CN107693597A - 一种抗心肌缺血的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗心肌缺血的中药组合物及其制备方法和用途，所述抗心肌缺血的中药组合物，由地锦草：仙鹤草：分心木按重量比(1‑3)：(1‑6)：(1‑3)制成。本发明中药组合物选用天然植物药为原料，简单、易得，制备方法简单，稳定可行。所制备的总黄酮提取物对心肌缺血有明显的保护作用，对人体无毒无害，符合国家政策法规。

Description

一种抗心肌缺血的中药组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种抗心肌缺血的中药组合物及其制备方法和应用，属于中药制药领域。
背景技术
心肌缺血是多病因的复杂性疾病，是由于心脏的供血和供氧减少，从而引起心肌能量代谢异常，心脏不能正常工作的一种病理状态，作为多种心脏疾病的初始阶段，其所诱导的心肌梗死、心绞痛、心率失常等多种心脏疾病严重威胁着人类的身体健康和生活质量。心肌缺血的发病机制较为复杂，活性氧、钙超载、炎症反应、细胞凋亡等多种生物活性分子及细胞内信号转导通路均有参与。对心肌缺血的治疗，目前多采用以单靶点开发的西药如硝酸酯类、钙离子阻断剂、β受体阻断剂等，因其局限于某一方面而疗效欠佳，中药的特色在于其能发挥多靶点、多环节、多层次的药理作用，对于治疗心肌缺血等有复杂病因的疾病具有潜在的优势，因此，从中医药中寻找和开发用于有效预防和治疗心肌缺血的药物不失为一条有效途径。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供一种抗心肌缺血的中药组合物及其制备方法和应用，本发明中药组合物所用原料药简单、易得，制备方法简单，稳定可行，所制备的总黄酮提取物对心肌缺血有明显的保护作用，在抗心肌缺血的过程中，可发挥中药复方的配伍优势，提高疗效，此外，本发明发掘祖国传统医药学宝库，选用纯中药，在中医基础理论指导下组方运用，结合现代先进工艺制法制备提取物，该提取物可达到抗心肌缺血的药效。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗心肌缺血的中药组合物，由地锦草：仙鹤草：分心木按重量比(1-3)：(1-6)：(1-3)制成。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述的中药组合物由地锦草：仙鹤草：分心木按重量比1：2：1制成。
本发明还提供一种抗心肌缺血的中药组合物的制备方法，包括：
1)按重量比(1-3)：(1-6)：(1-3)称取锦草、仙鹤草和分心木，混合均匀，得中药混合物；
2)取1)得到的中药混合物，采用乙醇回流提取法提取，将提取液过滤，合并，滤液经减压浓缩至无醇味，加水稀释，静置后离心0.5-5min，上清液即为总黄酮提取液；
3)将2)得到的总黄酮提取液上样于大孔吸附树脂柱，加水洗脱水溶性杂质，再加乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩到稠膏状态后低温干燥，即得总黄酮提取物。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，在2)中，所述乙醇回流提取时各因素取值为乙醇体积分数40％-70％，液料比10-20mL·g-1，回流提取1-3次，每次60-150min，提取温度85-100℃，提取液过滤合并，滤液经减压浓缩至0.25-1g·mL-1；
所述加水稀释中所用水量为浓缩后滤液重量的0.5-1倍，所述离心转速为2000-4000r·min-1。
优选的，所述乙醇回流提取时各因素取值为乙醇体积分数55％，液料比17mL·g-1，回流提取2次，每次146min，提取液过滤合并，滤液经减压浓缩至0.5g·mL-1；所述离心转速为3000r·min-1。
进一步，在3)中，所述大孔吸附树脂柱采用AB-8、D101、HPD100或HPD300型大孔树脂，总黄酮提取液上样于径高比为1：4-1：10的上述大孔吸附树脂柱，上样液质量浓度为0.25-1g·mL-1，上样流速为1-3BV·h-1，上样量为1-3BV，吸附0-6h，加水0.5-3BV洗脱水溶性杂质，再加体积分数30％-95％乙醇1-4BV洗脱，洗脱流速为1-4BV·h-1。
优选的，所述大孔吸附树脂柱采用AB-8型大孔树脂，总黄酮提取液上样于径高比为1：6的AB-8型大孔吸附树脂柱，上样液质量浓度为0.5g·mL-1，上样流速为2BV·h-1，上样量为2BV，吸附4h，加水1.5BV洗脱水溶性杂质，再加体积分数50％乙醇3BV洗脱，洗脱流速为2BV·h-1。
本发明还提供一种如上所述的抗心肌缺血的中药组合物在制备抗心肌缺血的药物或保健品中的应用。
本发明还提供一种抗心肌缺血的药物或保健品，取上述抗心肌缺血的中药组合物，加入一种或多种食品学或药学上可接受的辅料，按常规工艺制成饮料、汤剂、丸剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、注射剂、胶囊剂、散剂、膏剂、口服液、颗粒剂或片剂。
本发明还提供一种抗心肌缺血的药物或保健品，取上述制备方法制备得到的总黄酮提取物，加入一种或多种食品学或药学上可接受的辅料，按常规工艺制成饮料、汤剂、丸剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、注射剂、胶囊剂、散剂、膏剂、口服液、颗粒剂或片剂。
本发明的有益效果是：
本发明中药组合物所用原料药简单、易得，制备方法简单，稳定可行，所制备的总黄酮提取物对心肌缺血有明显的保护作用，在抗心肌缺血的过程中，可发挥中药复方的配伍优势，提高疗效，此外，本发明发掘祖国传统医药学宝库，选用纯中药，在中医基础理论指导下组方运用，结合现代先进工艺制法制备提取物，该提取物可达到抗心肌缺血的药效。
附图说明
图1为本发明总黄酮提取量与乙醇体积分数的分析示意图；
图2为本发明总黄酮提取量与液料比的分析示意图；
图3为本发明总黄酮提取量与回流次数的分析示意图；
图4为本发明总黄酮提取量与回流时间的分析示意图；
图5为本发明AB-8型大孔吸附树脂静态吸附平衡曲线示意图；
图6为本发明静态吸附下总黄酮吸附量与上样液质量浓度的对比分析图；
图7为本发明动态吸附下总黄酮吸附量与上样液质量浓度的对比分析图；
图8为本发明总黄酮吸附量及总黄酮回收率与吸附流速的对比分析图；
图9为本发明泄漏曲线示意图；
图10为本发明总黄酮量及固形物重量与水洗体积的分析示意图；
图11为本发明解析量及解析固形物总黄酮含量与乙醇体积分数的分析示意图；
图12为本发明总黄酮解析量与洗脱流速的分析示意图；
图13为本发明总黄酮解析量与洗脱溶剂用量的分析示意图；
图14为本发明总黄酮回收率与树脂柱径高比的分析示意图；
图15为本发明总黄酮提取物对心肌缺血小鼠耐缺氧能力的影响分析示意图；
图16为本发明总黄酮提取物对心肌缺血小鼠血清SOD、LDH的影响分析示意图；
图17为本发明总黄酮提取物对心肌缺血小鼠血清MDA及心脏指数的影响分析示意图；
图18为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠心电图ST段的影响分析示意图；
图19为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠造模前、最后一次造模24h后心电图的影响分析示意图；
图20为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清SOD、LDH的影响分析示意图；
图21为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清MDA、GSH-Px的影响分析示意图；
图22为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB的影响分析示意图；
图23为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清cTnI、IL-6的影响分析示意图；
图24为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清AST、ALT的影响分析示意图；
图25为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清NO和TNF-α的影响分析示意图；
图26A-图26F为本发明总黄酮提取物对心肌缺血大鼠心肌组织病理学的影响分析示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种抗心肌缺血的中药组合物的制备方法，包括：
1)按重量比1：2：1称取锦草、仙鹤草和分心木，混合均匀，得中药混合物；
2)取1)得到的中药混合物，采用体积分数55％乙醇回流提取法提取，液料比17mL·g-1，回流提取2次，每次146min，提取温度85-100℃，将提取液过滤，合并，滤液经减压浓缩至0.5g·mL-1，加水稀释，所述加水稀释中所用水量为浓缩后滤液重量的0.5-1倍，静置后3000r·min-1离心0.5-5min，上清液即为总黄酮提取液；
3)将2)得到的总黄酮提取液上样于径高比为1：6的AB-8型大孔吸附树脂柱，上样液质量浓度为0.5g·mL-1，上样流速为2BV·h-1，上样量为2BV，吸附4h，加水1.5BV洗脱水溶性杂质，再加体积分数50％乙醇3BV洗脱，洗脱流速为2BV·h-1，收集乙醇洗脱液，减压浓缩到稠膏状态后低温干燥，即得总黄酮提取物。
筛选实验例
本发明具体实施方式采用回流提取技术，该方式提取的总黄酮较超声提取法高，通过响应面法优化复方总黄酮乙醇回流提取工艺，其中单因素试验考察如下：
(1)乙醇体积分数：准确称取复方(地锦草10.0g、仙鹤草20.0g、分心木10.0g)6份，再根据组方药材的质地以及所提取目标成分的性质，本组方药材质地酥松，提取液加太少不足以没过药材，且所提取目标成分为黄酮类，包含黄酮苷元和黄酮苷类成分，用极性较大的水不足以全部提取，且提取时间过长会对成分造成破坏。因此选取固定液料比为10mL·g-1，提取时间为1h，分别用体积分数为40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇回流提取，制备供试品液，计算总黄酮提取量，由图1可知，总黄酮提取量先随乙醇体积分数的增大而升高，于50％时达最大值，之后随乙醇体积分数的增高反而降低。
(2)液料比：准确称取复方(地锦草10.0g、仙鹤草20.0g、分心木10.0g)7份，分别加8、10、12、14、16、18、20倍量(单位是mL·g-1)的50％乙醇回流提取1h，计算总黄酮提取量，由图2可知，总黄酮提取量随料液比的增加而先增加后减小，当料液比为16mL·g-1时达最大值。
(3)回流次数：准确称取复方(地锦草10.0g、仙鹤草20.0g、分心木10.0g)4份，加16倍量的50％乙醇分别回流提取1、2、3、4次，每次1h，计算总黄酮提取量，由图3可知，总黄酮提取量在提取次数大于2次后变化较小，本着节能的原则，回流次数定为2次。
(4)回流时间：准确称取复方(地锦草10.0g、仙鹤草20.0g、分心木10.0g)7份，加16倍量的50％乙醇回流提取30、60、90、120、150、180、210min，各回流2次，合并2次提取液，计算总黄酮提取量，由图4可知总黄酮提取量随回流时间的增加而先增加后减小，当回流时间为150min时达最大值。
在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数(A)、料液比(B)、回流时间(C)为自变量，固定提取次数为2次，以总黄酮提取量为响应值，进行响应面优化组合设计3因素3水平试验，因素水平选择见表1，试验安排及结果见表2。
表1因素水平
表2试验安排及结果
对响应面试验结果进行多元回归分析，以总黄酮提取量为响应值(Y)，获得自变量为乙醇体积分数、液料比、回流时间二次多元回归方程：Y＝74.51+1.27A+0.93B-0.084C+1.25AB-0.61AC-0.86BC-1.94A2-2.23B2-2.50C2，结果见表3，可知，该模型P＝0.0015＜0.01，表示响应面回归模型达极显著水平，说明建立的模型可靠，失拟项不显著(P＝0.9955大于0.05)，回归方程复相关系数R2＝0.9414，说明该模型拟合程度较好，模型的修正复相关系数R2 adj＝0.8660，表明该方程较好地反映了各自变量与因变量的关系，提示该模型对复方总黄酮提取物提取工艺的分析和预测良好。
表3响应面试验结果分析
注：**表示差异高度显著(P＜0.01)，*表示差异显著(P＜0.05)
显著性分析可知，一次项A和二次项A2，B2，C2的回归系数均达到高度显著水平，一次项B和交互项AB回归系数达显著水平，其他回归系数均未达显著水平，在所选试验范围内，由F可判断3个因素对提取工艺的影响顺序为A＞B＞C，因素A影响最显著，表现为曲面最陡峭，响应值变化较大，三个因素影响大小顺序为：乙醇体积分数＞液料比＞回流时间。因此结合实际操作条件，在验证试验中，提取工艺的各因素取值为乙醇体积分数55％，液料比17mL·g-1，回流提取2次，每次146min，实际总黄酮平均提取量为74.42mg·g-1(n＝3，RSD＝1.19％)，与预测值误差为0.75％<2.0％，说明实验优化得到的工艺可靠。
本具体实施方式采用吸附量与解吸率最高的AB-8大孔树脂，对AB-8型大孔吸附树脂静态吸附平衡曲线的测定，将预处理好的AB-8型大孔树脂用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后，精密称取8g至100mL具塞锥形瓶中，加入总黄酮质量浓度为28.66mg·mL-1的复方总黄酮提取液40mL(由实施例1制备的总黄酮提取物加水配置而成)，置30℃恒温摇床中振摇，分别于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、24h精密吸取0.5mL于25mL容量瓶中，测定吸光度A，计算树脂对总黄酮的吸附率，以吸附率对时间作图，绘制AB-8型大孔树脂对复方总黄酮的静态吸附平衡曲线，结果显色，AB-8大孔树脂对复方总黄酮的吸附率在0-4h间变化较大，吸附4h后吸附率基本不再变化，表明AB-8大孔树脂对复方总黄酮的吸附速率较快，静置4h便可达到平衡，见图5。
对上样液质量浓度的确定，从静态吸附、动态吸附两方面考察上样液质量浓度对树脂吸附率的影响：
(1)静态吸附考察上样液质量浓度对树脂吸附率的影响
将预处理好的AB-8型大孔树脂用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后，精密称取5份4g至100mL具塞锥形瓶中，分别加入0.125、0.25、0.5、0.75、1g·mL-1的复方总黄酮提取液80、40、20、13.3、10mL(由实施例1制备的总黄酮提取物加水配置而成)，置30℃恒温摇床中振摇4h，精密吸取1mL于25mL容量瓶中，测定吸光度A，计算树脂对总黄酮的吸附量，结果见表4、图6。
表4静态吸附树脂对总黄酮的吸附量
(2)动态吸附考察上样液质量浓度对树脂吸附率的影响
分别取0.125、0.25、0.5、0.75、1g·mL-1的复方总黄酮提取液320、160、80、53.3、40mL(由实施例1制备的总黄酮提取物加水配置而成)，分别以1BV·h-1上样于预处理好的装有20mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1：4)，收集流出液，吸附4h后分别以3BV蒸馏水洗脱，合并上述流出液，测定吸光度A，计算各大孔树脂柱吸附量，结果见表5、图7。
表5动态吸附树脂对总黄酮的吸附量
综上，无论静态吸附还是动态吸附试验均表明，AB-8大孔树脂对复方总黄酮的吸附量随浓度的增加而增加，达到一定值后再随浓度增加而减小，当质量浓度为0.5g·mL-1时的吸附量最大，因此选择0.5g·mL-1作为上样浓度。
对上样液吸附流速的确定，精密量取0.5g·mL-1的复方总黄酮提取液40mL，分别以1、2、3、4、5BV·h-1上样于预处理好的装有20mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1：4)，收集流出液，吸附4h后分别以3BV蒸馏水洗脱，合并上述流出液，测定吸光度A，计算各大孔树脂柱吸附量；而后再用120mL70％乙醇，收集洗脱液，测定总黄酮解析量，计算总黄酮回收率(回收率(％)＝解析量(mg)/上样液总黄酮量(mg)×100％)，结果见表6、图8。
上述树脂柱的预处理过程为装好柱子后需用95％乙醇低流速(1BV/h)洗脱至流出液加同样体积水不浑浊为止，目的是洗脱破碎的、生产中未除去的低聚物等，之后水洗至无醇味。
表6吸附流速对树脂吸附性能的影响
可以看出，当吸附流速为1BV·h-1和2BV·h-1时，总黄酮的吸附量、解析量及回收率差别不大，当流速过大，被吸附成分可能来不及扩散到树脂的内表面而使吸附不及，导致提早泄漏，因而当吸附流速达到3BV·h-1时，总黄酮的吸附量、解析量及回收率均有明显的下降，但流速过慢将降低生产效率，从有利于大规模生产的方面来考虑，选取2BV·h-1为最佳吸附流速。
对上样量的确定：取0.5g·mL-1的复方总黄酮提取液以2BV·h-1上样于预处理好的装有20mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1：4)，收集流出液，每10mL收集一管，测定吸光度A，以吸光度为纵坐标，泄漏体积为横坐标，绘制泄漏曲线，结果见图9，当上样量为10mL时，未有总黄酮泄漏，10-40mL时有少量泄漏，当上样量大于40mL时，有明显泄漏，因此确定40mL(2BV)作为最大上样量，相当于以湿树脂计算，每1mL AB-8型树脂可以吸附1.0g药材。
对水洗体积的确定：精密量取0.5g·mL-1的复方总黄酮提取液40mL，以2BV·h-1上样于预处理好的装有20mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1：4)，吸附4h后以足量蒸馏水洗脱，每10mL收集一次流出液，测定吸光度A，测定洗脱液中总黄酮含量及固形物重量，结果见图10，结果表明，当水洗体积≥30mL(1.5BV)时，流出液已变澄清，水溶性杂质已基本除去，由于洗脱过程中一直伴随着总黄酮的泄漏，为减少总黄酮的损失，确定水洗用量为1.5BV。
对洗脱溶剂的确定：精密量取6份0.5g·mL-1的复方总黄酮提取液40mL，以2BV·h-1的速度分别上样于预处理好的装有20mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1：4)，吸附4h后分别以1.5BV蒸馏水洗脱，而后分别用4BV 30％、50％、60％、70％、80％、90％乙醇以2BV·h-1的速度洗脱，收集洗脱液，测定吸光度A，计算总黄酮解析量，洗脱液减压浓缩，低温干燥后称重，计算不同洗脱溶剂所得固形物总黄酮含量，结果见表7、图11。
表7不同洗脱溶剂对应的固形物总黄酮含量
结果显示，乙醇体积分数≥50％时总黄酮的洗脱量较高，但体积分数过大，一些脂溶性杂质也被洗脱下来，导致总黄酮含量下降，综合考虑，应选50％乙醇为洗脱溶剂。
对洗脱流速的确定：精密量取5份0.5g·mL-1的复方总黄酮提取液40mL，以2BV·h-1的速度分别上样于预处理好的装有20mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1：4)，吸附4h后分别以1.5BV蒸馏水洗脱，而后用4BV 50％乙醇分别以1、2、3、4、5BV·h-1的速度洗脱，收集洗脱液，测定吸光度A，计算总黄酮解析量，结果见表8、图12。
表8洗脱流速对总黄酮解析量的影响
洗脱流速(BV·h-1) 解析量(mg)
1 952.18
2 946.36
3 880.36
4 750.68
5 702.54
实验结果表明，洗脱流速低洗脱的比较完全但比较耗时，洗脱流速高又洗脱不完全，考虑到经济、时间因素，50％乙醇的洗脱流速为2BV·h-1较为合适，故确定最佳洗脱流速为2BV·h-1。
对洗脱溶剂用量的确定：精密量取0.5g·mL-1的复方总黄酮提取液40mL，以2BV·h-1的速度分别上样于预处理好的装有20mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1：4)，吸附4h后分别以1.5BV蒸馏水洗脱，而后用70％乙醇以2BV·h-1的速度洗脱，每10mL收集一次，测定吸光度A，计算总黄酮解析量，结果见图13。结果表明，当50％乙醇洗脱体积为60mL(3BV)时，树脂上总黄酮已基本洗脱完全，故确定洗脱溶剂用量为3BV。
对树脂柱径高比的确定：精密量取0.5g·mL-1的总黄酮提取液40、60、80、100mL，以2BV·h-1的速度分别上样于预处理好的径高比分别为1:4(20mL)、1:6(30mL)、1:8(40mL)、1:10(50mL)AB-8树脂柱，吸附4h后，分别以1.5BV蒸馏水洗脱，而后分别用3BV 50％乙醇以2BV·h-1的速度洗脱，收集洗脱液，测定吸光度A，计算总黄酮回收率，结果见表9，图14。
表9树脂柱径高比对总黄酮回收率的影响
实验结果表明，当树脂柱径高比为1:6时总黄酮的回收率最高，因此树脂柱径高比定为1:6。
通过以上实验，最终确定复方总黄酮的最佳纯化工艺为：大孔吸附树脂类型为AB-8型，树脂柱径高比定为1:6，上样液质量浓度为0.5g·mL-1，上样体积为2BV，上样流速为2BV·h-1，吸附4h，水洗体积为1.5BV，洗脱溶剂为50％乙醇，洗脱流速为2BV·h-1，洗脱体积为3BV。
精密量取3份0.5g·mL-1的复方总黄酮提取液200mL，按上述条件分别上样于预处理好的装有100mL AB-8大孔树脂的树脂柱(径高比1:6)，吸附完成后洗脱，收集洗脱液，测定吸光度A，计算总黄酮解析量及回收率，洗脱液减压浓缩，低温干燥后称重，计算固形物中总黄酮含量，结果显示，本实验所确定纯化工艺具有良好的重复性，按优选的工艺条件进行纯化，总黄酮的回收率大于80％，且所得复方总黄酮提取物平均含量为85.54％，表明该工艺稳定可行。
本具体实施方式采用回流提取技术，以总黄酮提取量为指标，在单因素试验基础上，利用响应面试验设计考察乙醇体积分数、液料比、回流时间3个因素对总黄酮提取量的影响，确定了复方总黄酮提取物提取工艺为复方加17倍量55％乙醇回流提取2次，每次146min；通过静态吸附/解吸与动态吸附/解吸相结合的方法筛选大孔树脂型号，采用单因素实验考察上样量、上样流速、洗脱流速等对总黄酮纯化工艺的影响，优选大孔吸附树脂纯化复方总黄酮的工艺条件为：大孔吸附树脂类型为AB-8型，树脂柱径高比定为1:6，上样液质量浓度为0.5g·mL-1，上样体积为2BV，上样流速为2BV·h-1，吸附4h，水洗体积为1.5BV，洗脱溶剂为50％乙醇，洗脱流速为2BV·h-1，洗脱体积为3BV。
效果实验例
本具体实施方式复方总黄酮提取物抗心肌缺血作用研究如下：实验动物为SPF级昆明小鼠108只，雌雄兼用，体重18-20g，SPF级SD大鼠72只，雌雄各半，体重180-220g。
一、复方总黄酮提取物对心肌缺血小鼠的保护作用：
(1)小鼠的分组、造模及给药：
将小鼠随机分为6组：正常组、模型组、阳性药(盐酸普萘洛尔)组、复方总黄酮提取物高、中、低剂量组，每组18只。
正常组和模型组灌胃蒸馏水20mL·kg-1，阳性药组ig盐酸普萘洛尔33mg·kg-1，实施例1制备的复方总黄酮提取物高、中、低剂量组分别ig复方总黄酮提取物4.4、2.2、1.1g·kg-1，连续给药7d，各组小鼠均喂养普通饲料，自由饮水。第5d开始，除正常组外，其余各组小鼠均于给药1h后皮下注射ISO 20mg·kg-1，连续注射3d，制备心肌缺血模型，正常组小鼠皮下注射等剂量生理盐水。
(2)指标检测：
①对耐缺氧能力的影响
每组随机选取8只小鼠，于最后一次皮下注射ISO 30min后放入盛有10g钠石灰的250mL磨口广口瓶内密封，立即计时，以停止呼吸为标准，观察小鼠存活时间。
②血清酶学检测
每组随机选取10只小鼠，于最后一次皮下注射ISO 30min后摘眼球取血，室温静置2h，3500r·min-1离心15min，分离血清，用于SOD、MDA、LDH的测定。
③心脏指数的测定
血清酶学检测实验取血完成后，各小鼠脱颈处死，开胸迅速取出心脏，用预冷生理盐水冲洗血液，滤纸吸干水分后称量全心质量，计算心脏质量指数。
二、复方总黄酮提取物对心肌缺血大鼠的保护作用：
(1)大鼠分组、造模及给药：
将大鼠随机分为6组：正常组、模型组、阳性药组、复方总黄酮提取物高、中、低剂量组，每组12只。
正常组、模型组灌胃(ig)蒸馏水20mL·kg-1，阳性药组ig盐酸普萘洛尔20mg·kg-1，实施例1制备的复方总黄酮提取物高、中、低剂量组分别ig复方总黄酮提取物2.64、1.32、0.66g·kg-1，连续给药14d，各组大鼠均喂养普通饲料，自由饮水。第12d开始，除正常组外，其余各组大鼠均于给药1h后皮下注射ISO 85mg·kg-1，连续注射3d，制备心肌缺血模型，正常组大鼠皮下注射等剂量生理盐水。
(2)指标检测：
①心电图观察
各组大鼠于第1次皮下注射ISO前及最后1次注射24h后，ip 20％乌拉坦(6mL·kg-1)进行麻醉，仰卧位固定，将心电图机电极分别插入四肢皮下，记录标准II导联，观察ST段偏移的程度(QRS波群的终点与T波直接相接，其交接点称J点，II导联ECG S-T段的测定是比较J点与标准基线偏移程度，以P-R段为基线，S-T段的变化值无论上抬或下移，均取其绝对值)。
②血清心肌酶的测定
心电图测定结束后各组大鼠均腹主动脉采血，室温静置2h，3500r·min-1离心15min，分离血清，用于CK、CK-MB、LDH、GSH-Px、ALT、AST、CTnI、IL-6、MDA、NO、SOD及TNF-α的测定。
③心肌组织病理学检测
大鼠于腹主动脉采血完成后迅速摘取心脏，用冰冷生理盐水冲洗干净，取心尖部位的心肌组织置于10％福尔马林中固定，脱水，包埋，制成石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察。
三、复方总黄酮提取物及其组方药味传统水煎煮提取物对心肌缺血小鼠保护作用的药效比较：
(1)药物的制备
①复方总黄酮提取物的制备
按“实施例1”方法制备。
②复方及组方药味传统水煎煮提取物的制备
准确称取相同重量的复方(地锦草：仙鹤草：分心木＝1:2:1)、地锦草、仙鹤草、分心木药材，加10倍量的水煎煮2次，每次1.5h，提取液滤过，合并，减压浓缩至稠膏，低温干燥即得。
(2)小鼠的分组、造模及给药：
将小鼠随机分为8组：正常组、模型组、阳性药(盐酸普萘洛尔)组、复方总黄酮提取物组，复方水煎煮提取物组，地锦草水煎煮提取物组，仙鹤草水煎煮提取物组，分心木水煎煮提取物组，每组18只。
正常组和模型组灌胃蒸馏水20mL·kg-1，阳性药组ig盐酸普萘洛尔33mg·kg-1，实施例1制备的复方总黄酮提取物组ig复方总黄酮提取物2.2g·kg-1(以生药材计20g·kg-1)，复方水煎煮提取物组5.8g·kg-1(以生药材计20g·kg-1)，仙鹤草水煎煮提取物组6.7g·kg-1(以生药材计20g·kg-1)，地锦草水煎煮提取物组6.3g·kg-1(以生药材计20g·kg-1)，分心木水煎煮提取物组4.6g·kg-1(以生药材计20g·kg-1)，连续给药7d，各组小鼠均喂养普通饲料，自由饮水。第5d开始，除正常组外，其余各组小鼠均于给药1h后皮下注射ISO20mg·kg-1，连续注射3d，制备心肌缺血模型，正常组小鼠皮下注射等剂量生理盐水。
(3)指标检测：
①对耐缺氧能力的影响
每组随机选取8只小鼠，于最后一次皮下注射ISO 30min后放入盛有10g钠石灰的250mL磨口广口瓶内密封，立即计时，以停止呼吸为标准，观察小鼠存活时间。
②血清酶学检测
每组随机选取10只小鼠，于最后一次皮下注射ISO 30min后摘眼球取血，室温静置2h，3500r·min-1离心15min，分离血清，用于SOD、MDA、LDH的测定。
③心脏指数的测定
血清酶学检测实验取血完成后，各小鼠脱颈处死，开胸迅速取出心脏，用预冷生理盐水冲洗血液，滤纸吸干水分后称量全心质量，计算心脏质量指数。
上述实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，各组数据均以表示。所得数据作方差齐性试验后作t检验，P＜0.05有统计学意义，其实验结果如下：
(1)复方总黄酮提取物对心肌缺血小鼠的保护作用
①复方总黄酮提取物对心肌缺血小鼠耐缺氧能力的影响
与正常组相比，模型组小鼠生存时间显著缩短，差异具有统计学意义(P＜0.01)，表示造模成功；与模型组相比，阳性药组、复方总黄酮提取物高、中剂量组小鼠生存时间显著延长，差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，复方总黄酮提取物低剂量组小鼠生存时间有增加趋势，差异无统计学意义(P＞0.05)，表明各给药组对心肌缺血小鼠均有一定的保护作用。其结果见表10、图15。
表10总黄酮提取物对缺氧缺氧小鼠存活时间的影响
与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05，与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
②复方总黄酮提取物对心肌缺血小鼠血清SOD、LDH、MDA及心脏指数的影响
与正常组比较，模型组小鼠血清LDH、MDA水平及心脏指数升高，SOD的水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，阳性药组、复方总黄酮提取物高、中、低剂量组小鼠血清LDH、MDA水平及心脏指数降低，SOD的水平升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。其结果见表11、图16、图17。
表11总黄酮提取物对心肌缺血小鼠血清SOD、LDH、MDA及心脏指数的影响
与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05，与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
(2)复方总黄酮提取物对心肌缺血大鼠的保护作用
①复方总黄酮提取物对心肌缺血大鼠II导联心电图ST段偏移的影响
与正常组比较，模型组大鼠II导联心电图ST段位移显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，阳性药组和高剂量组ST段位移明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。见表12、图18-19。
表12总黄酮提取物对心肌缺血大鼠心电图ST段的影响
与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
②复方总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清SOD、LDH、MDA、GSH-Px、CK、CK-MB、CTnI、IL-6、ALT、AST、NO及TNF-α的影响
与正常组比较，模型组大鼠血清LDH、MDA、CK、CK-MB、cTn-I、IL-6、ALT、AST、TNF-α水平升高，SOD、GSH-Px、NO水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，各给药组均能不同程度的降低心肌缺血大鼠血清LDH、MDA、CK、CK-MB、cTn-I、IL-6、ALT、AST、TNF-α水平，升高SOD、GSH-Px、NO水平，并呈现一定的剂量依赖性。见表13-15、图20-25。
表13总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清SOD、LDH、MDA和GSH-Px的影响
表14总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清AST、ALT、NO和TNF-α的影响
表15总黄酮提取物对心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB、cTnI和IL-6的影响
与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05；与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
大鼠心肌组织病理学结果：正常组大鼠心肌组织无变性、坏死，心肌纤维结构排列整齐，组织间隙无水肿，无炎细胞浸润(图26A)；模型组大鼠心肌细胞坏死明显，可见较大范围的心肌纤维坏死，细胞间隙水肿明显，大量炎性细胞浸润(图26B)；与模型组相比，各给药组大鼠心肌组织间隙水肿程度降低，能保持更多心肌细胞结构正常，间质炎性细胞浸润程度有所减轻(图26C-F)。
(3)复方总黄酮提取物及其组方药味传统水煎煮提取物对心肌缺血小鼠保护作用的药效比较
①复方总黄酮提取物及其组方药味水煎煮提取物对心肌缺血小鼠耐缺氧能力的影响
与正常组相比，模型组小鼠生存时间显著缩短，差异具有统计学意义(P＜0.01)，表示造模成功；与模型组相比，阳性药组、复方总黄酮提取物组、复方水煎煮提取物组小鼠生存时间显著延长，差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，地锦草水煎煮提取物组、仙鹤草水煎煮提取物组和分心木水煎煮提取物组小鼠生存时间有增加趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)，表明复方总黄酮提取物对心肌缺血小鼠的保护作用显著优于组方药味传统水煎煮提取物。其结果见表16。
表16复方总黄酮提取物及其组方药味水煎煮提取物
对缺氧缺氧小鼠存活时间的影响
与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05，与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
②复方总黄酮提取物及其组方药味水煎煮提取物对心肌缺血小鼠血清SOD、LDH、MDA及心脏指数的影响
与正常组比较，模型组小鼠血清LDH、MDA水平及心脏指数升高，SOD的水平降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型组相比，阳性药组、复方总黄酮提取物组小鼠血清LDH、MDA水平及心脏指数降低，SOD的水平升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)，复方水煎煮提取物组小鼠血清LDH、MDA水平降低(P＜0.05)，其余各组小鼠血清LDH、MDA水平及心脏指数有降低趋势，SOD的水平有升高趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)，表明复方总黄酮提取物对心肌缺血小鼠的保护作用显著优于组方药味传统水煎煮提取物。其结果见表17。
表17复方总黄酮提取物及其组方药味水煎煮提取物对心肌缺血小鼠血清SOD、LDH、MDA及心脏指数的影响
与正常组比较##P＜0.01，#P＜0.05，与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05。
ISO是人工合成的β受体激动剂，大剂量皮下注射ISO可造成实验动物心肌缺血，本部分实验采用皮下多点注射ISO诱导心肌缺血模型，所制备模型的心电图和酶学变化等均类似于人类心肌缺血或心肌梗死，因此用其来评价复方总黄酮提取物对心肌缺血的保护作用更具科学依据。
ISO可致实验动物的心肌耗氧量增加，本实验研究表明，复方总黄酮提取物可提高ISO诱导的心肌缺血小鼠的耐缺氧能力，延长心肌缺血小鼠在缺氧条件下的生存时间；II导联心电图中ST段的变化幅度是反映心肌缺血损伤程度的可靠指标，实验研究表明，复方总黄酮提取物可抑制心肌缺血大鼠ST段的变化。
ISO可使大鼠心肌组织出现心肌纤维坏和心肌细胞坏死，细胞间隙水肿明显，大量炎性细胞浸润等现象，而实验研究发现复方总黄酮提取物可改善这一现象。
心脏正常的生理功能与心脏中大量的酶类物质密切相关，ISO可破坏实验动物心肌细胞膜的完整性，提高细胞膜的通透性，使心肌中含有的酶类物质如cTnI、CK、CK-MB、AST、ALT、LDH等大量释放入血，致使血中浓度升高，因此检测血清中此类物质的水平对诊断心肌缺血及评价心肌缺血的严重程度具有重要的意义。实验研究表明，本发明复方总黄酮提取物能显著降低心肌缺血大鼠血清中cTnI、CK、CK-MB、AST、ALT、LDH的水平，对心肌缺血大鼠具有保护作用。
氧化和抗氧化的失衡是很多心血管疾病发病机制中的重要环节，也是导致心血管系统结构功能异常的重要原因之一。现代药理学研究表明，心肌缺血的发生与体内氧自由基的产生与蓄积密切相关，氧自由基作用于人体细胞，引起核酸、蛋白质和脂质等的氧化或再氧化损害，破坏细胞结构的完整性和功能，造成细胞氧化应激损伤，MDA的生成增多；SOD作为生物体内清除自由基的首要物质，可减弱因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞；GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，可保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害，其活力大小亦可反应机体抗氧化能力；NO是生物体内一种反应性极强的自由基，是一种效应分子，具有广泛的生理作用，如松弛血管平滑肌，抑制血小板聚集等，心肌缺血过程中，血清中NO水平下降；研究表明，心肌缺血损伤的程度与机体炎症反应密切相关，机体IL-6和TNF-α的水平对炎症程度具有指示作用，实验研究发现，复方总黄酮提取物能升高心肌缺血大鼠血清SOD、GSH-Px、NO的水平，降低MDA、IL-6、TNF-α的水平。
此外，实验还对复方总黄酮提取物及其组方药味传统水煎煮提取物对心肌缺血小鼠保护作用的药效进行了比较，结果显示，复方总黄酮提取物对心肌缺血小鼠的保护作用显著优于组方药味传统水煎煮提取物。
综上，本部分实验结果表明，采用皮下多点注射ISO成功制备心肌缺血动物模型，并探讨总黄酮提取物抗心肌缺血的作用及其作用机制，结果表明，总黄酮提取物能提高心肌缺血小鼠耐缺氧能力，降低小鼠血清LDH、MDA水平及心脏指数，升高SOD水平；可抑制心肌缺血大鼠心电图ST段的偏移，降低大鼠血清LDH、MDA、CK、CK-MB、cTn-I、IL-6、ALT、AST、TNF-α水平，升高SOD、GSH-Px、NO水平，改善心肌缺血大鼠心肌组织病理形态学损害，对心肌缺血损伤具有明显的保护作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种抗心肌缺血的中药组合物，其特征在于，由地锦草：仙鹤草：分心木按重量比(1-3)：(1-6)：(1-3)制成。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由地锦草：仙鹤草：分心木按重量比1：2：1制成。
3.一种抗心肌缺血的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括：
1)按重量比(1-3)：(1-6)：(1-3)称取锦草、仙鹤草和分心木，混合均匀，得中药混合物；
2)取1)得到的中药混合物，采用乙醇回流提取法提取，将提取液过滤，合并，滤液经减压浓缩至无醇味，加水稀释，静置后离心0.5-5min，上清液即为总黄酮提取液；
3)将2)得到的总黄酮提取液上样于大孔吸附树脂柱，加水洗脱水溶性杂质，再加乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩到稠膏状态后低温干燥，即得总黄酮提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在2)中，所述乙醇回流提取时各因素取值为乙醇体积分数40％-70％，液料比10-20mL·g-1，回流提取1-3次，每次60-150min，提取温度85-100℃，提取液过滤合并，滤液经减压浓缩至0.25-1g·mL-1；
所述加水稀释中所用水量为浓缩后滤液重量的0.5-1倍，所述离心转速为2000-4000r·min-1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在2)中，所述乙醇回流提取时各因素取值为乙醇体积分数55％，液料比17mL·g-1，回流提取2次，每次146min，提取液过滤合并，滤液经减压浓缩至0.5g·mL-1；所述离心转速为3000r·min-1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在3)中，所述大孔吸附树脂柱采用AB-8、D101、HPD100或HPD300型大孔树脂，总黄酮提取液上样于径高比为1：4-1：10的上述大孔吸附树脂柱，上样液质量浓度为0.25-1g·mL-1，上样流速为1-3BV·h-1，上样量为1-3BV，吸附0-6h，加水0.5-3BV洗脱水溶性杂质，再加体积分数30％-95％乙醇1-4BV洗脱，洗脱流速为1-4BV·h-1。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在3)中，所述大孔吸附树脂柱采用AB-8型大孔树脂，总黄酮提取液上样于径高比为1：6的AB-8型大孔吸附树脂柱，上样液质量浓度为0.5g·mL-1，上样流速为2BV·h-1，上样量为2BV，吸附4h，加水1.5BV洗脱水溶性杂质，再加体积分数50％乙醇3BV洗脱，洗脱流速为2BV·h-1。
8.一种如权利要求1-2任一项所述的抗心肌缺血的中药组合物在制备抗心肌缺血的药物或保健品中的应用。
9.一种抗心肌缺血的药物或保健品，其特征在于，取权利要求1-2任一项所述的抗心肌缺血的中药组合物，加入一种或多种食品学或药学上可接受的辅料，按常规工艺制成饮料、汤剂、丸剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、注射剂、胶囊剂、散剂、膏剂、口服液、颗粒剂或片剂。
10.一种抗心肌缺血的药物或保健品，其特征在于，取权利要求5制备得到的总黄酮提取物，加入一种或多种食品学或药学上可接受的辅料，按常规工艺制成饮料、汤剂、丸剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、注射剂、胶囊剂、散剂、膏剂、口服液、颗粒剂或片剂。
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