CN107722135A - 一种具有抗衰老活性的甘草多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种甘草多糖的制备方法。本发明选用特定的溶剂，通过简单的溶剂混合步骤即可得到具有较高抗衰老活性的甘草多糖，方法简单。

Description

一种具有抗衰老活性的甘草多糖的制备方法

技术领域

本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种具有抗衰老活性的甘草多糖的制备方法。

背景技术

甘草多糖是甘草的主要活性成分之一，周蓉等对甘草多糖分离纯化后，样品经高效毛细管电泳分析表明，该多糖组分由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，并以葡聚糖为主链。Takada K对从西北甘草匍匐茎中分离的甘草多糖进行控制Smith降解和限制水解。第一、二Smith降解产物和限制水解产物的甲基化分析表明，甘草多糖的核心结构含有由β-1,3-连接的D-半乳糖残基组成的一个主链。主链的3/5半乳糖单元在6位带有β-1,3-和β-1,6-D-半乳糖残基组成的侧链。

甘草多糖制备方法一般分为微波提取、超声提取、酶法提取、传统水提法等。(1)孙平等将甘草依次经石油醚(60～90℃)、乙醚和80％乙醇微波技术处理后，残渣在微波反应器中加水提取，提取液加活性炭脱色、醇沉后得甘草多糖，多糖含量仅13.9％。(2)刘霞、谢建新等将甘草破碎经依次经石油醚(60～90℃)、乙醚和80％乙醇超声处理后，残渣加水超声提取，所得提取液经活性炭脱色、醇沉得甘草多糖，多糖含量仅为14.01％。(3)李彩君等用纤维素酶处理甘草，并通过正交实验确定甘草多糖酶法提取的最佳工艺参数，该最佳条件下甘草多糖的提取率w＝32.9g/kg。(4)张泽生等通过单因素实验与正交实验研究甘草多糖提取工艺确定的最佳提取条件为30倍料液比，90℃，提取0.5h，提取2次，并未说明所得甘草多糖含量。(5)代巧玉等人对甘草多糖纯化进行了综述，纯化分为去蛋白、去除小分子等过程，蛋白质的去除方法通常有Sevag法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法、酶法、盐酸法和鞣酸法，这些方法可以单独使用，也可以两种或多种方法结合使用。而去小分子方法主要有分级沉淀、季铵盐沉淀法、凝胶柱层析和离子交换色谱法等。

甘草多糖作为多糖的一种，研究表明具有多种功效：(1)免疫调节作用：程安玮研究表明巨噬细胞受到甘草多糖刺激进一步分化成熟，成为活化巨噬细胞，使细胞体积增大，活力增强，糖氧化作用和吞噬功能增加，促使细胞内溶菌酶大量增多，细胞内DNA、RNA、糖原体、ACPase、ANAE、ATPase和SDH等多种酶活性显著增强，并能明显增强SOD和O2-的活性。王丽荣等将从甘草根中提取的甘草多糖，以不同剂量给予试验小白鼠,在试验期内甘草多糖能明显提高小鼠体重和淋巴细胞的E-玫瑰花环形成率。(2)抗病毒作用:常雅萍等用甘草多糖对7种RNA和DNA类病毒作了体外抗病毒研究。结果表明，甘草多糖对水疤性口炎病毒、腺病毒II型，HSV-Ⅰ和牛痘病毒均有明显的抑制作用。(3)抗肿瘤作用，王忱等将BALB/C小鼠接种S180荷瘤株后分别给与甘草多糖和对照药物12d后处死,取出荷瘤小鼠的肿瘤称重，结果表明给与甘草多糖的小鼠肿瘤明显小于对照组。王岳五等实验也表明，甘草多糖具有一定的抗肿瘤活性，可以延长腹水瘤小鼠的生存期，抑制实体瘤的生长。此外，赵云生等研究表明，甘草多糖对毛细血管炎性渗透及乙醇型与利血平型胃溃疡均具有抑制作用，量效关系明显。

综上所述，目前要得到具有活性的甘草多糖其方法存在耗时长，生产成本高，步骤繁琐，所得多糖活性较低，无法工业化生产等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种甘草多糖的制备方法，本发明制备得到甘草多糖具有显著的抗衰老活性，且制备方法简单。

本发明提供了一种甘草多糖的制备方法，包括以下步骤：

A)将甘草原料与一号溶剂混合加热，过滤，得到甘草多糖粗品；

所述一号溶剂选自磷酸水溶液、醋酸水溶液、盐酸水溶液、硫酸水溶液、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种；

B)将所述甘草多糖粗品与二号溶剂混合，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入三号溶剂混合，静置分层，得到上层清液；

所述二号溶剂选自水、氨水、NaCO₃水溶液、NaOH水溶液或KOH水溶液；

所述三号溶剂选自二氯甲烷或二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂；

C)将所述上层清液冷冻后融化，去除杂质，再与四号溶剂混合，得到沉淀物；

所述四号溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃和1.4-二氧六环中的一种或多种；

D)将所述沉淀物干燥，得到甘草多糖。

优选的，所述一号溶剂的质量浓度为1％～100％；所述甘草与一号溶剂的质量体积比为1:2～1:50；混合搅拌的时间为0.5～8h。

优选的，所述二号溶剂的质量浓度为0％～10％；所述甘草多糖粗品与二号溶剂的质量体积比为1g:(2～50)ml。

优选的，所述三号溶剂与所述混合溶液的体积比为10:1～1:10。

优选的，所述静置的时间为0.5～2h。

优选的，所述冷冻的温度为-20℃～0℃，所述冷冻的时间为1～24小时。

优选的，步骤C)中，所述四号溶剂与去除杂质后的溶液的体积比为50:1～1:1。

优选的，所述三号溶剂选自二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂，所述二氯甲烷与正丁醇的体积比为5:1～1:5。

优选的，所述甘草原料选自甘草浸膏粉或者甘草霜。

与现有技术相比，本发明提供了一种具有抗衰老活性的甘草多糖的制备方法，包括以下步骤：A)将甘草原料与一号溶剂混合加热，过滤，得到甘草多糖粗品；所述一号溶剂选自磷酸水溶液、醋酸水溶液、盐酸水溶液、硫酸水溶液、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种；B)将所述甘草多糖粗品与二号溶剂混合，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入三号溶剂混合，静置分层，得到上层清液；所述二号溶剂选自水、氨水水溶液、NaCO₃水溶液、NaOH水溶液或KOH水溶液。所述三号溶剂选自二氯甲烷或二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂；C)将所述上层清液冷冻后融化，去除杂质，再与四号溶剂混合，得到沉淀物；所述四号溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃和1.4-二氧六环中的一种或多种；D)将所述沉淀物干燥，得到甘草多糖。本发明选用特定的溶剂，通过简单的溶剂混合步骤即可得到具有较高抗衰老活性的甘草多糖，方法简单。

附图说明

图1为本发明提取甘草多糖粗品的流程示意图；

图2为本发明提供的甘草多糖粗品的纯化流程示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种具有抗衰老活性的甘草多糖的制备方法，包括以下步骤：

A)将甘草原料与一号溶剂混合加热，过滤，得到甘草多糖粗品；

所述一号溶剂选自磷酸水溶液、醋酸水溶液、盐酸水溶液、硫酸水溶液、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种；

B)将所述甘草多糖粗品与二号溶剂混合，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入三号溶剂混合，静置分层，得到上层清液；

所述二号溶剂选自水、氨水水溶液、NaCO₃水溶液、NaOH水溶液或KOH水溶液。

所述三号溶剂选自二氯甲烷或二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂；

C)将所述上层清液冷冻后融化，去除杂质，再与四号溶剂混合，得到沉淀物；

所述四号溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃和1.4-二氧六环中的一种或多种；

D)将所述沉淀物干燥，得到甘草多糖。

本发明首先提取甘草多糖粗品，具体的提取方法参见图1，图1为本发明提取甘草多糖粗品的流程示意图。具体方法如下：

将甘草原料与一号溶剂混合加热，过滤，得不溶物，即为甘草多糖粗品。其中，所述甘草原料选自甘草浸膏粉或者甘草霜。本发明对所述甘草浸膏粉或所述甘草霜的来源并没有特殊限制，可以为一般市售，也可以自行制备。

所述一号溶剂选自磷酸水溶液、醋酸水溶液、盐酸水溶液、硫酸水溶液、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种。

将所述甘草原料与一号溶剂混合加热后，过滤，得到不溶物，即为甘草多糖粗品。其中，所述一号溶剂的质量浓度为1％～100％，优选的，所述一号溶剂为磷酸水溶液、醋酸水溶液、盐酸水溶液或硫酸水溶液时，质量浓度为1％～10％，更优选为1％～5％；所述甘草原料与一号溶剂的质量体积比为1:2～1:50，优选为1：(5～40)，更优选为1：(15～25)；混合搅拌的时间为0.5～8h，优选为1～6小时，更优选为1～3小时。

在本发明中，所述混合加热优选为加热回流。

得到甘草多糖粗品后，将所述甘草多糖粗品进行纯化，具体方法参见图2，图2为本发明提供的甘草多糖粗品的纯化流程示意图。具体的：

将所述甘草多糖粗品与二号溶剂混合，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入三号溶剂混合，静置分层，得到上层清液；

本发明将所述甘草多糖粗品与二号溶剂混合，得到混合溶液(对应图2中的一号溶液)，所述二号溶剂选自水、氨水、NaCO₃水溶液、NaOH水溶液或KOH水溶液；所述二号溶剂的质量浓度为0％～10％，所述二号溶剂选自氨水、NaCO₃水溶液、NaOH水溶液或KOH水溶液时，质量浓度优选为1％～5％，更优选为2％～3％；所述甘草多糖粗品与二号溶剂的质量体积比为1g:(2～50)ml，优选为1g：(5～40)ml，更优选为1g：(15～25)ml。

接着，向所述混合溶液中加入三号溶剂混合，静置分层，得到上层清液(对应图2中的二号溶液)。

所述三号溶剂选自二氯甲烷或二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂，在本发明中，所述三号溶剂优选为二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂，所述二氯甲烷与正丁醇的体积比为5:1～1:5。所述三号溶剂与所述混合溶液的体积比为10:1～1:10。所述静置的时间为0.5～2h。

接着，将所述上层清液冷冻后融化，去除杂质，再与四号溶剂混合，得到沉淀物；

通过选用二氯甲烷或二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂作为除甘草多糖粗品中蛋白质的溶剂，并结合冷冻后融化的步骤可去除蛋白质以及将一些小分子杂质析出，提高纯化后多糖的含量。

在本发明中，所述冷冻的温度为-20℃～0℃，优选为-15℃～-5℃，所述冷冻的时间为1～24小时，优选为5～20小时，更优选为10～15小时。

去除杂质后的溶液(对应图2中的三号溶液)再与四号溶剂混合，得到沉淀物。

所述四号溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃和1.4-二氧六环中的一种或多种；所述四号溶剂与去除杂质后的溶液的体积比为50:1～1:1，优选为10：1～1：1。

最终，将所述沉淀物干燥，得到甘草多糖。

采用上述制备方法制备得到的甘草多糖对D-半乳糖致衰老模型小鼠具有较高的抗衰老作用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)操作步骤少：本发明仅通过分离、纯化2个步骤即可得到产品，效率高。

(2)生产周期短：本发明从原料甘草到制备得到高含量甘草多糖，只需1天时间。

(3)产品含量高：本产品所得甘草多糖含量可在80％以上。

(4)重现性好：本发明工艺简单，可以保证甘草多糖制备的重现性和稳定性。

(5)对设备及试剂要求低：所用试剂常见易得，设备简单，工艺容易实现标准化、自动化，可以实现产业化生产。

(6)本发明所得甘草多糖具有明显的抗衰老活性。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的甘草多糖的制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1制备甘草多糖

(1)分离：称取300g甘草霜加入15倍量(V/M)(ml/g)1％盐酸乙醇溶液，回流1h，过滤得不溶物，即为甘草多糖粗品；

(2)纯化：取步骤(1)中所得甘草多糖粗品，加15倍量(V/M)(ml/g)2％的NaOH水溶液溶解后得一号溶液，向一号溶液中加6倍体积量的二氯甲烷并混匀30min，静置分层1h，收集上层得二号溶液，－5℃冷冻15h，室温溶解后过滤得三号溶液，搅拌状态下将三号溶液加入至4倍量(V/V)的甲醇中，析出类白色固体，是为甘草多糖，滤出，干燥，甘草多糖含量为82.47％。

对比例1

与实施例1的方法相同，仅仅是没有冷冻后室温溶解过滤的步骤，得到的甘草多糖含量为38.94％。

对比例2

与实施例1的方法相同，仅将1％盐酸乙醇溶液改为80％乙醇，得到的甘草多糖含量为51.23％％。

对比例3

与实施例1的方法相同，仅将二氯甲烷改为三氯乙酸，得到甘草多糖的含量为60.73％。

实施例2制备甘草多糖

(1)分离：称取300g的甘草浸膏粉，加入20倍量(V/M)(ml/g)1％盐酸乙醇，回流1h，过滤得不溶物，即为甘草多糖粗品；

(2)纯化：取步骤(1)中所得甘草多糖粗品，加20倍量(V/M)(ml/g)2％的氨水水溶液溶解后得一号溶液，向一号溶液中加3倍体积量的二氯甲烷并混匀30min，静置分层1.5h，收集上层得二号溶液，-10℃冷冻10h，室温溶解后过滤得三号溶液，搅拌状态下将三号溶液加入至5倍量(V/V)的乙醇中，析出类白色固体，是为甘草多糖，滤出，干燥，甘草多糖含量为88.47％。

对比例4

与实施例2的方法相同，仅仅是没有冷冻后室温溶解过滤的步骤，得到的甘草多糖含量为42.03％。

对比例5

与实施例2的方法相同，仅将步骤(1)中的1％盐酸乙醇改为80％乙醇，得到的甘草多糖含量为62.3％。

对比例6

与实施例2的方法相同，仅将二氯甲烷改为三氯乙酸，得到甘草多糖的含量为64.19％。

实施例3制备甘草多糖

(1)分离：称取300g的甘草霜，加入15倍量(V/M)(ml/g)4％硫酸-乙醇1:5混合溶剂(即质量浓度为4％的硫酸水溶液与无水乙醇按照体积比为1:5混合)，回流1.5h，过滤得不溶物，即为甘草多糖粗品；

(2)纯化：取步骤(1)中所得甘草多糖粗品，加20倍量(V/M)(ml/g)纯净水溶解后得一号溶液，向一号溶液中加4倍体积量的正丁醇-二氯甲烷1:4(正丁醇与二氯甲烷按照体积比为1:4混合)的混合溶剂混匀30min，静置分层2h，收集上层得二号溶液，-6℃冷冻15h，室温溶解后过滤得三号溶液，三号溶液加入至5倍量(V/V)的乙醇中，析出类白色固体，是为甘草多糖，滤出，干燥，甘草多糖含量为92.09％。

对比例7

与实施例3的方法相同，仅仅是没有冷冻后室温溶解过滤的步骤，得到的甘草多糖含量为45.21％。

对比例8

与实施例3的方法相同，仅将步骤(1)中的4％硫酸-乙醇1:5混合溶剂改为80％乙醇，得到的甘草多糖含量为57.38％。

对比例9

与实施例3的方法相同，仅将正丁醇-二氯甲烷1:4的混合溶剂改为三氯乙酸，得到甘草多糖的含量为68.51％。

实施例4制备甘草多糖

(1)分离：称取300g的甘草浸膏粉，加入25倍量(V/M)5％硫酸乙醇溶液，回流1h，分离得甘草多糖粗品；

(2)纯化：取步骤(1)中所得甘草多糖粗品，加15倍量(V/M)(ml/g)纯净水溶解后得一号溶液，向一号溶液中加2倍体积量的正丁醇-二氯甲烷1:4的混合溶液(正丁醇与二氯甲烷按照体积比为1:4混合)混匀30min，静置分层1h，收集上层得二号溶液，0℃冷冻14h后，室温溶解后过滤得三号溶液，三号溶液加入至6倍量(V/V)的异丙醇中，得类白色固体，是为甘草多糖，滤出，干燥，甘草多糖含量为87.55％。

对比例10

与实施例4的方法相同，仅仅是没有冷冻后室温溶解过滤的步骤，得到的甘草多糖含量为39.08％。

对比例11

与实施例4的方法相同，仅将步骤(1)中的5％硫酸乙醇溶液改为80％乙醇，得到的甘草多糖含量为57.41％。

对比例12

与实施例4的方法相同，仅将正丁醇-二氯甲烷1:4的混合溶剂改为三氯乙酸，得到甘草多糖的含量为66.29％。

实施例5甘草多糖对D-半乳糖诱导小鼠衰老模型的抗衰老研究

(1)分组、造模：小鼠分别称重编号，随机分为6组，10只/组；分别为：

空白对照组(0组)、模型组(1组)、甘草多糖低剂量组(L组，50mg/kg/d)、甘草多糖中剂量组(M组，150mg/kg/d)、甘草多糖高剂量组(H组，450mg/kg/d)、阳性对照VE组(VE组，30mg/kg/d)。(甘草多糖选用实施例3制备的甘草多糖)

除0组外，其余各组在颈背部注射D-半乳糖生理盐水，200mg/kg/d，连续注射8周，0组注射同体积的生理盐水。造模同时，除0组外各组灌胃给予相应剂量甘草多糖，0组给予同体积生理盐水。

(2)解刨取材：8周后，小鼠断颈处死，解刨分离取出脑组织，测定SOD活性、MDA含量。

(3)结果及结论：测定各实验组SOD活性、MDA含量如表1所示，表1为抗衰老活性测定结果：

表1 抗衰老活性测定结果

与模型组相比，*P﹤0.05；**P﹤0.01

由表1可知，本发明所述甘草多糖能提高SOD水平和降低MDA含量，并且与模型组相比，有显著性差异。说明本发明所述甘草多糖具有一定的抗衰老活性。

对比例13

将甘草霜加95％乙醇回流提取3次，脱脂，过滤，药渣至通风处晾干后用热水回流提取3次，合并滤液，浓缩至适当浓度，加入4倍量的95％乙醇(溶液乙醇浓度为80％)进行醇沉，沉淀物加蒸馏水溶解至适当的浓度后，以Sevag法除蛋白，浓缩除蛋白样品后的147g粗多糖，得率为1.47％。粗多糖经对流水透析，透析袋内部分冻干，制备甘草多糖，对其进行活性研究(方法同实施例5)，测定其SOD活性、MDA含量，结果见表2：

表2 常规方法制备得甘草多糖抗衰老活性测定结果

与模型组相比，*P﹤0.05；**P﹤0.01

由表1和表2可知，本发明所制备的甘草多糖较常规方法制备的甘草多糖，具有显著的抗衰老活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种具有抗衰老活性的甘草多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)将甘草原料与一号溶剂混合加热，过滤，得到甘草多糖粗品；

所述一号溶剂选自磷酸水溶液、醋酸水溶液、盐酸水溶液、硫酸水溶液、甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种；

B)将所述甘草多糖粗品与二号溶剂混合，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入三号溶剂混合，静置分层，得到上层清液；

所述二号溶剂选自水、氨水、NaCO₃水溶液、NaOH水溶液或KOH水溶液；

所述三号溶剂选自二氯甲烷或二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂；

C)将所述上层清液冷冻后融化，去除杂质，再与四号溶剂混合，得到沉淀物；

所述四号溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃和1.4-二氧六环中的一种或多种；

D)将所述沉淀物干燥，得到甘草多糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述一号溶剂的质量浓度为1％～100％；所述甘草原料与一号溶剂的质量体积比为1:2～1:50；混合搅拌的时间为0.5～8h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二号溶剂的质量浓度为0％～10％；所述甘草多糖粗品与二号溶剂的质量体积比为1g:(2～50)ml。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述三号溶剂与所述混合溶液的体积比为10:1～1:10。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静置的时间为0.5～2h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻的温度为-20℃～0℃，所述冷冻的时间为1～24小时。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤C)中，所述四号溶剂与去除杂质后的溶液的体积比为50:1～1:1。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述三号溶剂选自二氯甲烷与正丁醇的混合溶剂，所述二氯甲烷与正丁醇的体积比为5:1～1:5。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甘草原料选自甘草浸膏粉或者甘草霜。