脂蚕蛹粉，与5g含水量为0.43％的胆碱缬氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解8小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml甲醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为48.38％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为81.32％，脂肪含量为0.22％。
实施例12
称取0.2499g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.43％的胆碱组氨酸离子液体，混合均匀，110℃搅拌溶解24小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml丙酮+水等体积混合液作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为26.68％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为76.32％，脂肪含量为0.38％。
实施例13
称取0.2501g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.43％的胆碱精氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解2小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为58.93％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为80.26％，脂肪含量为0.43％。
实施例14
称取5.0005g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入100g含水量为0.47％的胆碱甘氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解24小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约1000ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为61.38％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为81.32％，脂肪含量为0.22％。
实施例15
称取2.497g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入50g含水量为0.47％的胆碱甘氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解24小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约1000ml乙醇作为作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为60.82％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为83.91％，脂肪含量为0.43％。
实施例16
称取0.2503g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.47％的胆碱亮氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为42.09％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为78.26％，脂肪含量为0.38％。
实施例17
称取0.2506g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.46％的胆碱谷氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解2小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为43.08％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为78.96％，脂肪含量为0.42％。
实施例18
称取0.2512g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.43％的胆碱天冬氨酸离子液体，混合均匀，110℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为49.09％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为79.26％，脂肪含量为0.48％。
实施例19
称取0.2505g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.43％的胆碱苯丙氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解4小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约100ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为54.12％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为79.46％，脂肪含量为0.36％。
实施例20
称取0.2512g粒径为200目的干燥后的蚕蛹粉，加入5g含水量为0.43％的胆碱色氨酸离子液体，混合均匀，90℃搅拌溶解24小时，停止反应后离心分离取上清液，向上清液中加入约50ml乙醇作为反萃剂，振荡、静置过夜、离心；用反萃剂洗涤离心所得沉淀至无离子液体残留，放置在冷冻干燥机中干燥，得淡黄色固体，即为产品蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白收率为54.09％，所得蚕蛹蛋白的蛋白质含量为79.93％，脂肪含量为0.28％。
Claims (9)
1.一种利用氨基酸类离子液体溶解分离蚕蛹蛋白的方法，其特征在于使用氨基酸类离子液体溶解分离蚕蛹蛋白，工艺流程为：首先将鲜蛹、干蛹或脱脂干蛹经烘干，粉碎，过筛后得到蚕蛹粉；蚕蛹粉与氨基酸类离子液体混合均匀，加热搅拌充分溶解，离心分离得到蚕蛹蛋白离子液体溶液；向蚕蛹蛋白离子液体溶液中加入反萃剂，振荡后静置，离心得再生蚕蛹蛋白沉淀；用反萃剂洗涤再生蚕蛹蛋白沉淀至无离子液体残留，冷冻干燥后得到再生蚕蛹蛋白。
2.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于，所述蚕蛹粉粒径为50～200目。
3.根据权利要求书1所述的制备方法，其特征在于，所述氨基酸类离子液体为胆碱甘氨酸离子液体、胆碱丙氨酸离子液体、胆碱亮氨酸离子液体、胆碱丝氨酸离子液体、胆碱赖氨酸离子液体、胆碱谷氨酸离子液体、胆碱天冬氨酸离子液体、胆碱苯丙氨酸离子液体、胆碱色氨酸离子液体、胆碱异亮氨酸离子液体、胆碱苏氨酸离子液体、胆碱缬氨酸离子液体、胆碱精氨酸离子液体、胆碱组氨酸离子液体、胆碱谷酰氨酸离子液体、胆碱脯氨酸离子液体、胆碱甲硫氨酸离子液体或胆碱天冬酰氨酸离子液体中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，溶解的反应温度为30～110℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，溶解的反应时间为2～24h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，蚕蛹粉与氨基酸类离子液体质量比为1：10～1：30。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反萃剂为甲醇、乙醇、乙腈、水、丙酮、四氢呋喃、二氧六环、N-N二甲基甲酰胺中的一种或几种以任意比例混合。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，氨基酸类离子液体与反萃剂质量比为1：10～1：40。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，再生后蚕蛹蛋白沉淀的干燥方法为冷冻干燥。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180309 |
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