CN107703309A - 用于rLj‑RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒 - Google Patents

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王继红
吕莉
王玉平
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Abstract

本发明公开一种用于rLj‑RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒，有吸附在固相载体上的抗原及标准曲线板，抗原依次按照如下步骤制备：将rLj‑RGD3重组表达菌BL21培养至对数生长期；进行IPTG诱导；收集菌体并以每100 ml的菌体加4 ml 冰冷的1 X Binding buffer重悬细胞；置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；14000 g 离心20 min取上清，弃沉淀；上清用0.45 µm的一次性除菌滤器过滤；His.Bind Column纯化，得rLj‑RGD3蛋白为抗原；用所得抗原免疫实验兔得rLj‑RGD3多克隆抗体为标准品，用桥接法ELISA绘制标准曲线，灵敏度达到纳克级。

Description

用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及一种ELISA试剂盒，尤其是一种用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒。
背景技术
Lj-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由117个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD 模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白，其序列已公开于专利号为200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺RGD模体蛋白的基因克隆与表达”的中国发明专利文献中，即命名为Lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗肿瘤增殖、抗血栓等功效。
ELISA（酶联免疫吸附试验，酶联免疫试剂盒）是酶免疫测定技术中应用最广的技术，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体在固相表面进行反应，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，通过底物显色，读取OD450，比对标准曲线，确定所检测的抗原或抗体含量。常用的 ELISA（酶联免疫吸附试验）法有双抗体夹心法和桥接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定多克隆抗体，故后者常用于免疫原性检测，即检测抗原能够刺激机体形成特异抗体的能力，一般免疫原性检测时要求抗原蛋白含量大于5.0mg，蛋白纯度高于85%。虽然市场上有大量检测不同抗原或抗体的试剂盒有售，但目前受制备rLj-RGD3的得率及纯度影响，尚没有专用于rLj-RGD3免疫原性检测的方法和试剂盒。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒。
本发明的技术方案是：一种用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒，有吸附在固相载体上的抗原及标准曲线板，其特征在于：
所述抗原依次按照如下步骤制备：
（1）将rLj-RGD3重组表达菌BL21培养至对数生长期；
（2）进行终浓度为1 mM的IPTG诱导，诱导温度30 ℃；
（3）10000 g 离心10 min收集菌体，弃上清，以每100 ml的菌体加4 ml 冰冷的1 XBinding buffer重悬细胞；
（4）置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；
（5）14000 g 离心20 min取上清，弃沉淀；
（6）上清用0.45 µm的一次性除菌滤器过滤；
（7）His.Bind Column纯化：吸去His.Bind Column上室的贮液并打开下面管口；用10ml的1x Binding Buffer对柱子进行平衡；上样；用10 ml的1x Binding Buffer洗柱；用10ml的1x Wash Buffer洗柱；用5 ml的1x Elute Buffer洗脱目的蛋白；得rLj-RGD3蛋白为抗原；
所述标准曲线依次按照如下方法制备：
（1）用所得rLj-RGD3蛋白免疫两只实验兔：免疫前血清采集→每只兔采用50~200 μgrLj-RGD3与完全佐剂混合进行首次免疫→第14日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第二次免疫并于第21天采血进行效价测定→第35日采用每兔50~200 μgrLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第三次免疫并于第45天采血进行效价测定→第56日以每兔50~200 μg rLj-RGD3与PBS混合进行第四次免疫→于第70日将动物进行安乐死收集血清；
（2）血清用PBS等体积稀释，5000~10000 rpm离心15分钟，取上清→用10倍体积的PBS清洗亲和柱以平衡柱子→将稀释好的上清加入平衡好的柱子中，室温下混合摇动2~4小时或4℃过夜→用10倍体积的PBS清洗亲和柱→用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到rLj-RGD3多克隆抗体；
（3）用辣根过氧化物酶对rLj-RGD3蛋白进行标记；
（4）在酶标板上以每孔50 μl的rLj-RGD3抗原蛋白铺板，并于室温孵育1~2 h 或4 ℃过夜；
（5）室温下用封闭液封闭至少30 min；
（6）移除封闭液并洗板；
（7）His.Bind Column纯化：向包被rLj-RGD3蛋白的相应微孔板中分别加入500ng/ml、750 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、3000 ng/ml、4000 ng/ml梯度浓度的rLj-RGD3多克隆抗体100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育60 分钟→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入辣根过氧化物酶标记的rLj-RGD3蛋白100 μl/孔，25±2 ℃ 孵育60 分钟，形成rLj-RGD3蛋白- 抗体-rLj-RGD3-HRP 复合物→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入TMB 显色液100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育15 分钟→每孔加入终止液50 μl；
（8）再加入辣根过氧化物酶标记的rLj-RGD3蛋白，经过洗涤后加入底物显色，读取不同浓度rLj-RGD3多克隆抗体对应的OD450值，绘制标准曲线。
本发明提供了一种以检测rLj-RGD3为抗原在动物或人体内产生抗体的免疫原性为目的的桥接法ELISA试剂盒，为其在制药领域检测药物免疫原性实验奠定了基础。
附图说明
图1是本发明实施例兔rLj-RGD3多克隆抗体与抗原rLj-RGD3进行的Western-blotting结果图。
图2是本发明实施例的标准曲线板。
具体实施方式
本发明的用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒，有吸附在固相载体上的抗原及标准曲线板，试剂盒中的抗原依次按照如下步骤制备：
（1）将rLj-RGD3重组表达菌BL21培养至对数生长期，必要时主要对表达菌进行复苏；
（2）进行终浓度为1 mM的IPTG诱导，诱导温度30 ℃；
（3）10000 g 离心10 min收集菌体，弃上清，并使残液尽量流出，以每100 ml的菌体加4ml 冰冷的1 X Binding buffer重悬细胞；
（4）置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；
（5）14000 g 离心20 min取上清，弃沉淀；
（6）上清用0.45 µm的一次性除菌滤器过滤；
（7）吸去His.Bind Column上室的贮液，并打开下面管口；用10 ml的1x BindingBuffer对柱子进行平衡；上样；用10 ml的1x Binding Buffer洗柱；用10 ml的1x WashBuffer洗柱；用5 ml的1x Elute Buffer洗脱目的蛋白；得rLj-RGD3蛋白为抗原；
采用Brodford检测法进行rLj-RGD3纯化蛋白的浓度测定及采用SDS-PAGE进行rLj-RGD3蛋白纯度鉴定，其结果是所得rLj-RGD3蛋白的浓度高于85%，蛋白含量大于5.0mg。
标准曲线依次按照如下方法制备：
（1）用所得rLj-RGD3蛋白免疫两只实验兔：免疫前血清采集→每只兔采用50~200 μgrLj-RGD3与完全佐剂混合进行首次免疫→第14日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第二次免疫并于第21天采血进行效价测定→第35日采用每兔50~200 μgrLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第三次免疫并于第45天采血进行效价测定→第56日以每兔50~200 μg rLj-RGD3与PBS混合进行第四次免疫→于第70日将动物进行安乐死收集血清；
（2）血清用PBS等体积稀释，5000~10000 rpm离心15分钟，取上清→用10倍体积的PBS清洗亲和柱以平衡柱子→将稀释好的上清加入平衡好的柱子中，室温下轻轻混合摇动2~4小时或4 ℃过夜→用10倍体积的PBS清洗亲和柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白→用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到rLj-RGD3多克隆抗体；
所得rLj-RGD3抗原和rLj-RGD3多克隆抗体进行的Western-blotting结果如图1所示，图1中：Lane 1为10μg抗原与rLj-RGD3多克隆抗体的杂交带；Lane 2为20μg抗原与rLj-RGD3多克隆抗体的杂交带；
（3）用辣根过氧化物酶对rLj-RGD3蛋白进行标记；
（4）在酶标板上以每孔50 μl的rLj-RGD3抗原蛋白铺板，并于室温孵育1~2 h 或4 ℃过夜；
（5）室温下用封闭液（3% （w/v） MSD in PBS-T or PBS）封闭至少30 min；
（6）移除封闭液并洗板；
（7）向包被rLj-RGD3蛋白的相应微孔板中分别加入500ng/ml、750 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、3000 ng/ml、4000 ng/ml梯度浓度的rLj-RGD3多克隆抗体100 μl/孔→25±2℃ 孵育60 分钟→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入辣根过氧化物酶标记的rLj-RGD3蛋白（检测抗体工作液）100 μl/孔，25±2 ℃ 孵育60 分钟，形成rLj-RGD3蛋白- 抗体-rLj-RGD3-HRP 复合物→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入TMB 显色液100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育15 分钟→每孔加入终止液50 μl；
（8）读取不同浓度rLj-RGD3多克隆抗体对应的OD450值，绘制标准曲线。标准曲线板如图2所示。
图2中X轴：rLj-RGD3抗体浓度（ng/ml）；Y轴：OD450。从图2可以看出，OD450值大小（颜色的深浅）与样品中的rLj-RGD3抗体的量呈正相关，本发明试剂盒灵敏度为纳克级。

Claims (1)

1.一种用于rLj-RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒，有吸附在固相载体上的抗原及抗体标准曲线，其特征在于：
所述抗原依次按照如下步骤制备：
（1）将rLj-RGD3重组表达菌BL21培养至对数生长期；
（2）进行终浓度为1 mM的IPTG诱导，诱导温度30 ℃；
（3）10000 g 离心10 min收集菌体，弃上清，以每100 ml的菌体加4 ml 冰冷的1 XBinding buffer重悬细胞；
（4）置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；
（5）14000 g 离心20 min取上清，弃沉淀；
（6）上清用0.45 µm的一次性除菌滤器过滤；
（7）His.Bind Column纯化：吸去His.Bind Column上室的贮液并打开下面管口；用10ml的1x Binding Buffer对柱子进行平衡；上样；用10 ml的1x Binding Buffer洗柱；用10ml的1x Wash Buffer洗柱；用5 ml的1x Elute Buffer洗脱目的蛋白；得rLj-RGD3蛋白为抗原；
所述标准曲线依次按照如下方法制备：
（1）用所得rLj-RGD3蛋白免疫两只实验兔：免疫前血清采集→每只兔采用50~200 μgrLj-RGD3与完全佐剂混合进行首次免疫→第14日采用每兔50~200 μg rLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第二次免疫并于第21天采血进行效价测定→第35日采用每兔50~200 μgrLj-RGD3与不完全佐剂混合进行第三次免疫并于第45天采血进行效价测定→第56日以每兔50~200 μg rLj-RGD3与PBS混合进行第四次免疫→于第70日将动物进行安乐死收集血清；
（2）血清用PBS等体积稀释，5000~10000 rpm离心15分钟，取上清→用10倍体积的PBS清洗亲和柱以平衡柱子→将稀释好的上清加入平衡好的柱子中，室温下混合摇动2~4小时或4℃过夜→用10倍体积的PBS清洗亲和柱→用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到rLj-RGD3多克隆抗体；
（3）用辣根过氧化物酶对rLj-RGD3蛋白进行标记；
（4）在酶标板上以每孔50 μl的rLj-RGD3抗原蛋白铺板，并于室温孵育1~2 h 或4 ℃过夜；
（5）室温下用封闭液封闭至少30 min；
（6）移除封闭液并洗板；
（7）向包被rLj-RGD3蛋白的相应微孔板中分别加入500ng/ml、750 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、3000 ng/ml、4000 ng/ml梯度浓度的rLj-RGD3多克隆抗体100 μl/孔→25±2℃ 孵育60 分钟→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入辣根过氧化物酶标记的rLj-RGD3蛋白100 μl/孔，25±2 ℃ 孵育60分钟，形成rLj-RGD3蛋白- 抗体-rLj-RGD3-HRP 复合物→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入TMB 显色液100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育15分钟→每孔加入终止液50 μl；
（8）读取不同浓度rLj-RGD3多克隆抗体对应的OD450值，绘制标准曲线。
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