CN107727772A - 利用电喷雾质子化裂解‑质谱多反应检测模式对中药中三萜皂苷进行定性和定量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用电喷雾质子化裂解‑质谱多反应检测模式对中药中三萜皂苷进行定性和定量的方法。三萜皂苷在含有甲酸或甲酸氨的流动相中形成稳定的[M+H]⁺和/或[M+NH₄]⁺分子离子峰，本发明运用液相色谱‑串联四级杆质谱联用仪，采用电喷雾阳离子串联质谱检测模式，通过单因素和响应面法，在线快速优化去簇电压、碰撞能和碰撞室射出电压等质谱参数，使之形成高强度三萜皂苷质子化裂解MRM靶向离子对，其Q₁和Q₃计算公式分别为：Q₁＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺，Q₃＝[苷元+H‑nH₂O]⁺，通过此系列特征性MRM靶向离子对，达到对中药中三萜皂苷快速定性和定量检测的目的。本发明的提出对定性和定量检测中药中三萜皂苷提供了有效的技术手段，已成功应用类叶牡丹和辽东楤木三萜皂苷的含量测定。

Description

利用电喷雾质子化裂解-质谱多反应检测模式对中药中三萜 皂苷进行定性和定量的方法

技术领域

本发明涉及一种中药中三萜皂苷的定量方法，特别涉及一种基于电喷雾质子化裂解-质谱多反应检测模式对中药中三萜皂苷进行定性和定量的方法。本发明属于化学分析及检测技术领域。

背景技术

三萜皂苷作为中药中主要有效部位或有效部位群，已经被研究者广泛接受。然而，三萜皂苷分子缺少发色团、紫外为末端吸收、不具挥发性的特点，因此目前缺少行之有效的三萜皂苷定量方法。现阶段中药三萜皂苷的定量方法，主要采用高效液相色谱-紫外光谱法、高效液相色谱-蒸发光检测法和高效液相色谱-电喷雾-串联质谱法等。

虽然液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-MS/MS-MRM)已用于中药三萜皂苷的定量研究，但主要选择[M+Na]⁺和[M-H]^-做为母离子，且优化方式主要采用注射泵优化去簇电压(DP)、碰撞能(CE)和碰撞室射出电压(CXP)等主要质谱参数，获得相应参数最优值。虽然采用电喷雾串联质谱法通过MRM模式，碎裂[M+Na]⁺和[M-H]^-母离子对中药中常量三萜皂苷能达到满意定量结果，然而该方法在检测部分中药皂苷时检测灵敏度较低，而且定量困难。

发明内容

本发明的目的在于运用液相色谱-串联四级杆质谱技术，采用电喷雾阳离子串联质谱检测模式(ESI⁺-MS/MS)，建立一种利用电喷雾质子化裂解-质谱多反应检测模式对中药中三萜皂苷进行定性和定量的方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

一种利用电喷雾质子化裂解-质谱多反应监测(MRM)模式对中药中三萜皂苷进行定性和定量的方法，包括以下步骤：三萜皂苷在含有甲酸或甲酸氨的流动相中形成稳定的[M+H]⁺和/或[M+NH₄]⁺分子离子峰，运用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，采用电喷雾阳离子串联质谱检测模式(ESI⁺-MRM)，通过单因素实验法和响应面法，快速在线优化包括去簇电压(DP)以及碰撞能(CE)在内的质谱参数，使之形成高强度的中药三萜皂苷MRM靶向离子对，通过此系列特征性的MRM靶向离子对，达到对中药中三萜皂苷快速定性和定量分析的目的。

中药三萜皂苷[M+NH₄]⁺分子离子峰，易于中性损失NH₃基团(17Da)，转化成 [M+H]⁺分子离子峰。[M+H]⁺离子易于发生裂解，形成系列特征性的MRM靶向离子对，其中包括系列高强度的[苷元+H-nH₂O]⁺(n＝0,1,2,....)碎片离子峰。出现多少苷元脱水碎片离子峰与三萜皂苷的分子量、含糖基的种类、含糖基的数量、糖基的连接方式和含糖链的数量等因素关系不大，但与苷元所含羟基基团的数量明显有关。

在本发明所述的方法中，优选的，根据质子化裂解靶向离子对Q₁/Q₃的计算公式，即Q₁＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺)和Q₃＝[苷元+H-H₂O]⁺或[苷元+H-2H₂O]⁺)或[苷元 +H-nH₂O]⁺，其中n为大于或等于0的整数，分别预测得出中药三萜皂苷MRM系列特征性的靶向离子对。

DP、CE和CXP是影响中药皂苷质子化裂解MRM离子对产生的重要因素，尤其是DP和CE值。因此，在本发明所述的方法中，优选的，还包括对碰撞室射出电压(CXP)质谱参数的优化。可通过单因素实验法和响应面法优化DP、CE和CXP 等质谱参数，预测得出产生最大MRM靶向离子对响应值所需最优的DP、CE和CXP 等质谱参数值。

在本发明所述的方法中，在单因素实验的基础上，若考虑去簇电压(DP)以及碰撞能(CE)两个因素影响，优选使用Central-Composite design方法；若考虑去簇电压 (DP)、碰撞能(CE)以及碰撞室射出电压(CXP)三个因素影响，优选使用Box-Behnken design方法。

在本发明所述的方法中，优选的，所述的方法按照以下步骤进行：

(1)建立MRM靶向离子

采用质谱MRM检测模式，以皂苷标准品为模板化合物，通过响应面优化质子 /氨化离子裂解MRM靶向离子对，根据质子化裂解靶向MRM离子对Q₁/Q₃的计算公式，Q₁＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺)和Q₃＝[苷元+H-H₂O]⁺或[苷元+H-2H₂O]⁺)或[苷元 +H-nH₂O]⁺，其中n为大于等于0的整数，提前预测得出中药三萜皂苷标准品的靶向离子对；

(2)基于响应面法优化DP、CE和CXP等质谱参数

用Central-Composite design方法优化两因素的DP和CE值，用Box–Behnkendesign方法优化三因素的DP、CE和CXP值；

(3)标准品溶液的配制

精密称取皂苷标准品，精密称定，加甲醇配制成把标准品储备液稀释成不同浓度的标准品溶液；于4℃保存备用；

(4)运用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪对标准品溶液以及样品溶液进行检测；

(5)标准曲线的建立

以不同浓度的皂苷标准品的峰面积为纵坐标，以皂苷标准品的浓度为横坐标进行线性回归分析，建立标准曲线；

(6)样品溶液中皂苷的含量的计算

样品溶液按照步骤(4)的方法进行测定，根据步骤(5)建立的标准曲线计算出样品溶液中皂苷的含量。

在本发明所述的方法中，优选的，所述的样品为类叶牡丹或辽东楤木。

优选的，当所述的样品为类叶牡丹时，其色谱检测条件以及质谱检测条件如下：

色谱检测条件：色谱柱：HSS T3(150mm×2.1mm,1.8μm)；保护柱：HSS T3 (2.1mm×5mm,1.8μm)；柱温35℃；样品室4℃；流速0.3mL/min；进样量2.0μL；样品池10℃；流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为含0.1v/v％甲酸的乙腈溶液，洗脱梯度为：0-2min 30％–31％B；2-4.1min 31％–31％B；4.1-4.2min 31％–35％ B；4.2-12min 35％–60％B；12-15min 60％–65％B；

质谱检测条件：正离子模式下工作，扫描方式为多反应检测模式(MRM)；喷射电压：5500V；离子源温度：400℃；雾化器：50psi；加热器：50psi；氮气用于碰撞器和辅助气体；打开接口加热器。

优选的，当所述的样品为辽东楤木时，其色谱检测条件以及质谱检测条件如下：

色谱检测条件：色谱柱：HSS T3(150mm e optimization；保护柱：HSS T3(2.1 mme optimization；色谱条件：柱温35℃；样品室4℃；流速0.3mL/min；进样量5.0μL；样品池温度10℃；流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v％甲酸乙腈液，洗脱梯度为0-1.5min 10％-35％B；1.5-7min 35％-35％B；7-7.5min 35％-50％B；7.5-11min 50％-90％B；11-11.5min 90％-10％B；11.51-15min 10％-10％ B。

质谱检测条件：正离子模式下工作，扫描方式为多反映检测模式(MRM)；喷射电压：5500V；离子源温度：250℃；雾化器：50psi；加热器：50psi；氮气用于碰撞器和辅助气体；打开接口加热器。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明公开一种基于电喷雾质子化裂解-质谱多反应监测的中药三萜皂苷定性、定量方法。该方法运用液相色谱-串联四级杆质谱技术，采用电喷雾阳离子串联质谱检测模式(ESI⁺-MRM)，利用中药三萜皂苷易于质子化裂解能够形成系列特征性的 MRM离子对(Q₁＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺)和Q₃＝[苷元+H-H₂O]⁺或[苷元+H-2H₂O]⁺)或 [苷元+H-nH₂O]⁺，其中n为大于等于0的整数)的特点，进行同时定性、定量分析中药中三萜皂苷，其峰型、检测限和定量限，明显优于文献报道的方法。

附图说明

图1为类叶牡丹中三萜皂苷定量时所采用的9种皂苷标准品；

图2为类叶牡丹9种皂苷标准品(A)和类叶牡丹样品测定色谱图(B)；

图3为辽东楤木中三萜皂苷定量时所采用的10种皂苷标准品；

图4为辽东楤木10种皂苷标准品(A)和辽东楤木样品测定色谱图(B)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的说明验证，所有实施例仅用于例证本发明，不限制本发明的保护范围。本领域技术人员知晓对于本发明权利要求内所做的更改或等效变更，均落入本发明的保护范围之内。

实施例1类叶牡丹三萜皂苷定量方法的建立

1实验仪器

Qtrap-4000三重四级杆线性离子阱质谱仪(AB SCIEX公司，美国)；H-class 超高效液相色谱仪(在线脱气机，自动进样器，四元泵，美国Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×150mm,1.8μm)，连接一个Waters HSS T3保护柱 (2.1×5mm,1.8μm)。Milli-Q纯水器(密理博中国有限公司)，ML104/02型电子分析天平(梅特勒托利多仪器上海有限公司)Vortex 3000型涡旋震荡仪(Wiggens公司，德国)；Mikro 200R型离心机(Hettich公司，德国)，KQ-500DB型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2标准品的配制

精密称取1-9种皂苷标准品(图1所示)适量，精密称定，加甲醇配制成质量浓度分别为1.0、1.1、1.2、1.2、1.0、1.0、1.1、1.1、0.4mg/ml的混合对照品溶液作为储备液，于4℃保存备用。

3实验方法与结果

3.1基于响应面中心组成设计优化DP和CE质谱参数

采用质谱多反应监测(MRM)模式，以皂苷1-9为模板化合物，根据质子化裂解靶向离子对Q₁/Q₃的计算公式，即Q₁＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺和Q₃＝[苷元+H-H₂O]⁺或 [苷元+H-2H₂O]⁺)或[苷元+H-nH₂O]⁺，得出皂苷1-9的定量离子对分别为 1253.6→471.3、1091.6→471.3、1237.6→455.4、1237.6→455.4、1254.6→455.4、 1075.6→455.4、621.4→471.3、784.5→455.4和767.5→455.4(表3)。通过响应面的优化而得到可以同时满足九种皂苷最优响应值。

根据单因素实验结果综合考虑，选择DP值实验范围为50-70V，CE值实验范围为30-50eV。在优化试验设计中选择DP(X₁)、CE(X₂)为自变量，考察指标为色谱峰响应值(Y代表某个皂苷成分的峰响应值)。根据Central-Composite design实验原理，共设计13个试验点，其中8个是析因点；中心试验重复5次，用以估计试验误差。表1为九种皂苷[M+H/NH₄]⁺裂解响应面法实验设计与实验结果，进而通过 Design-Expert软件对回归方程计算，预测得出每个化合物相应的DP和CE值(表 2)。

表1：基于Central-Composite design实验设计的1-9种皂苷标准品13次实验的检测结果

表2：9种单体皂苷质子化MRM离子对和优化得出的DP和CE值

3.2色谱条件

Waters超高效液相；色谱柱：HSS T3(150mm e optimization of；保护柱：HSS T3(2.1mm e optimization；色谱条件：柱温35℃；样品室4℃；流速0.3mL/min；进样量2.0mL；样品池10℃；流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为含0.1v/v％甲酸的乙腈溶液，洗脱梯度为：0-2min 30％-31％B；2-4.1min 31％-31％B；4.1-4.2min 31％–35％B；4.2-12min35％–60％B；12-15min 60％–65％B。

3.3质谱条件

Qtrap-4000三重四级杆线性离子阱质谱仪配有一个电子喷雾离子源(ESI)。正离子模式下工作，扫描方式为多反映检测模式(MRM)。喷射电压(Ion spray voltage) +5500；离子源温度(Source temperature)400℃；雾化器(Gas1)50psi；加热器(Gas2)50psi；氮气用于碰撞器和辅助气体；打开接口加热器。数据采集和处理使用Analysis Software 1.6。

3.4类叶牡丹样品的检测

本实验采用UPLC-ESI-TQ-LIT-MS/MS质谱，利用以上响应面优化获得的使 [M+H/NH₄]⁺裂解最优去簇电压DP和CE值，同时检测类叶牡丹样品中的9种皂苷含量。

3.4.1标准曲线的建立及检测限的测定

将标准品经过适当的稀释，配制成系列质量浓度的混合对照品溶液，进样分析。以信噪比(Signal/Noise,S/N)为3:1和10:3为标准确定被测物的最低检出限(LOD)和最低定量限(LOQ)见表3。根据最低定量限和实际样品浓度范围选择标准曲线范围，以峰面积为y值，被测物浓度作为x值，建立类叶牡丹中9种皂苷成分的标准曲线并进行回归计算。结果表明，混合对照品各组分在一定范围内线性关系良好。

表3：9种皂苷成分的校准曲线和LOD及LOQ

3.4.2样品含量测定

通过混合标准品标准曲线的建立，对不同产地、批次、提取组分以及纯化组分的类叶牡丹皂苷1-9进行含量测定，图2为典型的标准品和样品色谱图。

实施例2辽东楤木三萜皂苷定量方法的建立

1、实验仪器

同实施例1。

2、标准品的配制

精密称取1-10种皂苷标准品(图3所示)适量，精密称定，加甲醇配制成质量浓度分别为1.69、0.21、0.20、0.28、1.00、0.98、1.04、1.00、1.00、1.00mg/ml的混合对照品溶液作为储备液，于4℃保存备用。

3、基于响应面中心组成设计优化DP、CE和CXP质谱参数

3.1总体响应面Box-Behnken实验设计

采用质谱多反应监测(MRM)模式，以皂苷1-10为模板化合物，通过响应面优化质子/氨化离子裂解靶向离子对的响应值和重现性。根据质子化裂解靶向离子对 Q1/Q3的计算公式，即Q1＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺)和Q3＝[苷元-H₂O+H]⁺或[苷元 -2H₂O+H]⁺)，得出皂苷1-10的靶向离子对分别为1138.5→455.5、1121.5→455.3、 959.5→455.3、1105.5→439.3、1121.5→455.3、1122.5→439.3、1284.5→439.3、 974.5→439.3、944.5→439.3、812.5→439.3(表5)。

根据单因素实验结果综合考虑，选择DP值实验范围为60-90V，CE值实验范围为25-40eV。在优化试验设计中选择DP(X1)、CE(X2)、CXP(X3)为自变量，考察指标为色谱峰响应值(Y代表某个皂苷成分与内标的峰面积比值)。根据Box-Behnken design实验原理，共设计17个试验点，其中12个析因点；中心试验重复5次，用以估计试验误差。表4为十种皂苷[M+H/NH₄]⁺裂解响应面法实验设计与实验结果，进而通过Design-Expert软件对回归方程计算，预测得出每个化合物相应的DP、CE 和CXP值(表5)。

表4：基于Box-Behnken实验设计的17次实验辽东楤木皂苷标准品的检测结果

表5：10种辽东楤木皂苷单体皂苷质子化MRM离子对和优化得到的DP和CE值

3.2色谱条件

Waters超高效液相；色谱柱：HSS T3(2.1×150mm,1.8μm)；保护柱：HSS T3 (2.1×5mm,1.8μm)；色谱条件：柱温35℃；样品室4℃；流速0.3mL/min；进样量5.0μL；样品池温度10℃；流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v％甲酸乙腈液，洗脱梯度为0-1.5min10％-35％B；1.5-7min 35％-35％B；7-7.5min 35％-50％B；7.5-11min 50％-90％B；11-11.5min 90％-10％B；11.51-15min 10％-10％ B。

3.3质谱条件

Qtrap-4000三重四级杆线性离子阱质谱仪配有一个电子喷雾离子源(ESI)。正离子模式下工作，扫描方式为多反应检测模式(MRM)。喷射电压(Ion spray voltage) +5500；离子源温度(Source temperature)250℃；雾化器(Gas1)50psi；加热器(Gas2) 50psi；氮气用于碰撞器和辅助气体；打开接口加热器。数据采集和处理使用Analysis Software 1.6。

3.4辽东楤木样品的检测

本实验采用UPLC-ESI-TQ-LIT-MS/MS质谱，利用以上响应面优化获得的使 [M+H/NH₄]⁺裂解最优去簇电压DP，碰撞能CE和碰撞室射出电压CXP的值，同时检测辽东楤木样品中10种皂苷含量。

3.4.1标准曲线的建立及检测限的测定

将标准品经过适当的稀释，配制成系列质量浓度的混合对照品溶液，进样分析。以信噪比(Signal/Noise,S/N)为3:1和10:3为标准确定被测物的最低检出限(LOD)和最低定量限(LOQ)。根据最低定量限和实际样品浓度范围选择标准曲线范围，以峰面积为y值，被测物浓度作为x值，建立辽东楤木中10种皂苷成分的标准曲线并进行回归计算。结果表明，混合对照品各组分在一定范围内线性关系良好。

3.4.2样品含量测定

通过混合标准品标准曲线的建立，对不同产地、批次、提取组分以及纯化组分的辽东楤木皂苷1-10进行含量测定，图4为典型的标准品和样品色谱图。

Claims (8)

1.利用电喷雾质子化裂解-质谱多反应监测(MRM)模式对中药中三萜皂苷进行定性和定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：三萜皂苷在含有甲酸或甲酸氨的流动相中形成稳定的[M+H]⁺和/或[M+NH₄]⁺分子离子峰，运用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪，采用电喷雾阳离子串联质谱检测模式(ESI⁺-MRM)，通过单因素实验法和响应面法，快速在线优化包括去簇电压(DP)以及碰撞能(CE)在内的质谱参数，使之形成高强度的中药三萜皂苷MRM靶向离子对，通过此系列特征性的MRM靶向离子对，达到对中药中三萜皂苷快速定性和定量分析的目的。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，根据质子化裂解靶向离子对Q₁/Q₃的计算公式，即Q₁＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺)和Q₃＝[苷元+H-H₂O]⁺或[苷元+H-2H₂O]⁺)或[苷元+H-nH₂O]⁺，其中n为大于或等于0的整数，分别预测得出中药三萜皂苷MRM系列特征性的靶向离子对。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对碰撞室射出电压(CXP)质谱参数的优化。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在单因素实验的基础上，若考虑去簇电压(DP)以及碰撞能(CE)两个主要因素的影响，优选使用Central-Composite design方法；若考虑去簇电压(DP)、碰撞能(CE)以及碰撞室射出电压(CXP)三个因素的影响，优选使用Box–Behnken design方法。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法按照以下步骤进行：

(1)建立MRM靶向离子

采用质谱MRM检测模式，以皂苷标准品为模板化合物，通过响应面优化质子/氨化离子裂解MRM靶向离子对，根据质子化裂解靶向MRM离子对Q₁/Q₃的计算公式，Q₁＝[M+H]⁺或[M+NH₄]⁺)和Q₃＝[苷元+H-H₂O]⁺或[苷元+H-2H₂O]⁺)或[苷元+H-nH₂O]⁺，其中n为大于等于0的整数，提前预测得出中药三萜皂苷标准品的靶向离子对；

(2)基于响应面法优化DP、CE和CXP等质谱参数

用Central-Composite design方法优化两因素的DP和CE值，用Box–Behnken design方法优化三因素的DP、CE和CXP值；

(3)标准品溶液的配制

精密称取皂苷标准品，精密称定，加甲醇配制成把标准品储备液稀释成不同浓度的标准品溶液；于4℃保存备用；

(4)运用液相色谱-串联四级杆质谱联用仪对标准品溶液以及样品溶液进行检测；

(5)标准曲线的建立

以不同浓度的皂苷标准品的峰面积为纵坐标，以皂苷标准品的浓度为横坐标进行线性回归分析，建立标准曲线；

(6)样品溶液中皂苷的含量的计算

样品溶液按照步骤(4)的方法进行测定，根据步骤(5)建立的标准曲线计算出样品溶液中皂苷的含量。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品为类叶牡丹或辽东楤木。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当所述的样品为类叶牡丹时，其色谱检测条件以及质谱检测条件如下：

色谱检测条件：色谱柱：HSS T3(150mm×2.1mm,1.8μm)；保护柱：HSS T3(2.1mm×5mm,1.8μm)；柱温35℃；样品室4℃；流速0.3mL/min；进样量2.0μL；样品池10℃；流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为含0.1v/v％甲酸的乙腈溶液，洗脱程序为：0-2min 30％–31％B；2-4.1min 31％–31％B；4.1-4.2min 31％–35％B；4.2-12min 35％–60％B；12-15min 60％–65％B；

质谱检测条件：正离子模式下工作，扫描方式为多反应检测模式(MRM)；喷射电压：5500V；离子源温度：400℃；雾化器：50psi；加热器：50psi；氮气用于碰撞器和辅助气体；打开接口加热器。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当所述的样品为辽东楤木时，其色谱检测条件以及质谱检测条件如下：

色谱检测条件：色谱柱：HSS T3(150mm e optimization；保护柱：HSS T3(2.1mm×5mm,1.8μm)；色谱条件：柱温35℃；样品室4℃；流速0.3mL/min；进样量5.0μL；样品池温度10℃；流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v％甲酸乙腈液，洗脱梯度为0-1.5min10％-35％B；1.5-7min 35％-35％B；7-7.5min 35％-50％B；7.5-11min 50％-90％B；11-11.5min 90％-10％B；11.51-15min 10％-10％B；

质谱检测条件：正离子模式下工作，扫描方式为多反映检测模式(MRM)；喷射电压：5500V；离子源温度：250℃；雾化器：50psi；加热器：50psi；氮气用于碰撞器和辅助气体；打开接口加热器。