CN103405525B - 强心和防治慢性心衰的组合物、药物及制备方法 - Google Patents

Abstract

强心和防治慢性心衰的组合物、药物及制备方法。该组合物为以提取原料的重量份计为1：（1～5）的人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物组成。以该组合物为有效成分，可与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成为具有相应功能的药物。制备时，人参皂苷提取物可由人参或红参的乙醇/水提取物经大孔吸附树脂分离后得到；不含双酯型生物碱的附子提取物由药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下的水煎煮液，经乙醇沉淀或用大孔吸附树脂分离后得到。实验显示，该组合物/药物在强心、治疗急慢性心衰以及心肺脑复苏作用等方面，具有明显的协同增效作用，药效作用优于以常规方式得到的附子总生物碱提取物，且毒性明显减小。

Description

强心和防治慢性心衰的组合物、药物及制备方法

技术领域

本发明涉及一种天然药物成分的组合物，具体讲是一种具有强心和防治慢性心衰作用的组合物，以及相应的药物及制备方法。

背景技术

人参和附子为常用中药。人参具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智之功效，主要有效成分为人参皂苷。附子具有回阳救逆，补火补阳，散寒止痛之功效，附子为有毒中药，主要毒性成分为双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱）。关于附子回阳救逆的有效成分目前尚不清楚，有报道附子中的新乌头原碱、次乌头原碱、去甲乌药碱、氯化甲基多巴胺、去甲猪毛菜碱、尿嘧啶、附子苷等水溶性成分，可具有强心和/或升压的作用。以人参、附子组成的古方有参附汤（人参、附子）、人参四逆汤（人参、附子、干姜、甘草）等，具有回阳、益气、固脱之功效，用于元气大亏，阳气暴脱。

历代医家都视附子为补火助阳之要药，也被誉为“回阳救逆第一品药”。但因附子性刚烈迅捷，历代医家及本草著作皆言附子“有毒”或“有大毒”，用之不当，易出现严重的毒副作用。因此现代临床汤剂一般使用制附子，且要久煎减毒。在成品药物制剂中一般也使用制附子入药。附子的毒性与双酯型生物碱结构中的酯键直接相关，有研究报道，双酯型生物碱在酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定而生成单酯型生物碱和乌头类原碱，使毒性降低。

公开号为CN1823933A、CN1891265A、CN1660283A、CN1689593A、CN1493331A、CN1951432A等中国专利文献已分别报道了以不同方式制备得到的人参皂苷和附子提取物为有效成分制备的组合物。其中，对原料附子，分别有采用酸水、水或乙醇提取，或进一步应用树脂分离纯化，得到附子提取物或总生物碱，通常都不同程度地含有双酯型生物碱毒性成分。申请人的深入研究发现，由于药用原料附子（制附子和/或生附子）的自身特点，特别是制附子，以普通水按常规方式煎煮后，其水煎液均呈酸性甚至较强的酸性，因此水煎液中的双酯型生物碱较稳定，即使长时间煎煮，不仅去毒效果并不理想，还易造成有益成分的损失。因双酯型生物碱具有明显的心脏毒性，故这些含有双酯型生物碱的人参/附子组合物都存在一定的毒性和安全隐患，也影响了药物疗效的发挥和安全性。

发明内容

针对上述情况，本发明提供了一种更安全、有效的具有强心和防治慢性心衰作用的组合物，以及以该组合物作为有效成分的相应的药物及制备方法。

本发明的强心和防治慢性心衰组合物，由人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物组成，以其提取原料重量份计的比例为人参或红参：附子=1：（1～5）；优选的比例范围是人参或红参：附子=1：（1～3）；更好的比例为人参或红参：附子=1：2。

上述组合物中所说不含双酯型生物碱的附子提取物的药用原料附子，可以为目前常用的包括黑附片、白附片、淡附片、蒸附片、炒附片、生附片等生药附子或其相应的炮制品，和/或饮片。

以本发明上述形式的组合物为有效成分，与药物中可以接受的相应辅助添加成分，如常用的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等辅料/助剂，根据使用需要，按照目前的常规工艺方式，制备成可供使用的包括片剂、滴丸、胶囊剂、微丸等常用的药物制剂，优选为口服型的药物制剂。

本发明上述组合物的基本制备方法，可以按下述方式进行：

a、人参皂苷提取物的制备：将药用原料人参或红参用含醇体积比为0-80%的乙醇-水混合溶剂提取后，将提取液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用50-80%的乙醇洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得到人参皂苷提取物；

b、不含双酯型生物碱的附子提取物的制备：药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下水煎煮，收集煎煮液，煎煮液继续按下述方式之一处理：

方式1：在煎煮液中加入乙醇，使混合液的含醇体积比达50~85%后静置，固液分离，收集液体并除去溶剂，得到所说的附子提取物；

方式2：将煎煮液用大孔吸附树脂柱吸附并水洗除杂后，用50~90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，除去溶剂，得到附子提取物；

c、将上述得到的人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物按所说比例混合。

其中，上述制备方法的b步中，所说的药用原料附子，同样可以为生附子或经相应方法炮制后的各种制附子（包括其饮片）。

在上述基本制备方法的基础上，还可以单独或以任意组合方式采用的进一步优选方式包括：

优选方式之一是，上述a步中所说的人参皂苷提取物采用下述方式之一制备得到：

方式1：将药用原料人参或红参的水提取液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得到所说的人参皂苷提取物；

方式2：用含醇体积比50-80%的乙醇-水溶液对药用原料人参或红参提取后，除去提取液中的乙醇，剩余的水溶液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用含醇体积比50～80%的乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得到所说的人参皂苷提取物。

优选方式之二是，上述b步中所说在维持pH值6.5-9条件下水煎煮后，可以再用中性或pH值2-5的水煎煮1-2次，各次煎煮液合并后进行后续处理。

优选方式之三是，上述b步中所说不含双酯型生物碱的附子提取物可以采用下述方式之一制备得到：

方式1：将药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下水煎煮2-3次，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.10～1.30后加入95(v)%等常用的高浓度乙醇，使混合物的含醇体积比达50~85%，静置后固液分离，收集液体并除去溶剂，得到所说的附子提取物；

方式2：将药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下水煎煮2-3次，合并煎煮液，用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，至少用pH≤5且醇体积含量为50~90%的酸性乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到所说的附子提取物。

申请人的深入研究发现，附子在维持pH值6.5-9的条件下水煎煮得到水提取液，可以完全去除双酯型生物碱，使其中的乌头碱转化为苯甲酰乌头原碱和乌头原碱，从而显著降低其毒性，如小鼠/大鼠静脉注射的该三者的毒性（LD₅₀）分别为：0.12/0.102mg/kg、10.1±0.5/24±3mg/kg、116.5±3.9/374±40mg/kg，新乌头碱和次乌头碱也发生相应的转化。该水煎煮条件既避免了常规自然状态下用水煎煮附子所导致的煎煮液pH不断减小，不利于双酯型生物碱的去除和减毒，以及长时间煎煮所带来的不利，也避免了以高碱性的水浸泡和/或煎煮对设备及操作造成的不利，更为有益的是避免了其它药效成分的破坏或损失，显然将更有利于在规模化生产中的采用和推广。特别是，经pH值6.5-9条件下煎煮已去除了双酯型生物碱的附子原料，再进一步用pH值2-5的水煎煮，还可以进一步有利于附子中生物碱成分被充分提取出来。对已去除而不含双酯型生物碱的提取液，再以醇沉或经大孔树脂柱分离等方式除去包括多糖等形式的杂质，可以很好地保留其具有优良药效作用的成分。实验结果显示，本发明所述的人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物的组合物，在强心、治疗急慢性心衰以及心肺脑复苏作用等方面，不仅能产生明显的协同增效作用，而且毒性明显小于常见的附子采用酸水、水或乙醇等提取方式得到的组合物。在此基础上的进一步研究还发现，本发明制备方法中，以所述的水煎醇沉方式得到的附子提取物，其药效作用更优于水煎大孔树脂方式得到的附子提取物（主要成分为总生物碱）。因此，与包括前述文献在内的目前药物和/或制备方法相比，本发明的组合物及相应的药物，其药效成分配伍更为合理、更安全。

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1

取红参1kg，加12倍水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，上HPD100大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。另取生附片2kg，加8倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5-7.5，煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.20，加95%(v，以下均同此)乙醇使含醇量达80-85%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

将上述人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物混合，即为本发明所述的组合物。

实施例2

取红参1kg，加12倍水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，上HPD100大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。另取生附片2kg，加8倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用氢氧化钠溶液调节pH值为6.5-7.5，煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，上HPD100大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

将上述人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物混合，即为本发明所述的组合物。

实施例3

取红参1kg，加8倍量水煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，上D101大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积的水洗涤除杂，再用60%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。另取黑附片3kg，加12倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值为8-9，煎煮3小时，滤过，药渣再加pH2-3水6倍量煎煮2次，每次1小时，滤过，合并滤液，合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.15，加90-95%乙醇使含醇量达约70%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

将上述人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物混合，即为本发明所述的组合物。

实施例4

取人参1kg，加10倍量50%乙醇回流提取2次，每次3小时，滤过，合并滤液，回收除尽乙醇，水溶液上D101大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用80%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。另取蒸附片1kg，加7倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值为7-8，煎煮2小时，滤过，药渣再加7倍量水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收水、浓缩至相对密度约为1.25，加90%乙醇使含醇量达为50-60%，充分搅拌，静置过夜，滤过，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

将上述人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物混合，即为本发明所述的组合物。

实施例5

取人参1kg，加7倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5小时，滤过，合并滤液，回收除尽乙醇，水溶液上AB8大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。另取淡附片5kg，加12倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值约为9，煎煮2小时，滤过，药渣再加12倍量pH4-5水煎煮2小时，滤过，合并滤液，上D101大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用pH值4-5的50%乙醇洗脱，收集4倍柱床体积的乙醇洗脱液，调节pH值近中性，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

取上述人参皂苷提取物、附子提取物，加入微晶纤维素和羧甲基淀粉钠等辅料适量，混合均匀，制粒，干燥，压片，包衣，即为本发明的片剂型药物

实施例6

取红参1kg，加12倍量80%乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收除尽乙醇，水溶液上HPD100大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积的水洗涤除杂，再用50%乙醇洗脱，收集3-4倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得到人参皂苷提取物。另取生附片4kg，加12倍量水，煎煮开始及煎煮过程中用碳酸钠溶液调节pH值为8-9，煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，上AB8大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积的水洗涤除杂，再用pH值3-4的90%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，调节pH值近中性，回收乙醇，浓缩，干燥，得到不含双酯型生物碱的附子提取物。

取上述人参皂苷提取物、附子提取物，加入药用淀粉适量，混合均匀，制粒，干燥，装入胶囊，即为本发明的胶囊型药物

以下通过毒性成分的含量和毒/效作用为评价指标，进一步说明本发明组合物所具有的有益效果。

、附子煎煮过程中水煎液的pH值测定

取黑附片、白附片、淡附片、蒸附片、生附片各0.5kg，分别加10倍量水煎煮，沸腾后于30、60、90、120分钟测定水煎液的pH值，结果见表1。结果表明，自然煎煮状态下的附子水煎液均呈酸性，pH值为4-6。

、附子煎煮pH值对双酯型生物碱含量的影响

2.1取生附片（或黑附片）0.5kg，共7份，分别加水10倍量回流煎煮2小时，煎煮开始和煎煮过程中用盐酸溶液或氢氧化钠溶液分别调节pH约为2、4、5.5、6.5、7.5、9、11。采用高灵敏度的LC-MS方法直接测定水煎液中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量，结果见表2。结果显示，附子煎煮液的pH值对双酯型生物碱的含量有显著影响：当pH＜6.5时，水煎液中含有双酯型生物碱，且酸性越强，双酯型生物碱含量越高；当pH≥6.5时，水煎液中即未检出双酯型生物碱。

另取生附片0.5kg，加水10倍量回流煎煮2小时，煎煮开始和煎煮过程中不调节pH值。测定水煎液的pH值为6.01，采用中国药典HPLC方法测定水煎液中双酯型生物碱的含量，结果：未检出双酯型生物碱，与文献报道相同（陈东安等，附子煎煮过程中酯型生物碱含量的动态变化，中国实验方剂学杂志，2011,17(3):64-68）。但采用更高灵敏度的LC-MS方法测定，仍能检出少量的双酯型生物碱，乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量分别为0.23、0.49、0.75（μg/g，以生药计）。

、附子煎煮pH值对毒/效作用的影响

取黑附片各4份，分别加水11倍和9倍煎煮2次，煎煮开始和煎煮过程中用盐酸溶液或氢氧化钠溶液分别调节pH约为2、5.5、6.5、9，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收，浓缩至1g生药/ml，加2倍95%乙醇沉淀，充分搅拌，静置过夜，滤过，减压回收溶剂，浓缩至3g生药/ml，得到黑附片水煮醇沉提取物。另取生附片各4份，同上述方法制备得到生附片水煮醇沉提取物。

急性毒性试验

按常规方法进行急性毒性试验，计算LD₅₀。结果显示：上述黑附片pH2、pH5.5水煮醇沉提取物的LD₅₀分别为62.5g生药/kg、85.7g生药/kg，pH6.5、pH9水煮醇沉提取物未测出LD₅₀。生附片pH2、pH5.5水煮醇沉提取物的LD₅₀分别为5.8g生药/kg、32.3g生药/kg，pH6.5、pH9水煮醇沉提取物未测出LD₅₀。表明酸性条件下（pH2或pH5.5）附子提取物毒性大，近中性（pH6.5）或碱性（pH9）条件下附子提取物毒性显著减小。

附子提取物强心活性试验

试验样品：上述黑附片、生附片水煮醇沉提取物；

文献报道的样品：

样品A：取黑附片0.5kg，分别加70%乙醇8、6、6倍回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收除去乙醇，浓缩至3g生药/ml，即得。

样品B：取黑附片0.5kg，分别加70%乙醇8、6、6倍回流提取3次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收除尽乙醇，水溶液上HPD100大孔吸附树脂柱，先用4倍柱床体积的水洗涤除杂，再用70%乙醇洗脱，收集3倍柱床体积的乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至3g生药/ml，即得。

样品C：（按照前述CN1951432A的实施例3方法制备得到）：取黑附片0.5kg，粉碎，加4000ml水，用1N氢氧化钠溶液调节pH值至12，室温下浸泡24小时，薄层鉴别无乌头碱及次乌头碱为止，滤过，残渣用稀盐酸溶液渗漉提取生物碱，生物碱沉淀反应检测至提取完全止；合并滤液及渗漉液，用稀盐酸调节溶液pH值至2；减压回收，浓缩至1g生药/ml，加2倍95%乙醇沉淀，充分搅拌，静置过夜，滤过，减压回收溶剂，浓缩至3g生药/ml，即得。

样品D：（按照前述CN1951432A的实施例4方法制备得到）：取生附片0.5kg，粉碎，加4000ml水，用1N氢氧化钠溶液调节pH值至12，室温下浸泡40小时，薄层鉴别无乌头碱及次乌头碱为止，滤过，残渣用稀盐酸溶液渗漉提取生物碱，生物碱沉淀反应检测至提取完全止；合并滤液及渗漉液，用稀盐酸调节溶液pH值至2；上样于处理好的DM—130大孔吸附树脂层析柱上，水洗脱至无色，然后用30%乙醇洗脱3个柱体积，收集乙醇洗脱液，减压浓缩除去乙醇至适当体积，用氨水调节PH值至9左右，静置沉淀，并用水洗涤沉淀，再用酸水溶解配制成相当于3g生药/ml，即得。

试验方法：

取大鼠击头致昏，颈动脉放血，迅速开胸取心脏，放入盛有充氧的低温洛氏液培养皿中，沿房室沟剪去心室，保留心房，勿伤窦房结，在左右心房尖部各系一线，一根固定于吊钩上，另一根连于肌张力换能器，将心房置于麦氏浴槽中，槽中盛有30ml连续通氧的浴氏液，用超级恒温水浴保持32℃，此时心房恢复节律性收缩，调节二道生理仪各常数，记录心脏振幅及心跳频率。分次加入上述试验样品（附子提取物）50μl、50μl、100μl、200μl，累计量为400μl，观察每次加药前后的变化，每份样品重复实验4次，取平均值。结果见表3。

试验结果：

附子煎煮pH值对毒/效作用有明显的影响。酸性条件下（pH2或pH5.5）附子提取物心脏毒性大，致心律不齐和/或心脏抑制，中性或碱性条件下（pH6.5或pH9）附子提取物未见明显的心脏毒性，有显著的强心作用。此外，文献报道的附子醇提样品或醇提大孔树脂处理样品，均有一定的心脏毒性（心律不齐），影响了强心药效作用的发挥。附子碱水浸泡、酸水渗漉，再进一步用树脂处理得到的样品，不仅强心作用不强，而且仍有一定的心脏毒性。试验结果证明，采用本发明方法制备得到的不含双酯型生物碱的附子提取物，能更有利于药效作用的发挥，取得意想不到的更好疗效。

、人参皂苷提取物与不含双酯型生物碱的附子提取物强心活性试验

采用实施例1方法制备得到的人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物进行强心活性试验，试验药物加水溶解，均配制成2g生药/ml。取大鼠击头致昏，颈动脉放血，迅速开胸取心脏，放入盛有充氧的低温洛氏液培养皿中，沿房室沟剪去心室，保留心房，勿伤窦房结，在左右心房尖部各系一线，一根固定于吊钩上，另一根连于肌张力换能器，将心房置于麦氏浴槽中，槽中盛有30ml连续通氧的浴氏液，用超级恒温水浴保持32℃，此时心房恢复节律性收缩，调节二道生理仪各常数，记录心脏振幅及心跳频率。本试验分成三组，一组分次加入上述人参皂苷提取物100μl、100μl、100μl、200μl，累计量为500μl；二组分次加入不含双酯型生物碱的附子提取物100μl、100μl、100μl、200μl，累计量为500μl；三组先加入人参皂苷提取物100μl，再分次加入上述附子提取物100μl、100μl、100μl、200μl，观察每次加药前后的变化。

试验结果显示：上述试验药物组中单一人参皂苷提取物无明显的强心作用，而单一附子提取物有明显的强心作用；同时加入人参皂苷提取物和附子提取物强心作用明显增强，提示二者具有协同增效作用（1：1～5），结果见表4。

、本发明不同形式的组合物防治慢性心衰药效试验

5.1动物分组及造模：取90只SD大鼠，雌雄各半，适应性喂养3d后，随机取10只（雌雄各半）作为Ⅰ号组（空白对照组），尾静脉注射等体积生理盐水。其余80只大鼠用阿霉素（ADR）造模，每kg/次/大鼠用4mg，每5天注射1次，共3次。末次ADR给药24h后，随机选取模型鼠3只，断头处死，取出心脏，用预冷0.9%生理盐水冲洗，取左室心肌部分，以10%甲醛固定，HE染色，光镜下观察确认造模成功后，再将所余大鼠随机分为Ⅱ号组（心衰模型组）、Ⅲ号组（地高辛治疗组）、Ⅳ号组（实施例1药物组）、Ⅴ号组（实施例2药物组）、Ⅵ号组（实施例3药物组）、Ⅶ号组（实施例4药物组）。各组均精饲料喂养，自由饮水。

5.2给药方法：Ⅲ～Ⅶ组造模后次日开始灌胃给药，连续给药21d，试验药物组8g生药/kg，地高辛按1.6mg/kg给药，Ⅰ、Ⅱ组以等体积的生理盐水灌胃。

5.3实验结果

（1）一般症状：正常对照组（Ⅰ组）大鼠毛色光泽，行动敏捷，外观正常。其余80只大鼠在第1～3次尾静脉注射ADR后先后出现活动减少、蜷缩、纳食减少、体重减轻、腹水、尿少便溏，呼吸减弱、毛色枯槁、脱毛、消瘦等，第3次ADR注射后80只大鼠中死亡10只，取3只大鼠作造模测试，其余77只大鼠随机分为7组，每组各11只。在给药阶段，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组又分别死亡4只、2只、3只、3只、2只、2只。随后实验期间，用药组大鼠不再死亡，除心衰模型组外，其它存活大鼠症状均有不同程度的改善，Ⅲ～Ⅶ组存活大鼠症状明显优于心衰模型组。

（2）生化检查与病理学检查：给药后第15天，股静脉取血，处理后分别用化学法及放免法测定各组大鼠血浆中NO、血清TNF-α的水平，结果见表5。模型组NO、TNF-α水平明显高于正常对照组及各治疗组（P<0.01，P<0.001）。

最后放血处死大鼠，取左室心肌部分，以10%甲醛固定，常规石蜡包埋，病理切片，HE染色，光镜观察。可见正常对照组心肌细胞形态、胞质、间质及横（纵）纹均正常，但心衰模型组存在心肌细胞横（纵）纹不清，部分区域肌质纤维溶解，胞浆空泡变性，出现不同程度的炎症细胞浸润和间质水肿病变。给药组（Ⅲ～Ⅶ组）以上病变较心衰模型组有显著减轻，心肌细胞横（纵）纹存在，其中，Ⅳ组优于Ⅴ组。

上述试验结果表明，本发明不同形式的组合物，均能获得理想的抗心衰作用效果，其中，附子煎煮大孔树脂法得到的提取物对药效有一定的影响但无统计学差异，总体趋势是Ⅳ组优于Ⅴ组。

Claims (10)

1.强心和防治慢性心衰的组合物，其特征是由人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物，以其提取原料重量份计的比例为人参或红参：附子=1：（1～5），所述的不含双酯型生物碱的附子提取物为按下述方式制备得到：药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下水煎煮，收集煎煮液，煎煮液继续按下述方式之一处理：

方式1：在煎煮液中加入乙醇，使混合液的含醇体积比达50~85%后静置，固液分离，收集液体并除去溶剂，得到所说的附子提取物；

方式2：将煎煮液用大孔吸附树脂柱吸附并水洗除杂后，用50~90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，除去溶剂，得到附子提取物。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征是所说人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物的提取原料重量份比例为人参或红参：附子=1：（1～3）。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征是所说人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物的提取原料重量份比例为人参或红参：附子=1：2。

4.强心和防治慢性心衰的药物，其特征是以权利要求1至3之一的组合物为有效成分，与药物中可以接受的辅助添加成分共同组成。

5.如权利要求4所述的药物，其特征是为口服型药物制剂。

6.权利要求1至3之一所述组合物的制备方法，其特征是按下述方式进行：

a、人参皂苷提取物的制备：将药用原料人参或红参用含醇体积比为0-80%的乙醇-水混合溶剂提取后，将提取液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用50-80%的乙醇洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得到人参皂苷提取物；

b、不含双酯型生物碱的附子提取物的制备：药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下水煎煮，收集煎煮液，煎煮液继续按下述方式之一处理：

方式1：在煎煮液中加入乙醇，使混合液的含醇体积比达50~85%后静置，固液分离，收集液体并除去溶剂，得到所说的附子提取物；

方式2：将煎煮液用大孔吸附树脂柱吸附并水洗除杂后，用50~90%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，除去溶剂，得到附子提取物；

c、将上述得到的人参皂苷提取物和不含双酯型生物碱的附子提取物按所说比例混合。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是a步中所说的人参皂苷提取物采用下述方式之一制备得到：

方式1：将药用原料人参或红参的水提取液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用含醇体积比50~80%的乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得到所说的人参皂苷提取物；

方式2：用含醇体积比50-80%的乙醇-水溶液对药用原料人参或红参提取后，除去提取液中的乙醇，剩余的水溶液用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，用含醇体积比50～80%的乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，得到所说的人参皂苷提取物。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征是b步中所说在维持pH值6.5-9条件下水煎煮后，再用中性或pH值2-5的水煎煮1-2次，各次煎煮液合并后进行后续处理。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征是b步中所说不含双酯型生物碱的附子提取物采用下述方式之一制备得到：

方式1：将药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下水煎煮2-3次，合并煎煮液，浓缩至相对密度1.10～1.30后加入乙醇，使混合物的含醇体积比达50~85%，静置后固液分离，收集液体并除去溶剂，得到所说的附子提取物；

方式2：将药用原料附子在维持pH值6.5-9条件下水煎煮2-3次，合并煎煮液，用大孔吸附树脂吸附并水洗除杂后，至少用pH≤5且醇体积含量为50~90%的酸性乙醇-水溶液洗脱，收集洗脱液并除去溶剂，得到所说的附子提取物。

10.如权利要求6至9之一所述的制备方法，其特征是b步中所说的药用原料附子为制附子或生附子。