CN107737339A - 磷酸钙‑生物分子复合材料及其制备方法 - Google Patents

磷酸钙‑生物分子复合材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及磷酸钙‑生物分子复合材料及其制备方法。所述磷酸钙‑生物分子复合材料包括：非晶磷酸钙、以及与所述非晶磷酸钙通过相互作用均匀复合的含磷碱基生物分子和/或含磷碱基生物分子的水解产物。根据本发明，含磷碱基生物分子和/或其水解产物的存在可显著提高非晶磷酸钙在水溶液中的稳定性，并可显著改善非晶磷酸钙的生物活性，适用于药物载体、蛋白吸附、基因转染、骨缺损修复等生物医学领域。

Description

磷酸钙-生物分子复合材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种磷酸钙-生物分子复合材料及其制备方法，具体涉及以含磷碱基生物分子作为磷源，并在碱性磷酸酶的催化条件下制备具有生物活性的磷酸钙-生物分子复合材料，属于生物材料制备领域。
背景技术
磷酸钙是脊椎动物体内的主要无机组分，大量存在于人体骨骼和牙齿中，被认为是一类具有良好生物相容性及可降解性的理想生物材料。因此，磷酸钙类生物材料已经广泛的用于骨替代材料、牙齿填充材料，药物输运载体以及基因转染等生物医学研究和应用领域。磷酸钙类生物材料根据其化学组成的不同，可以分为羟基磷灰石、磷酸氢钙、磷酸三钙、磷酸八钙、非晶磷酸钙等多种结晶相和非晶相的磷酸钙。其中，具有良好热稳定性和化学稳定性的羟基磷灰石是其中应用最为广泛的一类。与结晶态的磷酸钙材料相比，非晶磷酸钙具有更好的生物活性和生物降解性。但是，非晶磷酸钙作为一种介稳相材料，其在水溶液中很不稳定，易通过溶解、成核和结晶等过程转变为相应的结晶磷酸钙。
为了制备具有良好稳定性的非晶磷酸钙材料，国内外的学者们已经发展出种类繁多的制备方法。例如，研究者在非晶磷酸钙的制备过程中加入化学调控剂可以有效提高非晶磷酸钙材料的稳定性，包括树枝状高分子、聚丙烯酸、聚乳酸-聚乙二醇以及磷酸酯等有机物。这些有机分子可以通过与非晶磷酸钙的相互作用，抑制其结晶和晶体生长。但是，当前使用的调控剂多为非人体内天然存在的物质，大量的调控剂的加入容易造成材料的制造成本增加、环境污染及影响材料的生物安全性。生物体内含有大量的含磷生物分子，如各种磷酸化碱基生物分子、磷酸肌酸、磷酸果糖等。这些生物分子具有极好的生物相容性和生物活性，而且与磷酸钙之间可发生相互作用，可用于调控磷酸钙材料的结构和功能。
虽然目前磷酸钙和改性磷酸钙的合成方法很多，但在温和条件下，利用生物体内的天然存在的有机含磷生物分子作为磷源，通过仿生的酶催化方法制备具有良好生物活性的磷酸钙-生物分子复合材料仍未见报道。
发明内容
面对磷酸钙材料存在的问题，本发明的目的是提供一种磷酸钙-生物分子复合材料以及在温和条件下以酶催化策略制备磷酸钙-生物分子复合材料的方法。
一方面，本发明提供一种磷酸钙-生物分子复合材料，其包括：非晶磷酸钙、以及通过相互作用与所述非晶磷酸钙复合的含磷碱基生物分子和/或含磷碱基生物分子的水解产物。
根据本发明，含磷碱基生物分子和/或其水解产物的存在可显著提高非晶磷酸钙在水溶液中的稳定性，并可显著改善非晶磷酸钙的生物活性，适用于药物载体、蛋白吸附、基因转染、骨缺损修复等生物医学领域。
所述非晶磷酸钙可为纳米团簇。优选地，所述磷酸钙-生物分子复合材料可为类球状颗粒。所述磷酸钙-生物分子复合材料的颗粒粒径可为20～100nm。
较佳地，所述含磷碱基生物分子选自单磷酸化、二磷酸化或三磷酸化的腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、胸腺苷中的至少一种。
较佳地，所述含磷碱基生物分子的水解产物是含磷碱基生物分子水解失去部分或全部磷酸根的产物。
另一方面，本发明提供上述磷酸钙-生物分子复合材料的制备方法，以水溶性钙盐为钙源、含磷碱基生物分子为磷源，通过碱性磷酸酶催化含磷生物分子水解产生的磷酸根子与钙离子间的化学反应，得到所述磷酸钙-生物分子复合材料。
本发明以碱性磷酸酶为催化剂、含磷碱基生物分子为磷源，一方面含磷碱基生物分子在碱性磷酸酶催化下水解产生磷酸根离子，并与溶液中的钙离子原位反应形成磷酸钙；另一方面，含磷碱基生物分子及/或其水解产物可以通过与磷酸钙的相互作用吸附于产物的内部或表面，形成磷酸钙-生物分子复合材料。含磷碱基生物分子及/或其水解产物的存在显著提高了材料的稳定性和生物活性。本发明对扩展磷酸钙及其复合物材料的制备方法，提高其稳定性和生物活性，促进其生物医学领域的应用具有重要的科学意义。
较佳地，所述制备方法包括以下步骤：
配制含有水溶性钙盐、含磷碱基生物分子和碱性磷酸酶的水溶液，所述水溶液的pH值为7.0～12，优选为7.5～9.0；
将所述水溶液在20～40℃搅拌一段时间，得到所述磷酸钙-生物分子复合材料。
较佳地，所述水溶液中，水溶性钙盐和含磷碱基生物分子的摩尔比为1:100～10:1，优选为1:5～5:1。
较佳地，所述水溶性钙盐的摩尔浓度为0.1～15毫摩尔/升，优选为1～10毫摩尔/升。
较佳地，所述水溶液中，所述碱性磷酸酶的浓度为0.01～50U/L，优选为0.1～1U/L。
较佳地，所述水溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙、乙酸钙中的至少一种。
较佳地，搅拌时间为15分钟～6小时。
本发明提供的磷酸钙-生物分子复合材料的生物活性高，适用于药物载体、蛋白吸附、基因转染、骨缺损修复等生物医学领域。
又，本发明的制备工艺简单，操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。本发明的磷酸钙-生物分子复合材料作为生物医用材料在药物输运、基因转染、骨缺损修复等领域将具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中所得样品的扫描电子显微照片；
图2为实施例1中所得样品的X射线衍射图(0h)及其浸泡在磷酸盐缓冲溶液中不同时间后样品的X射线衍射图(69h、97h、130h)；
图3为实施例1中所得样品的红光光谱图；
图4为实施例1中所得样品促进细胞增殖实验结果；
图5为实施例1中所得样品促进骨髓间充质干细胞成骨分化结果，其中HA为纳米羟基磷灰石对照样，EACP为实施例1中所得样品；
图6为实施例2中所得样品的扫描电子显微照片；
图7为实施例3中所得样品的透射电子显微照片；
图8为实施例4中所得样品的透射电子显微照片；
图9为实施例5中所得样品的透射电子显微照片；
图10为实施例6中所得样品的透射电子显微照片；
图11为实施例7中所得样品的透射电子显微照片。
具体实施方式
以下结合附图及下述具体实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明人经过研究认识到，以含磷碱基生物分子为磷源，在碱性磷酸酶的催化作用下可水解产生磷酸根离子，这些水解产生的磷酸根离子与溶液中的钙离子发生化学反应生成磷酸钙，而磷酸化的生物分子及其水解产物可通过与磷酸钙的相互作用，在磷酸钙表面或内部存在，形成磷酸钙-生物分子复合材料。磷酸化生物分子及其水解产物的存在可显著提高非晶磷酸钙在水溶液中的稳定性，并可显著改善材料的生物活性。
本发明一实施方式中，以水溶性钙盐为钙源、含磷碱基生物分子为磷源、碱性磷酸酶为催化剂，在碱性磷酸酶的催化作用下含磷碱基生物分子水解产生的磷酸根离子与钙离子发生化学反应，形成磷酸钙-生物分子复合材料。
可采用常用的水溶性钙盐或其水合物，例如氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物、乙酸钙和/或其水合物等，应理解可采用一种水溶性钙盐，也可采用两种以上的水溶性钙盐。
可采用的含磷碱基生物分子包括但不限于单磷酸化、二磷酸化和/或三磷酸化的腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷和/或胸腺苷，或以上含磷碱基生物分子的盐或其水合物。例如，包括磷酸腺苷或磷酸腺苷盐、磷酸鸟苷或磷酸鸟苷盐、磷酸尿苷或磷酸尿苷盐、磷酸胸腺苷或磷酸胸腺苷盐、和/或磷酸胞苷或磷酸胞苷盐。具体可举出：三磷酸腺苷钠盐和/或其水合物、三磷酸鸟苷钠盐和/或其水合物、三磷酸尿苷钠盐和/或其水合物、三磷酸胞苷钠盐和/或其水合物、三磷酸胸腺苷钠盐和/或其水合物、二磷酸腺苷钠盐和/或其水合物、二磷酸鸟苷钠盐和/或其水合物、二磷酸尿苷钠盐和/或其水合物、二磷酸胞苷钠盐和/或其水合物、二磷酸胸腺苷钠盐和/或其水合物、一磷酸腺苷钠盐和/或其水合物、一磷酸鸟苷钠盐和/或其水合物、一磷酸尿苷钠盐和/或其水合物、一磷酸胞苷钠盐和/或其水合物、一磷酸胸腺苷钠盐和/或其水合物等。这些分子为生物体内天然存在的有机含磷生物分子，具有极好的生物相容性和生物活性。
本发明一实施方式中，采用水溶性钙盐为钙源、水溶性含磷碱基生物分子为磷源，以碱性磷酸酶为催化剂，以水为溶剂，通过搅拌制得磷酸钙-生物分子复合材料。
一个示例中，配制含有水溶性钙盐、水溶性含磷碱基生物分子和碱性磷酸酶的水溶液。
水溶性钙盐和含磷碱基生物分子的摩尔比可为1:100～10:1。较佳地，水溶性钙盐和含磷碱基生物分子的摩尔比为1:5～5:1。
所述水溶液中，水溶性钙盐的摩尔浓度可为0.1～15毫摩尔/升。较佳地，水溶性钙盐的摩尔浓度为1～10毫摩尔/升。
所述水溶液中，碱性磷酸酶的浓度可为0.01～50U/L，优选为0.1～1U/L。
所述水溶液可为碱性，例如pH值为7.0～12，优选pH值为7.5～9.0。
将所述水溶液搅拌以进行酶催化反应。反应温度可为室温，例如20～40℃，优选为35～38℃，在该温度下，碱性磷酸酶具有较高的催化活性。搅拌时间不受限制，优选为15min～6h。本发明中，通过仿生的酶催化方法制备磷酸钙-生物分子复合材料，反应条件温和。因此，可以保留生物分子的活性。
可对酶催化反应生成的产物进行分离和清洗处理，得到磷酸钙-生物分子复合材料。分离的方法可包括离心分离、过滤或静置沉淀分离等。清洗可采用水洗和/或乙醇洗。
所得的磷酸钙-生物分子复合材料的化学组成包括非晶磷酸钙、以及与非晶磷酸钙均匀复合的含磷碱基生物分子和/或含磷碱基生物分子的水解产物。其中，所述含磷碱基生物分子和/或含磷碱基生物分子的水解产物中所含磷酸根与非晶磷酸钙中所含钙离子之间存在相互作用。优选地，所述磷酸钙-生物分子复合材料由非晶磷酸钙、含磷碱基生物分子和/或含磷碱基生物分子的水解产物通过相互作用均匀复合而成。
其中，含磷碱基生物分子如上所述可以是磷酸化(单磷酸化、二磷酸化或三磷酸化)的腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、胸腺苷中的至少一种。含磷碱基生物分子的水解产物可以是含磷碱基生物分子水解失去部分或全部磷酸根的产物。
所述磷酸钙-生物分子复合材料可呈类球状颗粒。颗粒尺寸均匀，直径约为20～100nm。
本发明的磷酸钙-生物分子复合材料具有优良的稳定性，可以保持非晶磷酸钙组分在较长时间内不结晶。而且，该磷酸钙-生物分子复合材料有高生物相容性和生物活性，且可促进细胞的增殖，而且具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的功能，可用于药物输运、基因转染、骨缺损修复等生物医学领域。
本发明的制备工艺简单，操作方便，条件温和，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。通过本发明所述制备方法制备的磷酸钙-生物分子复合材料作为生物医用材料在药物输运、基因转染、硬组织修复等领域将具有良好的应用前景。
下面进一步举例实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。例如，下述实施例以CaCl2和多种含磷碱基类生物分子作为起始原料，碱性磷酸酶为催化剂，但如上述，也可采用其他合适的水溶性钙盐、水溶性磷酸化碱基生物分子代替。下述示例具体的反应温度、时间、投料量等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
在37℃水浴中，依次将110mg三磷酸腺苷二钠盐、66mg CaCl2溶于60mL去离子水中，加入0.031U碱性磷酸酶，整个反应过程中反应体系的pH值保持在8.0～8.5间，磁力搅拌下反应2.5h。将产物水洗、乙醇洗各3次，干燥，得到磷酸钙-生物分子复合材料。该磷酸钙-生物分子复合材料的表征如图1所示，表明材料为类球状的颗粒，直径约为20～100nm；图2给出了该样品的XRD谱，表明该复合材料中的磷酸钙组分为非晶物相；图3给出了该复合材料的红外光谱，表明该复合材料中含有相对应的生物分子组分。图2同时给出了本实施例制备的样品在磷酸盐缓冲溶液中浸泡不同时间后样品的X射线衍射图，结果表明该复合材料具有优良的稳定性，可以保持产物中非晶磷酸钙组分在较长时间内不结晶。图4是使用CCK-8细胞增殖检测试剂盒法，测试得到的骨髓间充质干细胞与不同浓度的磷酸钙-生物分子复合材料共培养的细胞增殖曲线，结果表明该实施例制备得到的磷酸钙-生物分子复合材料生物相容性好，且可促进细胞的增殖。图5是蛋白质印迹法测试骨髓间充质干细胞成骨分化相关标志基因表达的情况，研究结果显示与常见的磷酸钙类生物材料—羟基磷灰石(HA)纳米材料相比较，骨髓间充质干细胞与磷酸钙-生物分子复合材料(EACP)共培养7天(见图中D7)和14天(见图中D14)时，表现出更显著的促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关标志基因(OCN、OPN、Osterix、Runx2、I-型胶原)表达的功能。
实施例2
在37℃水浴中，依次将55mg三磷酸腺苷二钠盐、33mg CaCl2溶于60mL去离子水中，加入0.031U碱性磷酸酶，整个反应过程中反应体系的pH值保持在8.0～8.5之间，在磁力搅拌下反应2.5h。将产物乙醇洗、水洗各3次，冷冻干燥，得到磷酸钙-生物分子复合材料，如附图6所示，其粒径为20～100nm，选区电子衍射结果表明该复合材料中磷酸钙为非晶物相。
实施例3
在37℃水浴中，依次将105mg三磷酸胞苷二钠盐、66mg CaCl2溶于60mL去离子水中，之后加入0.031U碱性磷酸酶，整个反应过程中反应体系的pH值保持在8.0～8.5间，在磁力搅拌下反应2.5h。将产物乙醇洗、水洗各3次，冷冻干燥，得到如图7所示的磷酸钙-生物分子复合材料，其粒径为20～100nm，选区电子衍射结果表明该复合材料中磷酸钙为非晶物相。
实施例4
在37℃水浴中，依次将117.8mg三磷酸鸟苷二钠盐、66mg CaCl2溶于60mL去离子水中，之后加入0.031U碱性磷酸酶，整个反应过程中反应体系的pH值保持在8.0～8.5间，在磁力搅拌下反应2.5h。将产物乙醇洗、水洗各3次，冷冻干燥，得到如附图8所示的磷酸钙-生物分子复合材料，其粒径为20～100nm。
实施例5
在37℃水浴中，依次将110mg三磷酸尿苷三钠盐、66mg CaCl2溶于60mL去离子水中，之后加入0.031U碱性磷酸酶，整个反应过程中反应体系的pH值保持在8.0～8.5间，在磁力搅拌下反应2.5h。将产物乙醇洗、水洗各3次，冷冻干燥，得到如附图9所示的磷酸钙-生物分子复合材料，其粒径为20～100nm。
实施例6
在37℃水浴中，依次将309mg单磷酸鸟苷二钠盐、66mg CaCl2溶于60mL去离子水中，之后加入0.031U碱性磷酸酶，整个反应过程中反应体系的pH值保持在8.0～8.5间，在磁力搅拌下反应2.5h。将产物乙醇洗、水洗各3次，冷冻干燥，得到如附图10所示的磷酸钙-生物分子复合材料，其粒径为20～100nm，选区电子衍射结果表明该复合材料中磷酸钙为非晶物相。
实施例7
在37℃水浴中，依次将221mg的单磷酸尿苷二钠盐、66mg CaCl2溶于60mL去离子水中，之后加入0.031U碱性磷酸酶，整个反应过程中反应体系的pH值保持在8.0～8.5间，在磁力搅拌下反应2.5h。将产物乙醇洗、水洗各3次，冷冻干燥，得到如附图11所示的磷酸钙-生物分子复合材料，其粒径为20～100nm，选区电子衍射结果表明该复合材料中磷酸钙为非晶物相。
产业应用性：本发明的制备工艺简单，操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。通过本发明所述制备方法制备的具有高生物活性的磷酸钙-生物分子复合材料作为生物医用材料在药物输运、基因转染、硬组织修复等领域具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种磷酸钙-生物分子复合材料，其特征在于，包括：非晶磷酸钙、以及与所述非晶磷酸钙通过相互作用均匀复合的含磷碱基生物分子和/或含磷碱基生物分子的水解产物。
2.根据权利要求1所述的磷酸钙-生物分子复合材料，其特征在于，所述磷酸钙-生物分子复合材料为类球状颗粒，粒径为20～100nm。
3.根据权利要求1或2所述的磷酸钙-生物分子复合材料，其特征在于，所述含磷碱基生物分子选自单磷酸化、二磷酸化或三磷酸化的腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、胸腺苷中的至少一种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的磷酸钙-生物分子复合材料，其特征在于，所述含磷碱基生物分子的水解产物是含磷碱基生物分子水解失去部分或全部磷酸根的产物。
5.一种权利要求1至4中任一项所述的磷酸钙-生物分子复合材料的制备方法，其特征在于，以水溶性钙盐为钙源、含磷碱基生物分子为磷源和稳定剂，通过碱性磷酸酶催化含磷生物分子水解产生的磷酸根子与钙离子间的化学反应，得到所述磷酸钙-生物分子复合材料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制含有水溶性钙盐、含磷碱基生物分子和碱性磷酸酶的水溶液，所述水溶液的pH值为7.0～12，优选为7.5～9.0；
将所述水溶液在20～40℃搅拌一段时间，得到所述磷酸钙-生物分子复合材料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述水溶液中，水溶性钙盐和含磷碱基生物分子的摩尔比为1:100～10:1，优选为1:5～5:1；所述水溶性钙盐的摩尔浓度为0.1～15毫摩尔/升，优选为1～10毫摩尔/升。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述水溶液中，所述碱性磷酸酶的浓度为0.01～50 U/L，优选为0.1～1 U/L。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性钙盐选自氯化钙、硝酸钙、乙酸钙中的至少一种。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的制备方法，其特征在于，搅拌时间为15分钟～6小时。
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