CN107748099A - 一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法 - Google Patents

一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法，包括以下步骤：向空柱管的底端压入出口筛板；出口筛板上填充疏水填料层并压实；疏水填料层上压入隔离筛板；隔离筛板上填充KOH粉末填料层并压实。本发明固相萃取柱为血液样品皂化专用柱。与现有技术相比，本发明的有益效果是能够避免了传统液相皂化中反应时间长、需辅助加热、操作复杂的缺点，将皂化反应与固相萃取技术有机结合，大大缩短了样品的皂化时间，有效而简单的操作增加了样品检测的准确性，提高了检测的灵敏度，提高了检测人员的工作效率。

Description

一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法
技术领域
本发明属于萃取柱制备领域，尤其涉及一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法。
背景技术
皂化作为一种常用的样品预处理技术，可以将目标分析物从脂质样品基质中释放放出来，将甘油酯转化为甘油和脂肪酸盐。皂化反应常被用于测定血液样品中的一些疏水性物质过程中的样品处理，如血液中的生育酚类，多环芳香烃类，脂溶性维生素类，植物甾醇类，类胡萝卜素，矿物油，多氯联苯，胆固醇等。
传统的液-液皂化反应通常反应时间长，需要水浴加热回流或者需要采用特殊仪器进行加热。传统的液-液皂化反应的反应温度一般应保持在室温到混合物的沸点这个范围内，反应时间也从30min到24h不等，或者需要更长的反应时间。所以传统的皂化方法既费时费力，而且材料消耗量大，更难以实现对样品的快速有效分析。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有皂化反应用在样品预处理方面存在的上述问题，提供一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法。
为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法，包括以下步骤：
S1、向空柱管的底端压入出口筛板；
S2、出口筛板上填充疏水填料层并压实；
S3、疏水填料层上压入隔离筛板；
S4、隔离筛板上填充KOH粉末填料层并压实，制得所述自热固相皂化萃取柱，并真空保存备用。
进一步优化的，所述空柱管为一次性塑料注射器管或者商品型固相萃取柱管，且内经为0.3-5cm。
进一步优化的，所述出口筛板和所述隔离筛板为脱脂棉、滤纸、玻璃棉或多孔陶瓷中的一种。
进一步优化的，所述疏水填料层的高度为0.5-3cm，所述疏水填料层的材料为聚苯乙烯类或聚甲基丙烯酸酯类，所述疏水填料层材料的形态为无孔颗粒状或者是多孔颗粒状，其中多孔颗粒状材料的粒径大小为3-100μm，孔径为
进一步优化的，所述KOH粉末填料层的高度为0.5-3cm，采用的KOH粉末为分析纯或优级纯。
本发明自热固相皂化的原理在于：当滴加蒸馏水浸润KOH粉末填料层，固体KOH的溶解热可使柱体温度迅速上升至60～80℃，同时过量的KOH可以提供高浓度的OH-，可以促使皂化反应快速进行(5分钟内完全反应)，同时高浓度的KOH可以快速促使血液中的细胞破裂，快速释放目标分析物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明步骤简单、快捷、安全、有效、花费低、使用溶剂少、无需特殊仪器、省时省力，并可以避免传统皂化中液-液萃取时易发生的乳化现象，因为乳化现象将导致回收率的降低。
(2)本发明摒弃了传统液相皂化在样品前处理过程中费时、费力、费溶剂等缺点，显著降低了皂化时间，且无需额外的加热和固相萃取(SPE)清理步骤，节省大量的时间和手工劳动，并可获得良好的净化效果。该发明可以用于血液样品前处理。
附图说明
图1胆固醇标准曲线(a)，血样1(b)，血样2(c)和血样3(d)的HPLC分离色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明的实施例中使用的仪器和试剂如下：
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；MTN-2800D氮吹仪；ART Miccra D-8匀浆器；MS3基本型旋涡混合器；BT 125D电子天平。试剂：乙腈(色谱纯)，KOH、异丙醇、正己烷(分析纯)；交联聚苯乙烯树脂(PS-DVB)；通过Milli-Q超纯水仪制备的超纯水。
标准物质：从Dr.Ehrenstorfer公司购买的胆固醇。
液相色谱条件为：
色谱柱：Agilent C18，250mm×4.6mm，5μm；流动相:乙腈/异丙醇(60/40，v/v)；柱温35℃；流速1.0mL·min-1；检测波长210nm；进样量10μL。
使用制备的自热固相皂化萃取柱测定血液样品中的胆固醇
(1)自热固相皂化萃取柱的制备，包括如下步骤：
S1、取一空柱管，向空柱管的底端压入出口筛板；
S2、向出口筛板上填充交联聚苯乙烯树脂(PS-DVB)或者聚甲基丙烯酸酯疏水填料层并压实；
S3、交联聚苯乙烯树脂(PS-DVB)或者聚甲基丙烯酸酯疏水填料层上压入隔离筛板；
S4、隔离筛板上再填充KOH粉末填料层并压实，制得所述自热固相皂化萃取柱，并真空保存备用。
自热固相皂化萃取柱真空保存，目的是防止KOH吸潮或与空气中的酸性物质如CO2等发生反应而失去效应。
作为本实施例的一优选方案，空柱管为一次性塑料注射器管或者商品型固相萃取柱管，且内经为0.3-5cm。
作为本实施例的另一优选方案，出口筛板和隔离筛板为脱脂棉、滤纸、玻璃棉或多孔陶瓷中的一种。
作为本实施例的另一优选方案，疏水填料层的高度为0.5-3cm，疏水填料层材料的形态为无孔颗粒状或者是多孔颗粒状，其中多孔颗粒状材料的粒径大小为3-100μm，孔径为
作为本实施例的另一优选方案，KOH粉末填料层高度为0.5-3cm，采用的KOH粉末为分析纯或优级纯。
(2)血液样品的制备
量取添加有抗凝剂的血液样品500μL于试管中，并用高纯水稀释至2mL，待用。
其中的血液样品为取自人体的血液或者取自动物的血液，稀释是为了达到较好的分散效果。
(3)血液样品前处理
用移液枪将上述稀释的血液样品点入自热固相皂化萃取柱的KOH粉末填料层；然后用滴灌向自热固相皂化萃取柱中加入高纯水，使能够将自热固相皂化萃取柱浸润为准，反应4-10min；再用高纯水冲洗自热固相皂化萃取柱，待流出液接近中性后，量取5-20mL的低沸点的有机溶剂，分2-5次洗脱，脱时靠重力自然洗脱，洗脱速度不宜太快，速度为1～4滴/秒即可；收集洗脱液于离心管中，并用N2吹干溶剂，加入合适的溶剂定容至1mL，过0.22μm的聚四氟乙烯滤膜，所得滤液为分析溶液，供高效液相色谱分析。
其中洗脱机为正己烷、乙醚、石油醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、甲苯等的一种或几种。具体根据目标物的性质选择，本实施例的目标物是指胆固醇，但是目标物也可以是非皂化的脂溶性物质，如植物甾醇类、脂溶性维生素、生育酚、多环芳烃、类胡萝卜素、多氯联苯、番茄红素等。
其中“合适的溶剂”是指能够充分溶解目标物的有机溶剂，一般为色谱流动相、正己烷、甲醇、乙腈、异丙醇等，此处的有机溶剂纯度一般为色谱纯或分析纯。
其中的高效液相色谱也可以替换成气相色谱或者液质联用或气质联用仪器。
本发明自热固相皂化的原理在于：当滴加蒸馏水浸润KOH粉末填料层，固体KOH的溶解热可使柱体温度迅速上升至60～80℃，同时过量的KOH可以提供高浓度的OH-，可以促使皂化反应快速进行(5分钟内完全反应)，同时高浓度的KOH可以快速促使血液中的细胞破裂，快速释放目标分析物。
(4)标准工作溶液的制备以及标准工作曲线的测定
准确称取胆固醇标准物质1mg，用无水乙醇定容至10mL容量瓶中，得0.1mg/mL标准储备液，4℃暗处储存待用。
准确移取上述标准储备液，逐级稀释，配制成5μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和500μg/mL的胆固醇标准溶液。将不同浓度的标准工作液进行反相液相色谱法(RPLC)测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线，如表1。
表1胆固醇的标准曲线
保留时间(min) 回归方程 相关系数
胆固醇 8.518 Y＝10.7395X+2.1738 0.9999
(5)血液样品的检测与方法性能评价
A、血液样品的检测
在与测量胆固醇标准曲线的相同条件下将经过前处理的血液样品进行RPLC测定，测得血液样品中胆固醇的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中胆固醇含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中胆固醇残留量。若上机溶液中胆固醇残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液稀释至线性范围之内。
B、方法性能评价
a、加标回收率和重复性：
在不同的血液样品(见表2)中加入一定量的胆固醇标准溶液，涡旋混匀后按上述血液样品前处理步骤进行处理后，进行高效液相色谱测定。将测定浓度与理论添加浓度进行比较，得到样品添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。由表2可以看出，胆固醇的平均回收率为98.8％～100.6％，平均相对标准偏差(RSD)为2.9％～3.7％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。
表2胆固醇的加标回收率和相对标准偏差RSD％
b、检出限：
将不同浓度的胆固醇基质标准工作溶液注入HPLC，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比计算检出限，胆固醇的检出限为2μg/kg。
图1给出了上述3种血液样品按本方法处理后的高效液相色谱图，其中胆固醇目标峰完全与基线分离，且色谱图很“干净”，没有杂峰，表明此自热皂化固相萃取柱用于血液样品的前处理过程是成功的。
综上所述，(1)本发明步骤简单、快捷、安全、有效、花费低、使用溶剂少、无需特殊仪器、省时省力，并能够避免传统皂化中液-液萃取时易发生的乳化现象。
(2)本发明摒弃了传统液相皂化在样品前处理过程中费时、费力、费溶剂等缺点，显著降低了皂化时间，且无需额外的加热和固相萃取(SPE)清理步骤，节省大量的时间和手工劳动，并可获得良好的净化效果。
以上公开的仅为本发明的较佳实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、向空柱管的底端压入出口筛板；
S2、出口筛板上填充疏水填料层并压实；
S3、疏水填料层上压入隔离筛板；
S4、隔离筛板上填充KOH粉末填料层并压实，制得所述自热固相皂化萃取柱，并真空保存备用。
2.如权利要求1所述的一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法，其特征在于，所述空柱管为一次性塑料注射器管或者商品型固相萃取柱管，且内经为0.3-5cm。
3.如权利要求1所述的一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法，其特征在于，所述出口筛板和所述隔离筛板为脱脂棉、滤纸、玻璃棉或多孔陶瓷中的一种。
4.如权利要求1所述的一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法，其特征在于，所述疏水填料层的高度为0.5-3cm，所述疏水填料层的材料为聚苯乙烯类或聚甲基丙烯酸酯类，所述疏水填料层材料的形态为无孔颗粒状或者是多孔颗粒状，其中多孔颗粒状材料的粒径大小为3-100μm，孔径为
5.如权利要求1所述的一种用于血液样品前处理的自热固相皂化萃取柱制备方法，其特征在于，所述KOH粉末填料层的高度为0.5-3cm，采用的KOH粉末为分析纯或优级纯。
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