CN107699566A - 一种受病原诱导的水稻启动子p71z4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用，属于水稻生物育种领域。本发明的目的是提供一种从水稻中克隆到的能够响应稻瘟病菌侵染，可以作为病原诱导型启动子使用的DNA序列片段，该DNA序列片段是水稻P450单加氧化酶基因CYP71Z4(NCBI登录号：Os10g0439800)的转录调控区，其特征是它具有第1位到第1948位的启动子区核苷酸序列。本发明可以作为病原诱导型启动子使用，或用于其它转基因植物的相关调控序列，培育抗病植物中的应用。

Description

一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用
技术领域
本发明涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用，属于植物基因工程技术领域。具体涉及到一个水稻病原诱导型启动子P71Z4的克隆、功能验证和应用分析。
背景技术
水稻在生长发育过程中，经常会受到各种病原(包括稻瘟病菌、白叶枯病菌、细菌条斑病菌以及水稻矮缩病毒等)的侵害。在与病原长期相互作用的过程中，水稻已经进化成多种复杂而有效的抗病机制来抵抗病原的侵染。抗病基因的克隆和应用为水稻病害的防治提供了一个经济有效和环境友好的方法。
目前，利用转基因技术把抗病基因转入感病水稻栽培品种是改良水稻病害抗性的重要途径。尽管大批的抗病基因被克隆以及应用，但是由于应用于转基因载体的启动子多数属于组成型启动子。这不仅造成了植物体的负担，使植物在不需要发生抗病反应时表达额外的蛋白，造成了浪费，而且严重地还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡，使得转基因水稻一生中需要消耗掉大量的能量。这是利用转基因技术防治水稻病害的最明显的一个缺陷。为了解决这个问题，申请者试图利用受病原菌诱导启动子调控目标抗病基因的表达。
启动子是位于结构基因上游能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体，且对基因的表达起调控作用的一段DNA序列。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box等核心作用元件。TATA框，又称Hogness框，其一致序列为：TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和C碱基对的序列组成，一般都位于-35bp附近。TATA框决定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。CAAT框，其一致序列为GGC(T)CAATCT。一般位于-75bp附近，该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可能控制着转录起始的频率。增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在-100bp以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。另外，不同的启动子上还有其他不同的顺式(cis)调控元件，它们是反式(trans)调控因子或转录调控蛋白的结合位点。不同的反式调控因子/转录调控蛋白特异性的与顺式调控元件结合，对基因的表达时间，空间或表达量进行特异性的调控。按照功能及作用方式可大致分为组成型表达启动子、组织特异性表达启动子和诱导型表达启动子三大类。正如前文所述，组成型表达启动子在转基因作物中驱使目的基因持续大量表达，浪费作物能量并带来损失，而组织特异性启动子使目的基因在某一组织中特定地表达，可以较好地解决这一方面的问题。目前，诱导型启动子是公认的有较好应用前景的启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如病原物，化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表达。因此，利用水稻来源的病原物诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗性的最佳选择之一。
发明内容
技术问题
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个来自于水稻响应病原菌侵染的启动子P71Z4。
本发明的另一目的是提供病原菌诱导型启动子的克隆和功能鉴定的方法。
本发明的又一目的是提供病原菌诱导型启动子的应用。
本发明的目的是从水稻中克隆受稻瘟病菌诱导的启动子P71Z4，并利用转基因技术进行功能验证，同时分析该基因在水稻中的组织表达模式，为利用抗性基因改良水稻病害抗性提供了技术资源。
技术方案
本发明涉及一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4，其特征在于：该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中CYP71Z4基因(NCBI登录号：Os10g0439800)转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1948bp的DNA，序列如SEQ ID NO.1显示。
该基因启动子P71Z4克隆引物如下：上游引物是GgaattcTGGAGTCAGGATGCTTTTG,加EcoR I酶切位点；下游引物是GAagatctGACACAATATGGGAGGAGC，加BglII酶切位点，扩增CYP71Z4编码区5’端上游1948bp DNA序列片段。
所述受病原诱导的水稻启动子P71Z4的应用，是指水稻启动子P71Z4通过响应稻瘟病菌侵染，从而调控目标基因表达在植物抗性育种中的应用。是指在利用转基因技术增强植物病害抗性时，水稻启动子P71Z4降低过度的抗病反应对植物自身的伤害。
有益效果
本研究所提供的水稻病原诱导启动子P71Z4的克隆及其应用，具有如下优点：
通过本发明获得了水稻病原诱导型启动子P71Z4。将克隆的启动子P71Z4与目标抗病基因共同转入水稻，可以使转基因水稻受稻瘟病菌侵染后合理诱导目标抗病基因表达。从而避免转基因水稻因始终过量表达目标基因对自身造成的损伤，这也弥补了传统组成型启动子因始终强启动目标基因表达造成生长发育受阻等一系列致命缺陷。
采用PCR(Polymerase chain reaction)技术可以从基因组中扩增得到本发明的启动子P71Z4以及任何一段DNA或与其同源的一段DNA。将克隆到的DNA片段构建携带有报告基因gus的遗传转化载体，利用农杆菌介导的遗传转化法，获得由启动子P71Z4驱动gus基因表达的转基因水稻。利用实验室人工接种方法对该转基因水稻进行稻瘟病接种，通过组织化学染色法和GUS活性检测从而鉴定启动子P71Z4响应病原侵染的能力。
本发明利用启动子分析软件预测受病原诱导的启动子P71Z4，并利用PCR技术从粳稻模式种日本晴中克隆该启动子(图1)。成功构建了病原菌诱导型启动子P71Z4/gus融合的表达载体(图1)，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法获得P71Z4/gus转基因水稻。并且证明启动子P71Z4受稻瘟病菌诱导(图2)。在P71Z4/gus转基因水稻中，主要在根、茎、叶片和谷粒中检测到GUS活性(图3)。P71Z4/gus转基因水稻受到稻瘟病菌侵染后，GUS蛋白活性显著升高，达到2倍以上(图4)，进一步说明P71Z4响应稻瘟病菌侵染。这些结果表明，该启动子P71Z4能够响应稻瘟病菌的侵染。
附图说明
图1 P71Z4启动子克隆与载体构建。
(A)启动子P71Z4序列PCR扩增电泳。1，2是用HS高保真酶PCR扩增启动子序列；M是DNA MarkerλDNA-HindIII。(B)启动子P71Z4/GUS融合表达载体构建。1，2是双酶切验证双元表达载体；M是DNA MarkerλDNA-HindIII。(C)启动子P71Z4/GUS融合表达载体构建图谱。hph编码潮霉素磷酸转移酶，是潮霉素抗性标记基因；35SP是花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；P71Z4是预测的CYP71Z4基因启动子序列；gus是编码β-葡萄糖醛酸酐酶基因；RB和LB分别是T-DNA右边界和左边界。
图2启动子P71Z4响应稻瘟病菌侵染。
S，感稻瘟病水稻R109(邵敏等,转hrf1基因水稻对稻瘟病多小种非专化的稳定抗性.中国水稻科学,2008,22(5):459-464.)；R，抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12(邵敏等,转hrf1基因水稻对稻瘟病多小种非专化的稳定抗性.中国水稻科学,2008,22(5):459-464.)；0、1、3、6和12分别代表水稻接种0、1、3、6和12小时。
图3CYP71Z4基因表达模式。(A)叶片；(B)幼苗；(C)和(D)为茎节的横切面；(E)谷粒；(F)根。
图4转P71Z4启动子水稻的GUS活性受稻瘟病菌诱导。0、1、3、6和12分别代表水稻接种稻瘟病菌后0、1、3、6和12小时。
具体实施方式
下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
(一)实验方法
1.1载体构建
首先根据抗病相关基因CYP71Z4(NCBI登录号：Os10g0439800)起始密码子上游序列，结合PLACE等多个启动子预测软件综合分析结果，利用Oligo 6引物设计软件设计该基因启动子克隆引物如下：上游引物是GgaattcTGGAGTCAGGATGCTTTTG(加EcoR I酶切位点)和下游引物是GAagatctGACACAATATGGGAGGAGC(加BglII酶切位点)，用HS高保真酶从粳稻品种日本晴基因组中扩增CYP71Z4编码区5’端上游约1948bp DNA序列。扩增条件：95℃预变性4min；95℃变性40s、58℃复性45s、72℃延伸45s，32个循环；最后72℃延伸10min。凝胶电泳显示在2000bp处有特征条带(图1A)。用PCR产物试剂盒纯化DNA后，用EcoR1和BglII分别双酶切纯化的启动子PCR产物DNA、pCAMBIA1301双元表达载体质粒，随后进行凝胶电泳，进一步分别切胶回收启动子DNA、pCAMBIA1301(Hailiang Mao etal.,Linking differentialdomain functions of the GS3protein to natural variation of grain size inrice.Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(45):19579-19584.)大片段DNA，T4连接酶过夜连接pCAMBIA1301后，转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取单克隆接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养后，对提取的质粒用EcoR1和BglII双酶切验证，凝胶电泳结果显示在2000bp处具有特征条带(图1B)。随后送2ml菌液到上海英俊生物技术有限公司测序，结果显示没有碱基错配，此时已成功构建由CYP71Z4启动子片段驱动gus基因表达的双元表达载体pCAMBIA1301/P71Z4(图1C)。
1.2质粒转化
1.2.1质粒转化大肠杆菌
(1)大肠杆菌DH5α在LB平板上划线(Shao M,Wang J,Dean RA,Lin Y,Gao X,Hu S.
Expression of a harpin-encoding gene in rice confers durablenonspecific resistance to Magnaporthe grisea.Plant Biotechnol J,2008,6(1):73-81)，37℃活化培养；挑取一个单菌落接种到20ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；
(2)按1％的接种量，吸取0.5ml将过夜培养的母液接种到50ml LB液体培养基，于37℃剧烈振荡培养2-3h；
(3)在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌50ml离心管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；(后面的5-9步骤必须在冰浴条件下完成。)
(4)离心收集菌体细胞(4,000r/min，4℃，10min)。倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。
(5)用5ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重新悬浮菌体沉淀，放置于冰上10min。
(6)离心收集菌体(4,000r/min，4℃，10min)。到出CaCl2，将管倒置1min以使残留的CaCl2流尽。
(7)用1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体。此时，将悬浮液用eppendorf管分装成小份，每管200μl；
(8)用无菌吸头在每管中加DNA(体积≤10μl，DNA≤50ng)，轻轻旋转或轻弹管壁以混匀内容物，在冰中放置30min；
(9)将管放到42℃水浴中热激90s，不要摇动试管；
(10)快速将试管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(11)每管中加入800μl LB液体培养基后，放到37℃摇床振荡培养45min；
(12)吸取100μl液体加到含卡那霉素(20μg/ml)的LB固体平板上，用L玻棒轻轻地把细胞均匀地涂到琼脂平板表面；
(13)将平板置于室温至液体被吸收；
(14)倒置培养皿于37℃培养12-16h，待单菌落长出后提取质粒酶切验证。
1.2.2质粒转化农杆菌
(1)受体菌EHA105(Shao M,Wang J,Dean RA,Lin Y,Gao X,Hu S.Expression ofa harpin-encoding gene in rice confers durable nonspecific resistance toMagnaporthe grisea.Plant Biotechnol J,2008,6(1):73-81)在YEB平板上划线，28℃活化培养；
(2)挑取一个单菌落接种到2ml的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；
(3)在200ml的YEB培养基中稀释，28℃振荡培养3-4h。
(4)在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌50ml离心管中，3000rpm 4℃离心10min，去上清。
(5)用10ml预冷的TE(pH7.5)洗涤。
(6)3000rpm 4℃离心10min，去上清。
(7)用20ml YEB重悬。
(8)按每管500μl分装，液氮中冷冻，即为感受态细胞。
(9)将感受态细胞置于冰浴中，加入0.5-1.0μg重组质粒DNA，冰上放置5min。
(10)置液氮中5min。37℃保温5min。
(11)用1ml YEB稀释，在28℃震摇2-4h。
(12)取200μl涂布于含有卡那霉素50mg/L+利福平50mg/L的YEB平板上，28℃培养过夜，待单菌落长出后提取质粒验证。
1.3水稻成熟胚愈伤组织的诱导和继代
(1)将表面灭菌的含胚米粒接种到N6D2培养基上，28℃生化培箱培养2周左右，诱导愈伤组织产生；
(2)将新长出的愈伤组织从种子上剥下，转入新的N6D2培养基上，继代培养。每两周继代一次，共继代2次，取新鲜嫩黄的愈伤组织用于农杆菌侵染。
1.4愈伤组织与农杆菌的共培养
(1)将愈伤组织浸入重悬的农杆菌菌液中，摇匀后静置30min；
(2)移出愈伤，用灭菌滤纸吸净残液，平铺到盛有无菌滤纸的N6D2固体培养基表面，用2-3ml N6D2-AS培养液润湿愈伤，23℃生化培养箱暗培养3d。
1.5愈伤组织分化、生根
(1)挑选1-2mm生长良好、结构致密的抗性愈伤组织，转至MS1-CG培养基上在智能光照培养箱26℃，光强30000lux，预分化2周。
(2)转至分化培养基MS 2-CG上培养,在智能光照培养箱26℃，光强30000lux，分化。每2周继代一次，直至得到抗性植株。
(3)部分矮小丛生小苗转至MS0G培养基上使其生长数天,分化苗长大一点才能继续生根。
(4)分化好的幼苗转至生根培养基1/2MSNG上。筛选、生根直至长成完整植株。
(5)将生长完整的水稻植株移入灭菌土中，在智能光照培养箱26℃，光强30000lux，光照14h，黑暗10h培养或移入温室中培养生长。
1.6GUS组织化学染色
(1)取2支1.5ml离心管，各加入0.5ml 1mol/L GUS染色液；
(2)采取适量大小的转P71Z4启动子水稻组织，分别放入上述离心管中；
(3)37℃浸泡过夜(或2-5h)；
(4)倒掉染色液，加入75％乙醇脱色；换一次75％乙醇脱色；
(5)观察染色情况，拍照。如果有GUS表达产物，则出现蓝色出现蓝色。
GUS染色液配置：在450ml ddH2O中加入82mg铁氰化钾，105.6mg亚铁氰化钾，50ml1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)，加水至500ml，4℃储存备用。
1mol/L GUS染色液：用DMSO溶解100mg X-Gluc，再加入GUS工作液，定容100ml，分装成小管，置于-20℃储存备用。
1.7稻瘟病菌接种
水稻接种用稻瘟病菌株孢子的混合液(ZB13、ZC3、ZD1、ZE3、ZF1和ZG1)，配成10×10倍显微镜下每视野30-40个孢子的悬浮液。在水稻孕穗初期注射接种，每穗注射1mL(李文奇等,水稻P450基因Oscyp71Z2增强稻瘟病抗性的机制.中国农业科学,2014,47(13):2485-2493)。接种材料：感稻瘟病水稻R109(邵敏等,转hrf1基因水稻对稻瘟病多小种非专化的稳定抗性.中国水稻科学,2008,22(5):459-464.)；抗稻瘟病转hrf1水稻NJH12(邵敏等,转hrf1基因水稻对稻瘟病多小种非专化的稳定抗性.中国水稻科学,2008,22(5):459-464.)。
(二)结果显示
利用启动子分析软件预测受病原诱导的启动子P71Z4，并利用PCR技术从粳稻模式种日本晴中克隆该启动子(图1)。成功构建了病原菌诱导型启动子P71Z4/gus融合的表达载体(图1)，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法获得P71Z4/gus转基因水稻。并且证明启动子P71Z4受稻瘟病菌诱导(图2)。在P71Z4/gus转基因水稻中，主要在根、茎、叶片和谷粒中检测到GUS活性(图3)。P71Z4/gus转基因水稻受到稻瘟病菌侵染后，GUS蛋白活性显著升高，达到2倍以上(图4)，进一步说明P71Z4响应稻瘟病菌侵染。这些结果表明，该启动子P71Z4能够响应稻瘟病菌的侵染。
附录
1、LB培养基(培养大肠杆菌)
LB液体培养基成份：称取胰蛋白胨10g；氯化钠10g；酵母粉5g；加水500ml；加热溶解后定容至1000ml，调pH值至7.0-7.2，每瓶50ml分装后高压灭菌。LB固体培养基(LA)为每1000ml液体培养基中加入15g琼脂，加相应抗生素(氨苄霉素和潮霉素)后倒入平板备用。
2、YEB培养基(培养农杆菌)
液体培养基成份：称取牛肉浸膏5g；蔗糖5g；聚蛋白胨5g；硫酸镁2mmol/L；酵母粉1g；加入500ml水，加热溶解后定容至1000ml，调pH值至7.2，分装后高压灭菌。配制YEB固体培养基时每1000ml液体培养基中加入15g琼脂，加相应抗生素后倒入平板。
3、转基因用到的培养基配方
所涉及到的培养基：
N6培养基成份：
每升培养基加蔗糖30g，琼脂15g，pH 5.8。用于共培养的培养基pH 5.2。
MS培养基成份：
每升培养基加肌醇100mg，蔗糖30g，琼脂15g，pH 5.8。
4、P71Z4启动子DNA序列(SEQ ID NO.1)
tggagtcaggatgcttttgggggtgctgctggggtcaggagtagtgctgtaagactcagggtaggatcgtttgtgccctgaagagggttaactttgccaaacaatccgggaagcaacacgaaaccccgggcagaactggtaggaaggaaaaggatgtgatcagagaaatattgctctgaagaagagacaaaaatcaaggctgagggtctgggagtgacagatgggatgcgtcctccagacaatcattgaagaccacgaccctgggatcggagcaaagacgctcaccgagctaggacctagaagcctccaggtggcgctgcggagccggacagccgtgcgtctccactccccattaacccgggagggtggaggcctcaggaaatgtgtgcatttatgcagtagcaggagtgcaaacctcatacattgagggagaaaggcagcgggagacggccacgagattcccccatctctttgaatataattttagattgagattcagattaaatccgaggggaaaacactttatgaggctgaaagctgtgtcgttgccagagacagggttatgagctatcaaatgcaattacattaagacagattatactgggcaaattgagccatttagaaggtgagaatcaaagaaacggctctgatcctcttttcccccttctctctccctctccctctctctctaaattgcagttcgtagttccttccaattcggaggcacaaaagtaggtgagactgcttttgtatctgcgaagtgcttcactcctgaatgtaattctagctgagtgcaatctaggttaagagccggacaagcgggtaattagagcccgctagctgcccgaggaccggccgccccgccaaagcgcgccccgagtcggcgcccttctcccggccgagcctagctgcggctggacacggagcgcccgagatgatggtgctggacaaggaggacggtaggtggcgggccggggtctcgacgcccctcaccccctcgccccccgccgcggcgcgcaggcacacacacgcggggacacgggcgcacacctgctgggctgtgcggggattgcggggcgggcggcgcgctgggggccggggctggggcggggggaagtaccgggggacagccgggcggaacttgcggggggaggaggtcgagccccgggctgcacgcgcccggggccgcacgccccccgggtcccggccgcgagccgaggagctgtgcactggccgtgtgctgcgccgcggggccgcgcggaggctggggctcccttgcgatctccgcgccgcggaggttcgctctgagcatttcgtgtctgaggctgctgctctcaccgcagccatcaccctcgcgccagccgccgcgtaacccgagaggcgctgagcgccgagcaaatcagcggcttcggggagaatcgggctccagagctcggggcaagcgggagcgcgggaggacggcgcgagcgccagggtgcccggcaggcgaggggaaggcgggttggaccctccgggggacatctgcatgagcgtgactcggtgagaaagagagccgcctcttgtgccggcccgctagctccctgtctctctgagcgcggaggcgggagtttggcccagaggaagaaagtgtcccgccgccggccggtagcacttgtgcgggagcggcctgcgagagtggcacggaccttccgtggtcgagcctcagtgcgccctagaaaactgcagggcacgggaaaggtcggaacagaggagcccatggctgctggaagccactagcaggtggtcccatagaccccaaagccttactggcagggagtgccctgcagttaagtgtcctagaaggctggggatcgtcgagctctatttaggtgacactatagaaccaggcaagcaacttcaagcaagtgtagaagtctaaatcaacttcaagctcctcccatattgtgtc
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1948
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1948)
<400> 1
tggagtcagg atgcttttgg gggtgctgct ggggtcagga gtagtgctgt aagactcagg 60
gtaggatcgt ttgtgccctg aagagggtta actttgccaa acaatccggg aagcaacacg 120
aaaccccggg cagaactggt aggaaggaaa aggatgtgat cagagaaata ttgctctgaa 180
gaagagacaa aaatcaaggc tgagggtctg ggagtgacag atgggatgcg tcctccagac 240
aatcattgaa gaccacgacc ctgggatcgg agcaaagacg ctcaccgagc taggacctag 300
aagcctccag gtggcgctgc ggagccggac agccgtgcgt ctccactccc cattaacccg 360
ggagggtgga ggcctcagga aatgtgtgca tttatgcagt agcaggagtg caaacctcat 420
acattgaggg agaaaggcag cgggagacgg ccacgagatt cccccatctc tttgaatata 480
attttagatt gagattcaga ttaaatccga ggggaaaaca ctttatgagg ctgaaagctg 540
tgtcgttgcc agagacaggg ttatgagcta tcaaatgcaa ttacattaag acagattata 600
ctgggcaaat tgagccattt agaaggtgag aatcaaagaa acggctctga tcctcttttc 660
ccccttctct ctccctctcc ctctctctct aaattgcagt tcgtagttcc ttccaattcg 720
gaggcacaaa agtaggtgag actgcttttg tatctgcgaa gtgcttcact cctgaatgta 780
attctagctg agtgcaatct aggttaagag ccggacaagc gggtaattag agcccgctag 840
ctgcccgagg accggccgcc ccgccaaagc gcgccccgag tcggcgccct tctcccggcc 900
gagcctagct gcggctggac acggagcgcc cgagatgatg gtgctggaca aggaggacgg 960
taggtggcgg gccggggtct cgacgcccct caccccctcg ccccccgccg cggcgcgcag 1020
gcacacacac gcggggacac gggcgcacac ctgctgggct gtgcggggat tgcggggcgg 1080
gcggcgcgct gggggccggg gctggggcgg ggggaagtac cgggggacag ccgggcggaa 1140
cttgcggggg gaggaggtcg agccccgggc tgcacgcgcc cggggccgca cgccccccgg 1200
gtcccggccg cgagccgagg agctgtgcac tggccgtgtg ctgcgccgcg gggccgcgcg 1260
gaggctgggg ctcccttgcg atctccgcgc cgcggaggtt cgctctgagc atttcgtgtc 1320
tgaggctgct gctctcaccg cagccatcac cctcgcgcca gccgccgcgt aacccgagag 1380
gcgctgagcg ccgagcaaat cagcggcttc ggggagaatc gggctccaga gctcggggca 1440
agcgggagcg cgggaggacg gcgcgagcgc cagggtgccc ggcaggcgag gggaaggcgg 1500
gttggaccct ccgggggaca tctgcatgag cgtgactcgg tgagaaagag agccgcctct 1560
tgtgccggcc cgctagctcc ctgtctctct gagcgcggag gcgggagttt ggcccagagg 1620
aagaaagtgt cccgccgccg gccggtagca cttgtgcggg agcggcctgc gagagtggca 1680
cggaccttcc gtggtcgagc ctcagtgcgc cctagaaaac tgcagggcac gggaaaggtc 1740
ggaacagagg agcccatggc tgctggaagc cactagcagg tggtcccata gaccccaaag 1800
ccttactggc agggagtgcc ctgcagttaa gtgtcctaga aggctgggga tcgtcgagct 1860
ctatttaggt gacactatag aaccaggcaa gcaacttcaa gcaagtgtag aagtctaaat 1920
caacttcaag ctcctcccat attgtgtc 1948
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(26)
<400> 2
ggaattctgg agtcaggatg cttttg 26
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 5’UTR
<222> (1)..(27)
<400> 3
gaagatctga cacaatatgg gaggagc 27

Claims (5)

1.一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4，其特征在于：该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中CYP71Z4基因转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1948bp的DNA，序列如SEQIDNO.1显示。
2.根据权利要求1所述一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4，其特征在于：该基因启动子P71Z4克隆引物如下：上游引物是GgaattcTGGAGTCAGGATGCTTTTG，加EcoRI酶切位点；下游引物是GAagatctGACACAATATGGGAGGAGC,加BglⅡ酶切位点，扩增CYP71Z4编码区5’端上游1948bpDNA序列片段。
3.权利要求1或2所述一种受病原诱导的水稻启动子P71Z4的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是指水稻启动子P71Z4通过响应稻瘟病菌侵染，从而调控目标基因表达在植物抗性育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是指在利用转基因技术增强植物病害抗性时，水稻启动子P71Z4降低过度的抗病反应对植物自身的伤害。
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