CN107712345A - 一种核苷酸混合物晶体粉末及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核苷酸混合物晶体粉末及其制备方法。本发明通过将核糖核酸酶解液进行固液分离、酶解液脱色、脱色后的酶解液pH调至6.5～10.0、浓缩、结晶、过滤、干燥，同时得到了含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的核苷酸混合物晶体粉末。本发明提供的核苷酸混合物晶体粉末纯度高，稳定性好，不吸潮，具有良好的颗粒性、流动性，能够广泛应用于饲料行业。本发明提供的制备方法收率高、操作简单、成本低，适于工业化生产。

Description

一种核苷酸混合物晶体粉末及其制备方法

技术领域

本发明属于动物饲料工业领域，具体涉及一种核苷酸混合物晶体粉末及其制备方法。

背景技术

作为生物体内的一种重要的低分子化合物，核苷酸在机体内发挥着重要的生理生化功能，它能够合成遗传物质、传递细胞信号、参与能量代谢及作为辅酶等。动物机体内的细胞增殖需要核苷酸合成核酸，特别是淋巴组织和肠组织等快速分裂中。核苷酸来源可以是从头合成途径和补救途径，动物能够在体内合成核苷酸，补救途径则是利用外源核苷酸或核苷酸片段合成新的核苷酸。由于动物本身能够合成核苷酸，所以长期以来人们并没有将其视为必须营养素，但是近些年来的研究结果表明，很多情况下只靠体内合成的核苷酸并不能满足各种代谢的需要，而核苷酸缺乏会对免疫系统、肝功能、心脏功能和胃肠道功能造成影响。尤其动物处于应激、免疫挑战、肝损伤和快速生长的情况下，机体更需要补充外源核苷酸。所以核苷酸作为一种条件性的必须营养物质，需要在日粮中补充以维持正常机体的代谢。

目前，外源核苷酸已经被视为畜禽不可或缺的一种半必需营养素，再加上其资源丰富，生产工艺简单，无毒无害，因此作为新一代的饲料添加剂，外源核苷酸在动物生产中拥有广阔的应用和发展前景。

目前，核苷酸混合物的制备方法已有文献报道。

中国专利申请201210593155.1公开了以核糖核酸为原料，酶法水解得到混合核苷酸液体经直接喷雾干燥得到喷干的混合核苷酸。

中国专利申请200810195178.0公开了将核酸湿粗品溶于水后，用来自麦芽根的高活力磷酸二酯酶进行高效定向酶解反应，酶解结束后直接喷雾干燥、粉碎，得到混合型核苷酸。

中国专利申请200810155484.1公开了一种混合核苷酸的生产方法，包括制备核糖核酸溶液；酶解核糖核酸溶液；过滤；脱色柱脱色；钠滤浓缩。浓缩液可进一步通过喷雾干燥制得混合核苷酸粉末。

由此可见，现有的报道中核苷酸混合物的制备方法大多采用的是喷雾干燥法，即直接将溶液进行喷雾干燥得到的混合核苷酸。通过重复其工艺，我们发现，直接喷雾干燥的产品稳定性差，极易吸潮，纯度低(约70～75％)，而且样品的颗粒性、流动性、压实性均较差，在储存与后续混料拌料过程中均存在一定的问题。

除此之外，中国专利申请200510094493.0公开了一种酶法生产核苷酸的工艺，包括制备核糖核酸溶液、酶解核糖核酸、脱色柱脱色、低温层析分离、纳滤浓缩、结晶，制备得到四种不同的核苷酸单体。该方法存在低温层析和离子交换操作，分离成本较高，同时需要对低温层析分离出的每个单体分别进行纳滤浓缩、结晶，操作繁琐、生产周期长，用于饲料行业经济性欠佳。并且对于层析后的鸟苷酸，浓缩时容易呈现黏度很大的胶状，果冻状态。

发明内容

本发明的目的在于提供一种核苷酸混合物晶体粉末，该晶体粉末纯度高，稳定性好，不吸潮，具有良好的颗粒性、流动性。

本发明的另一个目的是提供所述晶体粉末的制备方法，该方法创造了适合核苷酸结晶的合适条件，收率高、操作简单、成本低、适于工业化生产。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明采用动态蒸汽吸附(DVS)来测定样品在不同湿度条件下的稳定性。其基本原理在于：当样品与具有给定相对湿度的空气接触时，对样品的重量进行监测。由于水的吸收或释放，样品重量会变化，直到建立起平衡状态。本发明中，核苷酸混合物晶体粉末在25℃，76％相对湿度条件下具有良好的稳定性，不同湿度条件下重量变化小于0.2wt.％，优选小于0.1wt.％，更优选地小于0.08wt.％。

d₁₀和d₅₀是表示颗粒尺寸分布的已知方式，d₅₀是指某一颗粒尺寸值，要使得50vol.％晶体的颗粒尺寸小于所述值。d₅₀也指基于平均体积的晶粒尺寸。同样地，d₁₀是指某一颗粒尺寸值，要使得10vol.％晶体的颗粒尺寸小于所述值。确定d₁₀和d₅₀的优选方法是激光衍射，本发明中所使用的设备是Microtrac S3500，Microtrac Inc.，USA。

本发明提供了d₅₀高于30μm，优选高于50μm的四种核苷酸混合物晶体粉末。对于d₅₀，没有特定的上限。根据本发明的粉末的d₅₀可以小于200μm，例如小于150μm。

本发明还提供了d₁₀高于5μm，优选高于10μm的四种核苷酸混合物晶体粉末。对于根据本发明的粉末的d₁₀，没有特定的上限。根据本发明的粉末的d₁₀可以小于60μm。

本发明中，四种核苷酸混合物的测定选用HPLC法，其中测定方法如下：核苷酸浓度用高效液相色谱仪进行测定，色谱柱为Zorbax SB-Aq C18柱，柱规格为250×4.6mm，5μm，检测器为可变波长检测器，检测过程中波长维持在254nm。测定过程中柱温为室温，所用流动相为溶剂A(2.3g/L磷酸二氢铵和3.5％(v)的甲醇的混合水溶液)和溶剂B(纯甲醇)，流速为1ml/min。测定过程采用梯度洗脱方式，总分析时间为15min。首先用溶剂A冲洗色谱柱，然后从第2min到第8min采用线性梯度的方式将流动相变为89％(V/V)的溶剂A和11％(V/V)的溶剂B，并在此梯度维持1min，然后再在1min内变为100％的溶剂A，维持在此梯度直到分析结束。

更详细地，本发明提供了一种核苷酸混合物晶体粉末，所述核苷酸混合物晶体粉末为钠盐的形式，纯度大于95％，其中，尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的质量比为1.0～2.0∶1.0～2.0∶0.8～1.2∶1；所述晶体粉末d₅₀高于30μm，d₁₀高于5μm；在25℃，76％相对湿度条件下，重量变化小于0.2wt.％。

进一步地，所述核苷酸混合物晶体粉末d₅₀高于50μm。

进一步地，所述核苷酸混合物晶体粉末d₁₀高于10μm。

进一步地，在25℃，76％相对湿度条件下，重量变化小于0.1wt.％，优选小于0.08wt.％。

进一步地，将所述核苷酸混合物晶体粉末溶于水中，配置成质量分数为5％的水溶液，具有6.0～8.0的pH值。

一种核苷酸混合物晶体粉末的制备方法，包括将核糖核酸酶解液进行固液分离、酶解液脱色、脱色后的酶解液pH调至6.5～10.0、浓缩、结晶、过滤、干燥。

进一步地，所述的核糖核酸酶解液(RNA酶解液)由核酸酶P1(EC 3.1.30.1)水解酵母核糖核酸得到，酶解液的pH为4.4～4.7，含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸四种核苷酸，其各自浓度均为3～10g/L。

进一步地，所述的固液分离方式为过滤或离心，脱色为活性炭、树脂或膜过滤脱色中的一种或几种，浓缩倍数为4～7倍。浓缩时可采用旋转蒸发仪或多效蒸发器。

更进一步地，所述的固液分离方式为板框过滤。

进一步地，脱色后的酶解液pH调至7.5～8.5。

本发明脱色后调节酶解液pH值，一方面改善了体系的热力学状态，使得四种核苷酸多以二价阴离子的形式存在，保证在后续浓缩过程中液体的粘度处于合理范围，可以顺利提浓。如果不调节pH，当体系中鸟苷酸的浓度大于12g/L时，容易呈现胶状，果冻状态，整个体系粘度极具上升，导致浓缩无法进行。另一方面，可以保证所得产品以钠盐形式存在。

进一步地，使用氢氧化钠调pH值，优选使用0.5～4mol/L的氢氧化钠溶液调pH值。

进一步地，调节PH值时溶液的温度为35～70℃。

进一步地，结晶反溶剂为80～100vol.％的乙醇，优选为88～98vol.％的乙醇，乙醇加入量为母液体积的1.0～4倍，优选为1.5～2.0倍。

更进一步地，乙醇结晶的降温速率为0.5～6℃/h，优选为1～3℃/h。降温速率影响产品粒径，降温速率过快，产品的平均粒径偏小，降温速率过慢，会严重影响生产的效率。

更进一步地，结晶温度为15～40℃。

结晶工艺作为产品精制纯化的重要一步，在结晶过程中操作条件对最终产品的性能影响较大。在本发明中，结晶时采用降温结晶和溶析结晶相耦合的方法，母液的浓度、反溶剂的加入量、结晶温度、搅拌速率及时间等操作条件对得到的核苷酸混合物的稳定性、颗粒性、纯度及收率等均会有一定的影响。

进一步地，过滤后洗涤滤饼，洗涤所用的溶剂为90～100vol.％的乙醇。

进一步地，干燥为鼓风干燥，干燥温度为30～70℃，优选35～55℃。

干燥的过程对核苷酸混合物的稳定性和水含量有一定影响，较低的干燥温度容易降低干燥效率，可能引起干燥不充分导致结块的现象；过高的干燥温度容易使得产品迅速严重失水，从而在室内环境下极易吸潮。

上述方法制备得到的核苷酸混合物晶体粉末在本发明的保护范围之内。

所述的核苷酸混合物晶体粉末在制备饲料添加剂中的应用在本发明的保护范围之内。

有益效果：

(1)本发明提供的核苷酸混合物晶体粉末纯度高，稳定性好，不吸潮，具有良好的颗粒性、流动性。并且作饲料添加剂时，对猪仔的生长有良好的促进作用，能够广泛应用于饲料行业。

(2)本发明提供的制备方法创造了适合核苷酸结晶的合适条件，收率高、操作简单、成本低，适于工业化生产。

附图说明

图1为实施例2所制备得到的核苷酸混合物晶体粉末的HPLC图(按照出峰时间依次为胞苷酸、尿苷酸、鸟苷酸和腺苷酸)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

取400g RNA酶解液，其pH为4.4，尿甘酸的浓度为7.0g/L，鸟甘酸的浓度为6.5g/L，胞苷酸的浓度为5.0g/L，腺苷酸的浓度为4.8g/L，板框过滤后，向滤液中加入0.5g活性炭，常温下搅拌60min后，过滤，弃滤渣。在40℃温度的搅拌条件下，用1mol/L的氢氧化钠溶液将滤液pH调至6.0～7.5，而后将其浓缩4倍，再向其中加入2倍体积的95vol.％乙醇，同时以2℃/h的速率降温至20℃，转化结晶4h，而后将晶浆进行过滤，使用1倍体积90％的乙醇洗涤滤饼层，得到的固体在40℃条件下鼓风干燥，即可得到含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的核苷酸混合物，结晶收率82％，产品液相纯度为97.8％，尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的质量比为1.4∶1.3∶0.9∶1.0。

实施例2

取400g RNA酶解液，其pH为4.5，尿甘酸的浓度为10.0g/L，鸟甘酸的浓度为9.1g/L，胞苷酸的浓度为7.50g/L，腺苷酸的浓度为7.8g/L，板框过滤后，向滤液中加入1g活性炭，50℃搅拌40min后，过滤，弃滤渣。在35℃温度的搅拌条件下，用1.5mol/L的氢氧化钠溶液将滤液pH调至7.5～8.5，而后将其浓缩5.5倍，再向其中加入4倍体积的80vol.％乙醇，同时以1℃/h的速率降温至15℃，转化结晶3h，将晶浆过滤，使用1倍体积95％的乙醇洗涤滤饼层，得到的固体在45℃条件下鼓风干燥，即可得到含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的核苷酸混合物，结晶收率90％，产品的液相纯度为98.5％，尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的质量比为1.8∶1.5∶1.2∶1.0。

实施例3

取500g RNA酶解液，其pH为4.7，尿甘酸的浓度为4.8g/L，鸟甘酸的浓度为4.5g/L，胞苷酸的浓度为3.8g/L，腺苷酸的浓度为3.0g/L，板框过滤后，向滤液中加入2g活性炭，40℃，搅拌30min后，过滤，弃滤渣，升温至50℃，搅拌状态下平衡30min，而后用2mol/L的氢氧化钠溶液将滤液pH调至8.5～10.0，而后将其浓缩7倍，再向其中加入3倍体积的无水乙醇，同时以3℃/h的速率降温至15℃，转化结晶3h，将溶液进行过滤，使用1倍体积无水乙醇洗涤滤饼层，得到的固体在35℃条件下鼓风干燥，即可得到含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的核苷酸混合物，结晶收率为95％，产品液相纯度为95.9％，尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的质量比为1.6∶1.5∶1.2∶1。

实施例4

取400g RNA酶解液，其pH为4.5，尿甘酸的浓度为8.0g/L，鸟甘酸的浓度为8.0g/L，胞苷酸的浓度为6.4g/L，腺苷酸的浓度为8.0g/L，过滤后，树脂脱色。在70℃温度的搅拌条件下，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液将脱色后的溶液pH调至7.5～8.5，而后将其浓缩5.5倍，再向其中加入1.5倍体积的98vol.％乙醇，同时以0.5℃/h的速率降温至40℃，转化结晶3h，将晶浆过滤，使用1倍体积95％的乙醇洗涤滤饼层，得到的固体在30℃条件下鼓风干燥，即可得到含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的核苷酸混合物，结晶收率84％，产品的液相纯度为93.6％，尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的质量比为1.0∶1.0∶0.8∶1.0。

实施例5

取500g RNA酶解液，其pH为4.6，尿甘酸的浓度为6.6g/L，鸟甘酸的浓度为6.6g/L，胞苷酸的浓度为4.0g/L，腺苷酸的浓度为3.3g/L，离心后，将离心液膜过滤脱色。将脱色后的溶液升温至50℃，搅拌状态下平衡30min，而后用4mol/L的氢氧化钠溶液将滤液pH调至8.5～10.0，而后将其浓缩6倍，再向其中加入4倍体积的88vol.％乙醇，同时以6℃/h的速率降温至30℃，然后反应3h，将溶液进行过滤，使用1倍体积95％的乙醇洗涤滤饼层，得到的固体在70℃条件下鼓风干燥，即可得到含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的核苷酸混合物，结晶收率为86％，产品液相纯度为93.8％，尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的质量比为2.0∶2.0∶1.2∶1。

对比例1

取500g RNA酶解液，其pH为4.7，尿甘酸的浓度为4.8g/L，鸟甘酸的浓度为4.5g/L，胞苷酸的浓度为3.8g/L，腺苷酸的浓度为3.0g/L，板框过滤后，向滤液中加入2g活性炭，40℃，搅拌30min后，过滤，弃滤渣，升温至50℃，搅拌状态下平衡30min，溶液pH 4.4～4.6，再向其中加入3倍体积的无水乙醇，同时以3℃/h的速率降温至25℃，发现体系成胶状，粘度极具上升，导致过滤无法进行，不能获得固体产品。

对比例2

根据专利CN102987169A中的方法，直接将溶液进行喷雾干燥制备核苷酸混合物。

实施例6、稳定性实验

本发明采用动态蒸汽吸附(DVS)来测定样品在不同湿度条件下的稳定性。对实施例1～5以及对比例2制备得到的核苷酸混合物分别进行室温、RH 76％条件下的稳定性实验，于30天取样跟踪样品重量变化，实验结果见表1。

实施例7、猪仔体重和死亡率影响因素实验

选择出生日期一致、体重相近、健康无疾病的7日龄猪仔328头，随机分成A、B、C、D、E组、F组、G组，分别喂以不同营养水平饲料，对照组A组饲喂正常饲料，对照组B组在饲喂正常饲料的基础上外加0.1wt％对比例2制备的核苷酸混合物的饲料，C组添加本发明实施例1中的所得核苷酸产品，D组添加本发明实施例2中的所得核苷酸产品，E组添加本发明实施例3中的所得核苷酸产品；F组添加本发明实施例4中的所得核苷酸产品；G组添加本发明实施例5中的所得核苷酸产品；实验初期，称量初始猪仔的重量并记录，实验期间每天正常饲喂饲料，至猪仔28～30天断奶后再喂20天，观察猪仔的重量变化情况和生存死亡情况，计算处猪仔的重量提高率和死亡率。计算公式如下：

猪仔重量提高率＝处理组猪仔重量增加率-对照组A猪仔重量增加率

抗生素使用下降率＝(对照组A猪仔抗生素使用量-处理组猪仔抗生素使用量)/对照组A猪仔抗生素使用量×100％

猪仔死亡率降低＝处理组猪仔饲料率-对照组A猪仔死亡率

实验结果见表1。

表1

对比例和实施例的比较表明，本发明中实施例的产品纯度高，湿度条件下稳定性好，颗粒性好。将本发明制备得到的核苷酸混合物晶体粉末添加0.1wt.％到多组猪仔的饲料中，与不加核苷酸混合物的对照组相比，28天内猪仔的日平均增重量提高了20wt.％以上，抗生素使用率下降12％以上，死亡率下降3％以上，对猪仔的生长有良好的促进作用。

Claims (10)

1.一种核苷酸混合物晶体粉末，其特征在于，所述核苷酸混合物晶体粉末为钠盐的形式，纯度大于95％，其中，尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸的质量比为1.0～2.0∶1.0～2.0∶0.8～1.2∶1；所述晶体粉末d₅₀高于30μm，d₁₀高于5μm；在25℃，76％相对湿度条件下，重量变化小于0.2wt.％。

2.根据权利要求1所述的核苷酸混合物晶体粉末，其特征在于，将所述核苷酸混合物晶体粉末溶于水中，配置成质量分数为5％的水溶液，具有6.0～8.0的pH值。

3.权利要求1所述的核苷酸混合物晶体粉末的制备方法，其特征在于，包括将核糖核酸酶解液进行固液分离、酶解液脱色、脱色后的酶解液pH调至6.5～10.0、浓缩、结晶、过滤、干燥。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的核糖核酸酶解液由核酸酶P1水解酵母核糖核酸得到，酶解液的pH为4.4～4.7，含有尿苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和腺苷酸四种核苷酸，其各自浓度均为3～10g/L。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的固液分离方式为过滤或离心，脱色为活性炭、树脂或膜过滤脱色中的一种或几种，浓缩倍数为4～7倍。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，脱色后的酶解液pH调至7.5～8.5。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，使用氢氧化钠调pH值，调节pH值时溶液的温度为35～70℃。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，结晶反溶剂为80～100vol.％的乙醇，乙醇加入量为母液体积的1.0～4倍，结晶温度为15～40℃。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，乙醇结晶的降温速率为0.5～6℃/h。

10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，干燥为鼓风干燥，干燥温度为30～70℃。