CN107308179A - 一种附子甘草多糖提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种附子甘草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：a、取附子1～4重量份、甘草4重量份；b、加入10～30倍体积量水，于70℃～90℃温浸提取4～8h，浓缩提取液；c、向b步骤所得浓缩液中加入乙醇，边加边搅拌；d、静置，沉淀，抽滤，收集滤渣；e、洗涤滤渣，干燥，即得。采用该方法可最大限度从甘草和附子中提取得到多糖，多糖提取率高达6.4％。本发明还提供了根据该方法得到的附子甘草多糖提取物，药效实验证明两种多糖组分相辅相成，协同作用，其抗氧化、增强免疫作用明显提高，且对正常肝细胞增殖无抑制作用，生物安全性佳，具有良好的临床应用前景。

Description

一种附子甘草多糖提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种附子甘草多糖提取物及其制备方法，属于医药领域。

背景技术

附子来源于毛莨科乌头属植物乌头(Aconitum carmichaeli Debx.)的子根及加工品，具有回阳救逆、补火助阳、祛风寒湿邪之功，用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阳萎、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿。

甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、光果甘草(G.glabraL.)或胀果甘草(G.inflata Batalin)的根及根茎，具有补心气、益脾气、祛痰止咳平喘、缓急止痛、清热解毒、调和药性之功，多用于气虚诸证及减毒。

中医临床上，常用附子、甘草、干姜等组成回阳救逆剂，主治阳气衰弱等证。而对于仅将附子和甘草配伍使用的研究，目前主要集中在两者配伍的减毒作用方面，鲜有涉及相关产品的利用和开发。CN103272012A公开了一种附子甘草提取物，由附子、甘草加水合煮，煎煮液离心、所得的沉积物干燥所得；药效实验证明其具有抗心衰的功效。然而，该提取物以乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等毒性物质为指标性成分，在用药的安全性方面存在较大问题，限制了附子甘草提取物的进一步应用。另有分别对附子多糖以及甘草多糖药理作用进行研究的报道(1、熊海霞等.附子多糖的药理作用研究进展[J].世界科学技术—中医药现代化，2013，15(9)：1948～1951；2、刘三侠等.甘草多糖药理作用研究进展[J].中国兽药杂志，2013，47(1):64～67)。然而，上述文献都是针对附子多糖或甘草多糖单独进行的研究，未见从甘草和附子中最大限度提取出多糖组分，研究其免疫调节功能和抗氧化作用的协同效应的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种附子甘草多糖提取物及其制备方法。

本发明提供了一种附子甘草多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

a、取附子1～4重量份、甘草4重量份；

b、加入10～30倍体积量水，于70℃～90℃温浸提取4～8h，浓缩提取液；

c、向b步骤所得浓缩液中加入乙醇，边加边搅拌；

d、静置，沉淀，抽滤，收集滤渣；

e、洗涤滤渣，干燥，即得。

优选的，a步骤取附子1重量份、甘草4重量份。

进一步优选的，b步骤加入20倍体积量水，提取温度90℃，提取时间8h。

更进一步的，b步骤将提取液浓缩至原体积10％～20％；c步骤加入浓缩液4倍体积量的95％v/v乙醇水溶液；d步骤于4℃静置；e步骤依次用无水乙醇、丙酮洗涤滤渣，于60℃干燥。

本发明提供了一种根据所述制备方法制备得到的附子甘草多糖提取物。

本发明提供了所述附子甘草多糖提取物在制备抗氧化、增强免疫的药物中的用途。

本发明提供了一种药物组合物，它是以有效量的所述附子甘草多糖提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

本发明提供了一种附子甘草多糖提取物的制备方法，采用该方法可最大限度从甘草和附子中提取得到多糖，多糖提取率高达6.4％。本发明还提供了根据该方法得到的附子甘草多糖提取物，药效实验证明两种多糖组分相辅相成，协同作用，其抗氧化、增强免疫作用明显提高，且对正常肝细胞增殖无抑制作用，生物安全性佳，具有良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明多糖组合物清除DPPH自由基的能力图；

图2为本发明多糖组合物清除DPPH自由基能力的稳定性图；

图3为本发明多糖组合物对正常肝细胞增殖作用的影响图；

图4为本发明多糖组合物对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖的影响图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本发明多糖组合物的制备

称取附子100g、甘草400g，加入20倍体积量水，于90℃温浸提取一次，共8h，收集滤液。60℃减压蒸发浓缩至原体积的15％，浓缩液加入95％乙醇水溶液至乙醇浓度为80％，于4℃冰箱中静置过夜，抽滤，依次用无水乙醇溶液、丙酮洗涤沉淀2次，60℃干燥得本发明提取物13.5g。

实施例2本发明多糖组合物的制备

称取附子100g、甘草400g，加入10倍体积量水，于70℃温浸提取2次，每次4h，收集滤液。60℃减压蒸发浓缩至原体积的15％，浓缩液加入95％乙醇水溶液至至乙醇浓度为80％，于4℃冰箱中静置过夜，抽滤，依次用无水乙醇溶液、丙酮洗涤沉淀2次，60℃干燥得本发明提取物10.2g。

实施例3本发明多糖组合物的制备

称取附子100g、甘草400g，加入10倍体积量水，于80℃温浸提取3次，每次6h，收集滤液。60℃减压蒸发浓缩至原体积的15％，浓缩液加入95％乙醇水溶液至乙醇浓度为80％，于4℃冰箱中静置过夜，抽滤，依次用无水乙醇溶液、丙酮洗涤沉淀2次，60℃干燥得本发明提取物24.1g。

实施例4本发明多糖组合物的制备

称取附子100g、甘草400g，加入20倍体积量水，于90℃温浸提取1次，每次4h，收集滤液。60℃减压蒸发浓缩至原体积的15％，浓缩液加入95％乙醇水溶液至乙醇浓度为80％，于4℃冰箱中静置过夜，抽滤，依次用无水乙醇溶液、丙酮洗涤沉淀2次，60℃干燥得本发明提取物8.6g。

以下通过效果实验证明本发明的有益效果。

实验例1本发明附子甘草多糖提取率对比实验

多糖检测方法：采用硫酸苯酚法测定多糖含量，精确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品适量，置于容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的葡萄糖标准品溶液。分别精确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL葡萄糖标准品溶液置于离心管中，精确加入新制成的苯酚溶液1mL及5mL浓硫酸溶，常温下放置30min取出，放入冷水浴中15min，放至室温，以等体积水按同样显色操作作为空白对照，采用紫外可见分光光度计在490nm波长处测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标(x//mg/mL)、吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，得回归方程为：y＝8.36x-0.042，R2＝0.9993。

取1mL多糖样品溶液(0.5mg/mL)置于离心管中，加入5％苯酚-硫酸0.5mL，再加入浓硫酸0.5mL，振荡，室温放置30min，采用紫外可见分光光度计在490nm波长处测吸光度，根据上述回归方程计算多糖浓度。

提取方法：称取附子100g、甘草400g粗粉放入三角锥瓶中，设定9个实验组进行提取。提取时间分别为4、6、8h，温浸温度分别为70、80、90℃，料液比分别为1：10、1：20、1：30。

表1采用不同提取条件所得多糖提取率结果比较

实验结果：实验组9所得多糖提取率最高(达6.4％)，相较于实验组1提取率增加了83％，上升幅度非常显著。以上结果表明，附子甘草多糖的最佳提取工艺为：提取时间8h、提取温度90℃、料液比为1:20。

实验例2本发明多糖提取物抗氧化作用

1、采用清除DPPH(二苯代苦肼基自由基)自由基的能力，测定本发明多糖组合物的抗氧化活性。预先配置1.0×10^-4mol/L的DPPH，在10mL比色管中先后加入上述DPPH溶液和2.0mL试样的溶剂(蒸馏水)，混匀、静置30min后，用比色皿在490nm波长处，测吸光度值，记为A0；加入2.0mL 1.0×10^-4mol/L的DPPH的溶液和2mL本发明多糖组合物试样混匀后测定吸光度值，记为Ai。将本发明多糖组合物采用蒸馏水分别稀释至1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL等6个梯度，每一吸光度平行测定3次，取其平均值，按以下公式计算清除率：清除率＝[(A0-Ai)/A0]×100％，以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标，建立本发明提取物与DPPH自由基清除率的关系。结果见图1。

图1表明，本发明多糖组合物具有显著的抗氧化能力，对DPPH自由基的清除作用随多糖组合物浓度的增大逐渐增强。

2、考察pH、温度和时间对本发明多糖组合物溶液抗氧化能力稳定性的影响。pH：取浓度为1mg/mL的本发明多糖组合物分别调整pH 2、4、6、8、10、12，室温放置2h后，测定其对DPPH自由基的清除率。温度：将本发明多糖组合物溶液置于有盖离心管，分别于40、60、80、100℃水浴中加热2h，测定其对DPPH自由基的清除率。时间：将本发明多糖组合物溶液常温放置2、4、8、12、24h，测定其对DPPH自由基的清除率。结果见图2。

图2表明，本发明多糖组合物的抗氧化能力具有耐酸性、耐高温性及贮藏稳定性。

实验例3本发明多糖提取物正常细胞毒性作用

取对数生长期正常肝细胞L02，消化、重悬，调节细胞浓度并接种至96孔培养板，5000个细胞/孔,继续培养24小时后，吸弃细胞培养液，并添加由细胞培养液配制的不同浓度本发明多糖组合物，另有对照组，每孔加入空白细胞培养液。分别培养24、48小时后，吸弃培养液，每孔添加新细胞培养液稀释的MTT溶液(0.5mg/mL)，继续培养4小时后，吸弃培养液，每孔加入0.1mL DMSO，振摇充分溶解细胞内生成的紫色甲臜结晶，于570nm下测定每孔吸光度(OD值)。结果见图3。

图3表明，本发明多糖组合物对正常肝细胞增殖无抑制作用，生物安全性好。

实验例4本发明多糖提取物体外免疫调节作用

用含10％胎牛血清的DMEM培养液调整RAW264.7细胞密度为5×105个/mL，接种到96孔细胞培养板中，每孔100μL，将细胞培养板置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养24h，细胞贴壁后吸去上清液，加入浓度为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1200μg/mL本发明多糖组合物样品100μL，以加入等体积浓度为10μg/mL的脂多糖(LPS)为阳性对照(LPS组)，仅加培养基的孔为阴性对照(control组)，平行6个复孔。继续培养24h，吸去上层培养液，加入新细胞培养液稀释的MTT溶液(0.5mg/mL)100μL/孔，同样条件下继续培养4h，吸去上清，加入100μL DMSO震荡10min，置室温10min后，用酶标仪在570nm处测定吸光值。计算公式如下：巨噬细胞存活率＝A1/A2×100。其中A1为样品组吸光度值，A2为阴性对照组吸光度值。结果见图4。

促进巨噬细胞增殖是激活机体免疫应答的重要途径之一，本实验采用LPS作为阳性物质刺激巨噬细胞增殖。由图4可知，本发明多糖组合物具有有丝分裂原作用，可促进巨噬细胞增殖，且呈浓度依赖性，说明本发明多糖组合物具有免疫增强作用。

实验例5本发明多糖提取物的临床实验结果

病例：患者，男，75岁，症状为面色苍白，少气懒言，倦怠乏力，动则喘息，张口抬肩，自汗，食少便溏，舌淡苔白，脉虚弱。为心脾两虚，免疫功能低下，常见畏寒、虚弱无力等症。

治疗：将附子甘草合煎所得多糖用于该患者口服，每天2次，每次3-5g，连续使用6个月，以上症状均得到明显改善。

Claims (7)

1.一种附子甘草多糖提取物的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

a、取附子1～4重量份、甘草4重量份；

b、加入10～30倍体积量水，于70℃～90℃温浸提取4～8h，浓缩提取液；

c、向b步骤所得浓缩液中加入乙醇，边加边搅拌；

d、静置，沉淀，抽滤，收集滤渣；

e、洗涤滤渣，干燥，即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：a步骤取附子1重量份、甘草4重量份。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：b步骤加入20倍体积量水，提取温度90℃，提取时间8h。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：b步骤将提取液浓缩至原体积10％～20％；c步骤加入浓缩液4倍体积量的95％v/v乙醇水溶液；d步骤于4℃静置；e步骤依次用无水乙醇、丙酮洗涤滤渣，于60℃干燥。

5.一种根据权利要求1～4任意一项所述制备方法制备得到的附子甘草多糖提取物。

6.权利要求5所述附子甘草多糖提取物在制备抗氧化、增强免疫的药物中的用途。

7.一种药物组合物，其特征是：它是以有效量的权利要求5所述附子甘草多糖提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。