CN101464463A - 乙型肝炎病毒前s1与前s2联合检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
乙型肝炎病毒前s1与前s2联合检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒。包括包被反应条(48或96孔)、酶标记抗体、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、底物显色A液、底物显色B液和终止液。本发明的试剂盒能同时检测前S1抗原和前S2抗原，使用方便，结果准确。
Description
技术领域：
本发明涉及生物制剂技术领域。具体涉及乙型肝炎病毒前S1(preS1)抗原和前S2(preS2)抗原酶联免疫联合检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肝脏是维持生命的重要器官之一，肝脏受损的最重要因素之一是病毒感染。至今，已经鉴定出甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒等五种不同类型的受损肝脏的肝炎病毒。其中，由于乙肝病毒(HBV)破坏肝细胞而发展成慢性肝炎以及持续的病毒复制会导致肝硬化的可能性一直被人们广泛研究。
乙型肝炎病毒(HBV)是一环状的部分双螺旋结构，长约3.2kb。HBV基因组编码HBV抗原，所有四个功能性读码框架位于DNA负链，P基因编码DNA聚合酶。C基因编码HbcAg。S基因编码S抗原，前S1抗原和前S2抗原。X基因编码X产物。在S基因前面的两个小ORFs(开放阅读框open reading frame)与S基因ORF属于同一个读框，可以将ORFS通读下去，编码两种S蛋白相关的抗原，这两种抗原也存在于病毒颗粒的表面，这两个抗原分别称为前-S1(pre-S1)和前—S2(pre-S2)。同样，在ORFC前面也有一短的ORF，称为前—C(pre-C)，编码一较大的C蛋白相关抗原。所有这些ORF都在负链DNA(长链)上，其中S基因完全重叠于聚合酶基因中，X基因与聚合酶基因、C基因重叠，C基因与聚合酶也有重叠。
乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是一组构成病毒外膜的蛋白，其重要功能之一是识别肝细胞膜上的受体，使病毒与细胞接触，然后侵入胞内进行复制。HBsAg含有大、中，小3种分子形式蛋白质、它们都由病毒基因的S-开放阅读框架(S-ORF)所编码。其中小分子蛋白(SHBs)即主蛋白由226个氨基酸组成，中蛋白(MHBs)是在主蛋白N端加上55个氨基酸的preS2区，大分子蛋白(LHBs)根据病毒的亚型不同在中蛋白的N端前面再加上由108或119个氨基酸组成的preS1区，这3种蛋白分子都存在糖基化和非糖基化的形式。从血清中分离得到不同形态的病毒颗粒表面，SHBs含量最高，但MHBs和LHBs含量各异，在22nm球形空壳颗粒中，LHBs含量极低，而含DNA的完整的病毒颗粒中LHBs的含量可达20％。
HBV—DNA检测通常被作为HBV感染及复制的金标准，可用PCR方法测定HBV-DNA，但PCR方法操作要求高、成本高、需要较高的实验条件，在许多基层医疗单位尚不能开展而使其应用受限。传统认为在检测血清中乙肝“两对半”指标中，HBeAg转阴表示HBV复制的停止，但在HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者中，若前c区发生终止密码子突变时，或当位于x读码区的c启动子发生突变时，HBeAg表达就会终止或减少，导致HBeAg合成障碍，HBeAg呈阴性，但HBV DNA仍为阳性，病毒复制并未受到影响，说明HBeAg阴性并不能作为HBV复制终止理想的判断依据，因此探索新的判定HBV复制的免疫血清学指标已成为目前的研究热点之一。
前S1抗原(Pre-S1Ag)的临床意义和用途：1、反映HBV的感染与复制状况的指标，很多文献报道(刘拓等，乙型肝炎病毒前S1蛋白检测及临床意义，宁夏医学杂志，2006，28：204-205)(乐爱平等，HBVpreS1-Ag、HBV-DNA、HBVM的相关性分析及其意义，江西医学院学报，2004，44：27-30)前S1抗原可作为HbeAg和HBV-DNA检测的补充和对照，可弥补因病毒变异和其它原因造成的HBeAg(-)的“误寻”。2、应用于预后及药物疗效的判断，急性乙型肝炎患者前S1抗原阴转越早，预后越好，是病毒清除的最早迹象，反之，前S1抗原持续阳性，将发展至慢性肝炎，因病毒基因变异的HBeAb(+)慢性乙型肝炎病人，较易进展为肝硬化，甚至肝癌。加强检测前S1抗原，是一种检测疾病预后的良好手段。3、早期诊断乙型肝炎病毒的感染，前S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的最早期，在转氨酶升高前即可查出，提示可作为早期诊断乙肝病毒感染。在体检和献血员中加查前S1抗原，可起来疾病的早期诊断和尽早切断传染原的重要作用。
前S2抗原(Pre-S2)上有多聚人血清白蛋白的结合位点，参与HBV感染肝细胞的过程，在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起着重要的作用。文献报道也可将Pre-S2作为HbsAg无症状携带者有无传染性的一项特异而敏感的观察指标。(俞树高等，HbsAg无症状携带者血清HBV DNA与PreS2关系初探，福建医学院学报，1992，26：290-292)。
乙型肝炎前S1、前S2抗原不仅仅是HBV感染的新标志，还可作为病毒复制和急慢性乙肝的预后判断的指标，HBV PreS1-Ag、PreS2-Ag的连续监测也是免疫清除HBV、抗病毒治疗及疾病预后的良好观察指标。
发明内容：
本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种能同时检测前S1抗原和前S2抗原的试剂盒。
本发明提供了一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒。
试剂盒中各组成成分包括：抗体包被反应条48或96孔、酶标记抗体工作液1瓶(3.5ml或7ml)、阳性对照液1支(0.5ml或1ml)、阴性对照液1支(0.5ml或1ml)、20倍浓缩洗涤液1瓶(10ml或24ml)、底物显色A液1瓶(3.5ml或7ml)、底物显色B液1瓶(3.5ml或7ml)和终止液1瓶(3.5ml或7ml)。
阳性对照制备：HbeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者的血清。
阴性对照的制备：正常人血清。
底物显色A液：Na2HPO4·12H2O(1.7g/100ml)、柠檬酸(0.5g/100ml)、3％H2O2(200ul/100ml)。
底物显色B液：Na2HPO4·12H2O(1.7g/100ml)、柠檬酸(0.5g/100ml)、四甲基联苯胺(0.15g/100ml)。
终止液：2mol/L H2SO4
20倍浓缩洗涤液：Na2HPO4·12H2O(2.6g/100ml)、NaH2PO4·2H2O(0.4g/100ml)、20％ Tween-20(2.5ml/100ml)。
酶标记抗体工作液：Na2HPO4·12H2O(1.86g/L)、KH2PO4·2H2O(0.22g/L)、NaCl(9g/L)、牛血清白蛋白(10g/L)及按合适浓度稀释好的酶标记抗体。
抗体包被反应条：包被抗体以1-10ug/ml加入到配制好的碳酸盐缓冲液(Na2CO3：1.6g/L、Na2HCO3：2.93g/L)中，然后以100ul/孔加入到微孔板中，置4℃湿盒中静置过夜甩干。
本发明的另一目的是提供了上述乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒的制备方法。
(1)：采用基因重组的HbsAg制备HbsAb包被抗体或酶标记抗体；
(2)：采用基因重组的preS1Ag、前S2多肽制备抗前S1、前S2包被抗体或酶标记抗体；
(3)：抗血清或腹水用硫酸铵沉淀、亲和层析柱(ProteinA/G)或离子交换层析法(DEAE-Sepharose)纯化得到纯抗体；
(4)：制备预包被板：抗体做包被、加入包被液、加入反应板、4℃湿盒放置过夜、拍干、封闭、干燥、装袋；
(5)：制备酶标记物：酶标记抗体以合适的浓度加入酶标稀释液中。
(6)：将试剂盒中其余成分：阴性对照、阳性对照、底物显色A液、底物显色B液、终止液和浓缩洗涤液分装在小瓶中。
所述底物显色A液为：Na2HPO4·12H2O、柠檬酸、3％H2O2和重蒸水pH5.0。
所述底物显色B液为：Na2HPO4·12H2O、柠檬酸、3％ H2O2、TMB(四甲基联苯胺)和重蒸水pH5.0。
所述终止液为：浓H2SO4和重蒸水。
所述10倍浓缩洗涤液：Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、20％ Tween-20和重蒸水。
本发明的效果：
1、在样品中联合检测(包括合并检测和分开检测，以及同时检测和以任何顺序先后检测，优选同时、合并检测)乙型肝炎病毒前S1抗原与前S2抗原。
2、在相同反应容器(如反应孔)中在相同的反应中同时检测乙型肝炎病毒前S1与前S2抗原。
3、样品为来自待检个体的分离的生物学样品，如血清等。
4、包被抗体是抗HbsAg单抗，则酶标记结合物是抗前S1、前S2混合抗体，若包被抗体是抗前S1、前S2混合抗体，则酶标记结合物是抗HbsAg单抗。
具体实施方式：
实施例1制备联合检测乙型肝炎病毒前S1与前S2酶免试剂盒的生产步骤
(一)：抗体制备
1.制备HBsAb单抗：基因重组的HbsAg加福氏佐剂免疫Balb/C小鼠，得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆细胞株，打腹水得抗体，先硫酸铵沉淀后用亲和层析柱纯化。
2.制备前S1抗体：基因重组的preS1 Ag(1-119aa)加福氏佐剂免疫兔子，加等体积的饱和(NH4)2SO4沉淀，粗提后再用离子交换层析纯化。
3.制备前S2抗体：合成前S2多肽(1-55aa)加福氏佐剂免疫兔子，加等体积的饱和(NH4)2SO4沉淀，粗提后再用离子交换层析纯化。
(二)：制备酶标记物
纯化的HBAb单抗或前S1、前S2混合抗体，用简易过碘酸钠法与辣根过氧化物酶(HRP)偶联。
(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20ul 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(8)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，透析完全后，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，-20℃分装保存。
(三)：抗体选择模式
包被抗体是抗HbsAg单抗，则酶标记结合物是抗前S1、前S2混合抗体，若包被抗体是抗前S1、前S2混合抗体，则酶标记结合物是抗HbsAg单抗。
实施例2 试剂盒的配制
(一)：预包被抗体板的制备
1.包被
包被抗体以1-10ug/ml加入到配制好的碳酸盐缓冲液(pH：9.0-9.5)中，然后以100ul/孔加入到微孔板中，置4℃湿盒中静置过夜甩干。
2.封闭
在包被板条中，加入200ul/孔的封闭液，37℃封闭2小时，甩干，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋中，封口，在4℃中保存。
3.酶标记物：酶标记抗体以合适的浓度(1：1000)加入酶标稀释液中。
4.阳性对照制备：HbeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定OD值>0.5，分装。
5.阴性对照的制备：用本试剂盒测定正常人血清OD值在0-0.05之间，分装。
6.底物显色A液：
Na2HPO4·12H2O 1.7g
柠檬酸 0.5g
3％ H2O2 200
重蒸水 100ml
调整pH：5.0
7.底物显色B液：
Na2HPO4·12H2O 1.7g
柠檬酸 0.5g
重蒸水 100ml
调整pH至5.0后，加入10ml DMO含60mg TMB(四甲基联苯胺)的溶液25ul。
8.终止液：
浓H2SO4 11ml
重蒸水 89ml
9.10倍浓缩洗涤液：
Na2HPO4·12H2O 2.6g
NaH2PO4·2H2O 0.4g
20％ Tween-20 2.5ml
重蒸水 100ml
调整pH：7.20
实施例3 试剂盒使用
1、取所需量的板条，每孔加入100ul样品。各板设阳性对照2孔(100ul)、阴性对照2孔(100ul)，以及空白对照孔1孔(蒸馏水100ul)，37℃温育30分钟；
2、洗板：甩干板中液体，加入400ul/孔洗涤液，放置30秒甩干，如此重复洗五次；
3、除空白对照孔以外，各孔加入100ul/孔的酶标记抗体，37℃温育30分钟；
4、洗板：甩干板中液体，加入400ul/孔洗涤液，放置30秒甩干，如此重复洗五次；
5、加底物，50ul/孔TMB显色A液，50ul/孔TMB显色B液，混匀，37℃温育15分钟；
6、加50ul/孔终止液，置酶标仪中450nm波长下，测定读数。
Claims (4)
1、一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒，其特征在于它包括抗体包被反应条、酶标记抗体、阳性对照液、阴性对照液、浓缩洗涤液、底物显色A液、底物显色B液和终止液。
2、根据权利要求1所述的抗体包被反应条为48或96孔；酶标记抗体工作液1瓶3.5ml或7ml；阳性对照液1支0.5ml或1ml、阴性对照液1支0.5ml或1ml、20倍浓缩洗涤液1瓶10ml或24ml、底物显色A液1瓶3.5ml或7ml、底物显色B液1瓶3.5ml或7ml和终止液1瓶3.5ml或7ml。
3、一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)：采用基因重组的HbsAg制备HbsAb包被抗体或酶标记抗体；
(2)：采用基因重组的preS 1Ag、前S2多肽制备抗前S1、前S2包被抗体或酶标记抗体；
(3)：抗血清或腹水用硫酸铵沉淀、亲和层析柱或离子交换层析法纯化得到纯抗体；
(4)：制备预包被板：抗体做包被、加入包被液、加入反应板、4℃湿盒放置过夜、拍干、封闭、干燥、装袋；
(5)：制备酶标记物：酶标记抗体以合适的浓度加入酶标稀释液中；
(6)：将试剂盒中其余成分：阴性对照、阳性对照、底物显色A液、底物显色B液、终止液和浓缩洗涤液分装在小瓶中。
4、根据权利要求3所述的一种乙型肝炎病毒前S1与前S2联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于步骤(6)所述底物显色A液为：Na2HPO4·12H2O、柠檬酸、3％H2O2和重蒸水pH5.0；所述底物显色B液为：Na2HPO4·12H2O柠檬酸、3％H2O2、TMB(四甲基联苯胺)和重蒸水pH5.0；所述终止液为：浓H2SO4和重蒸水；所述10倍浓缩洗涤液为：Na2HPO4·12H2O、20％Tween-20和重蒸水。
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