CN107764762A - 一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法 - Google Patents
一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，属于生物应用技术领域。该方法包括人工唾液的配制、采用仿生装置抽吸、仿生上清的制备、染色、蛋白质含量的测定等步骤。本发明的方法操作简单，利用唾液蛋白沉淀会产生收敛感的原理，采用唾液淀粉酶模拟唾液中的蛋白环境，用其沉淀比例来定量表征收敛感的大小。同时采用口腔仿生吸收装置，从而更好的模拟烟气与口腔唾液作用的过程。本方法可用于卷烟烟气对口腔收敛感的定量表征，为卷烟烟气的感官评价提供参考。
Description
技术领域
本发明属于生物应用技术领域，具体涉及一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法。
背景技术
卷烟的感官感受主要取决于烟气中种类繁多的化学成分与口腔之间的相互作用。传统卷烟感官浅析与评价依赖于人工评吸，但人工评吸受到评吸人员自身因素及外部环境的影响，这给卷烟评价结果带来了不确定的因素。新型感官浅析技术例如基于多传感列阵的电子舌技术，可根据电子舌输出的传感器响应值计算出样品味觉的强度，但对于余味、收敛感及生津感等三项指标中，并未得到较为理想的拟合效果。因此如何通过合适的生物化学方法来对卷烟烟气收敛感进行表征对卷烟配方的优化调整起着重要作用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，该方法采用生物化学检测方法，其结果为卷烟烟气的感官评价提供参考依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，包括如下步骤：
步骤（1），配制含1mg/mL唾液淀粉酶的人工唾液，离心，取上清，得到唾液上清；
步骤（2），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用步骤（1）的唾液上清浸润模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待表征样品，平衡后进行抽吸；
步骤（3），抽吸结束后，取出步骤（2）中仿生吸收装置的瓶体中的液体，离心，取上清，得到仿生上清；
步骤（4），分别向步骤（1）得到的唾液上清、步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温放置10min，得到染色唾液上清和染色仿生上清；
其中，向步骤（2）得到的唾液上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为唾液上清体积的19倍；向步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为仿生上清体积的19倍；
步骤（5），用分光光度计分别测定步骤（4）得到的染色唾液上清和染色仿生上清在595nm处的吸光值，根据蛋白标准曲线，计算染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量；
步骤（6），根据步骤（5）得到的染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量，计算唾液淀粉酶沉淀比例；唾液淀粉酶沉淀比例=（染色唾液上清蛋白质含量-染色仿生上清中蛋白质含量）÷染色唾液上清蛋白质含量；该沉淀比例即为待表征样品的收敛感。
进一步，优选的是，步骤（1）所述的离心速度为10000-12000rpm/min，时间为10-15min。
进一步，优选的是，步骤（2）所述的平衡条件为：温度22±1℃，湿度60±2%，时间48h。
进一步，优选的是，步骤（2）所述的抽吸采用全自动转盘式吸烟机。
进一步，优选的是，步骤（2）所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口。
进一步，优选的是，步骤（2）中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的唾液上清的量为5 mL。
进一步，优选的是，步骤（3）所述的离心速度为10000-12000rpm/min，时间为10-15min。
进一步，优选的是，在细胞培养板中向步骤（1）得到的唾液上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液；在细胞培养板中向步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液。
进一步，优选的是，所述的细胞培养板为96孔板。
进一步，优选的是，步骤（4）中，唾液上清和仿生上清均设三个平行样进行染色，蛋白质含量计算时，为三个平行样的均值。
抽吸时，全自动转盘式吸烟机连接在装置的烟气进气管上。
本发明中所述的蛋白标准曲线按照考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的常规方法进行制作即可，无特殊限制。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明的方法操作简单，利用唾液蛋白沉淀会产生收敛感的原理，采用唾液淀粉酶模拟唾液中的蛋白环境，用其沉淀比例来定量表征收敛感的大小。同时采用口腔仿生吸收装置，从而更好的模拟烟气与口腔唾液作用的过程。本方法可用于卷烟烟气对口腔收敛感的定量表征，为卷烟烟气的感官评价提供参考。
附图说明
图1为5种不同牌号卷烟的唾液淀粉酶沉淀比例图；
图2为唾液淀粉酶沉淀比例与收敛感打分相关性分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
考马斯亮蓝G-250溶液按照常规的配制方法：通常为称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
本发明实施例中考马斯亮蓝G-250溶液及制作蛋白标准曲线的蛋白质标准溶液采用的是Bradford 蛋白质定量试剂盒 (PA102)，购自天根生化科技（北京）有限公司，网址为。蛋白标准曲线可根据说明书进行制作，没有特殊限制。
实施例1
一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，包括如下步骤：
步骤（1），配制含1mg/mL唾液淀粉酶的人工唾液，在10000rpm/min的速度下离心10min，取上清，得到唾液上清；
步骤（2），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用步骤（1）的唾液上清浸润模拟人工口腔黏膜内壁；选取10支重量和吸阻一致的烟支作为待表征样品，平衡后采用全自动转盘式吸烟机进行抽吸；所述的平衡条件为：温度21℃，湿度58%，时间48h；所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为34.85mL/口；
步骤（3），抽吸结束后，取出步骤（2）中仿生吸收装置的瓶体中的液体，在10000rpm/min的速度下离心10min，取上清，得到仿生上清；
步骤（4），在96孔细胞培养板中，分别向步骤（1）得到的唾液上清、步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温放置10min，得到染色唾液上清和染色仿生上清；
其中，向步骤（2）得到的唾液上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为唾液上清体积的19倍；向步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为仿生上清体积的19倍；
步骤（5），用分光光度计分别测定步骤（4）得到的染色唾液上清和染色仿生上清在595nm处的吸光值，根据蛋白标准曲线，计算染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量；
步骤（6），根据步骤（5）得到的染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量，计算唾液淀粉酶沉淀比例；唾液淀粉酶沉淀比例=（染色唾液上清蛋白质含量-染色仿生上清中蛋白质含量）÷染色唾液上清蛋白质含量；该沉淀比例即为待表征样品的收敛感。
实施例2
一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，包括如下步骤：
步骤（1），配制含1mg/mL唾液淀粉酶的人工唾液，在12000rpm/min的速度下离心15min，取上清，得到唾液上清；
步骤（2），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用步骤（1）的唾液上清浸润模拟人工口腔黏膜内壁；选取20支重量和吸阻一致的烟支作为待表征样品，平衡后采用全自动转盘式吸烟机进行抽吸；所述的平衡条件为：温度23℃，湿度62%，时间48h；所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35.15mL/口；
步骤（3），抽吸结束后，取出步骤（2）中仿生吸收装置的瓶体中的液体，在12000rpm/min的速度下离心15min，取上清，得到仿生上清；
步骤（4），在96孔细胞培养板中，分别向步骤（1）得到的唾液上清、步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温放置10min，得到染色唾液上清和染色仿生上清；
其中，向步骤（2）得到的唾液上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为唾液上清体积的19倍；向步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为仿生上清体积的19倍；
步骤（5），用分光光度计分别测定步骤（4）得到的染色唾液上清和染色仿生上清在595nm处的吸光值，根据蛋白标准曲线，计算染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量；
步骤（6），根据步骤（5）得到的染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量，计算唾液淀粉酶沉淀比例；唾液淀粉酶沉淀比例=（染色唾液上清蛋白质含量-染色仿生上清中蛋白质含量）÷染色唾液上清蛋白质含量；该沉淀比例即为待表征样品的收敛感。
其中，步骤（2）中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的唾液上清的量为5 mL。步骤（4）中，唾液上清和仿生上清均设三个平行样进行染色，蛋白质含量计算时，为三个平行样的均值。
实施例3
一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，包括如下步骤：
步骤（1），配制含1mg/mL唾液淀粉酶的人工唾液10 mL，在11000rpm/min的速度下离心13min，取上清，得到唾液上清；
步骤（2），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用步骤（1）的唾液上清浸润模拟人工口腔黏膜内壁；选取15支重量和吸阻一致的烟支作为待表征样品，平衡后采用全自动转盘式吸烟机进行抽吸；所述的平衡条件为：温度22℃，湿度60%，时间48h；所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL口；
步骤（3），抽吸结束后，取出步骤（2）中仿生吸收装置的瓶体中的液体，在11000rpm/min的速度下离心14min，取上清，得到仿生上清；
步骤（4），在96孔细胞培养板中，分别向10μL的步骤（1）得到的唾液上清、10μ的L步骤（3）得到的仿生上清中加入190μL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温放置10min，得到染色唾液上清和染色仿生上清；
步骤（5），用分光光度计分别测定步骤（4）得到的染色唾液上清和染色仿生上清在595nm处的吸光值，根据蛋白标准曲线，计算染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量；
步骤（6），根据步骤（5）得到的染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量，计算唾液淀粉酶沉淀比例；唾液淀粉酶沉淀比例=（染色唾液上清蛋白质含量-染色仿生上清中蛋白质含量）÷染色唾液上清蛋白质含量；该沉淀比例即为待表征样品的收敛感。
其中，步骤（2）中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的唾液上清的量为5 mL。步骤（4）中，唾液上清和仿生上清均设三个平行样进行染色，蛋白质含量计算时，为三个平行样的均值。
随机抽取市面上五种牌号卷烟制品，命名为品牌1#-5#，采用实施例3方法与人工感官评吸方法进行表征，将实施例3方法得到的结果与人工感官评吸结果进行比对，对两者进行相关性分析，如表1、图1和图2所示。
表1 5种不同牌号卷烟引起的唾液淀粉酶沉淀比例及收敛感打分
由图1可以看出，5种卷烟均存在一定的收敛感，其中3#样品引起的唾液淀粉酶沉淀量最大，表征其收敛感最高；在人工感官评吸中，收敛感打分按照得分越低则收敛感越强，由表1可以看出，3#样品的收敛感得分最低，表征其收敛感最高。由图2可以看出，采用本方法测出的样品收敛感与人工评吸的收敛感存在显著的相关性，表明本方法可作为感官评吸的有力补充。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），配制含1mg/mL唾液淀粉酶的人工唾液，离心，取上清，得到唾液上清；
步骤（2），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用步骤（1）的唾液上清浸润模拟人工口腔黏膜内壁；选取10-20支重量和吸阻一致的烟支作为待表征样品，平衡后进行抽吸；
步骤（3），抽吸结束后，取出步骤（2）中仿生吸收装置的瓶体中的液体，离心，取上清，得到仿生上清；
步骤（4），分别向步骤（1）得到的唾液上清、步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温放置10min，得到染色唾液上清和染色仿生上清；
其中，向步骤（2）得到的唾液上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为唾液上清体积的19倍；向步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液的体积为仿生上清体积的19倍；
步骤（5），用分光光度计分别测定步骤（4）得到的染色唾液上清和染色仿生上清在595nm处的吸光值，根据蛋白标准曲线，计算染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量；
步骤（6），根据步骤（5）得到的染色唾液上清和染色仿生上清中蛋白质含量，计算唾液淀粉酶沉淀比例；唾液淀粉酶沉淀比例=（染色唾液上清蛋白质含量-染色仿生上清中蛋白质含量）÷染色唾液上清蛋白质含量；该沉淀比例即为待表征样品的收敛感。
2.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，步骤（1）所述的离心速度为10000-12000rpm/min，时间为10-15min。
3.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，步骤（2）所述的平衡条件为：温度22±1℃，湿度60±2%，时间48h。
4.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，步骤（2）所述的抽吸采用全自动转盘式吸烟机。
5.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，步骤（2）所述的抽吸的抽吸频率为1口/min，抽吸持续时间为2s，抽吸容量为35mL±0.15mL/口。
6.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，步骤（2）中，浸润模拟人工口腔黏膜内壁所用的唾液上清的量为5 mL。
7.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，步骤（3）所述的离心速度为10000-12000rpm/min，时间为10-15min。
8.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，在细胞培养板中向步骤（1）得到的唾液上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液；在细胞培养板中向步骤（3）得到的仿生上清中加入考马斯亮蓝G-250溶液。
9.根据权利要求8所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，所述的细胞培养板为96孔板。
10.根据权利要求1所述的表征卷烟烟气对口腔收敛感影响的体外仿生模拟方法，其特征在于，步骤（4）中，唾液上清和仿生上清均设三个平行样进行染色，蛋白质含量计算时，为三个平行样的均值。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180306 |
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