CN107691220A

CN107691220A - 一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法

Info

Publication number: CN107691220A
Application number: CN201711020722.3A
Authority: CN
Inventors: 段慧荣; 杨红善; 周学辉
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2018-02-16

Abstract

本发明公开了一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，是利用高科技的航天技术和组培方法相结合，以紫花苜蓿的组织培养实生苗为材料，经过搭载返回式航天器进行太空诱变，诱变结束后，在地面经培养、炼苗、移栽、扦插和大田管理一系列步骤，获得一批空间诱变紫花苜蓿再生苗。本发明的有益效果为：本发明提供的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，可显著提高紫花苜蓿的空间诱变效率，并保证紫花苜蓿从返回式航天器到大田的正常过渡，快速获得一批空间诱变紫花苜蓿再生苗，且空间诱变紫花苜蓿组培苗的培养方法操作简单，具有重要的应用价值。

Description

一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法

技术领域

本发明涉及植物育种方法技术领域，具体涉及一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是多年生的优良豆科牧草，素有“牧草之王”的美称，是我国种植面积最大的牧草之一，具有巨大的经济效益和社会效益。随着我国牧草需求量的大幅增长，提高单位面积优质牧草产量成为亟待解决的问题。

目前，紫花苜蓿优质高产品种主要通过传统的育种方法和转基因技术来实现。传统手段周期较长，且容易受到种内抗逆性遗传潜力的限制，进展缓慢。利用转基因技术虽可以大大提高选择效率，加快育种进程，但其操作技术较为复杂，要求更高，难度也更大。近年来，农业高科技新领域的快速发展为育种方法注入了新兴力量。植物空间诱变育种利用空间的特殊环境诱变，引起生物体变异，经地面种植获得有益变异体，从而选育新种质、新材料、培育新品种。空间诱变育种具有变异频率高、变异幅度大、有益变异多、育种速度较快等特点，是多因素综合作用的结果，地面无法模仿，具有特殊性。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其可有效提高空间诱变育种的效率，保证从返回式航天器到大田的紫花苜蓿苗的正常生长。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，包括以下步骤：

1)地面培养：

将经过空间诱变后返回地面的紫花苜蓿组培苗放置于光照培养箱中，于黑暗中适应2d，转为暗光培养2d后，调整光照为正常光照的2/3，培养2d，之后转为正常光照，继续培养；

2)炼苗：

在光照培养箱内继续培养10d后，开始炼苗，将培养瓶打开1/4口，炼苗3d，适应之后将瓶口打开1/2，继续炼苗2d，最后瓶口完全打开，炼苗2d，准备移栽；

3)移栽：

将紫花苜蓿组培苗从培养基中移出，根部用无菌水缓缓冲洗干净，移入填充混合基质的塑料花盆中，混合基质用蒸馏水浸湿，置于光照培养箱内培养，第一周浇灌蒸馏水，每盆浇灌100mL蒸馏水，之后每3d浇灌100mL的1/2Hogland营养液；

4)扦插：

空间诱变紫花苜蓿组培苗移栽后继续生长50d，剪取生长旺盛、幼嫩、带有芽点的高度为10cm的枝条，取斜截面，将其在0.01mM IAA溶液中浸泡5min，插入装有混合基质的花盆中，花盆直径为20cm，高10cm，3株/盆，扦插后的第一周浇灌蒸馏水，之后每3d浇灌一次1/2Hogland营养液；

5)大田管理：

紫花苜蓿扦插苗在室内继续生长2-3个月，将母株和扦插株的地上部进行平茬处理，转移至大田，常规管理，收获当代种子。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，进行空间诱变前的组织培养实生苗的获得方法为：挑选色泽金黄、颗粒饱满的紫花苜蓿种子，在超净工作台内用2％的NaClO溶液浸泡消毒10min，用无菌水冲洗3-5次，再用75％酒精浸泡30s，用无菌水冲洗5-7次后，浸泡在无菌水中过夜，之后播种于装有15mL MS固体培养基的50mL离心管内，2粒/管，暗催芽3d后，置于光照培养箱内培养1周，即可得到空间诱变前的组织培养实生苗。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，所述MS固体培养基的制备方法为：MS+30g/L蔗糖+7g/L植物凝胶；其中MS的的制备方法为：加入1900mg/LKNO₃、170mg/L KH₂PO₄、1650mg/L NH₄NO₃、370mg/L MgSO₄·7H₂O、440mg/L CaCl₂·2H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、0.83mg/L KI、22.3mg/L MnSO₄、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.025mg/L CuSO₄·7H₂O、0.25mg/L NaMoO₄·2H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、37.3mg/L Na₂·EDTA·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L烟酸、0.1mg/L盐酸硫胺素B1、0.5mg/L盐酸吡哆醇B6、100mg/L肌醇，pH值调为5.7-5.9。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，所述光照培养箱内的温度为22-26℃，光照强度为600μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h/d，相对湿度为55-65％。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，所述步骤1)中，暗光的光照强度为200μmol·m^-2·s^-1，正常光照强度为600μmol·m^-2·s^-1，调整光照的光照强度为400μmol·m^-2·s^-1。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，所述步骤2)中，在炼苗过程中，于瓶口打开1/2时，添加5mL改良的无菌1/2Hogland营养液至培养瓶中，以提供紫花苜蓿苗的营养所需。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，所述步骤2)中，改良的1/2Hogland营养液的制备方法为：2mmol/LKNO₃、0.5mmol/LKH₂PO₄、0.5

mmol/LMgSO₄·7H₂O、0.5mmol/L Ca(NO₃)₂·4H₂O、60μmol/L Fe-citrate、50μmol/LH₃BO₃、10μmol/LMnCl₂·4H₂O、1.6μmol/LZnSO₄·7H₂O、0.6μmol/LCuSO₄·5H₂O和0.05μmol/LNa₂MoO₄·2H₂O，pH值调为5.4±5.6。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，所述步骤3)中，塑料花盆的规格为：直径20cm、高10cm。

进一步的，上述一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，所述步骤3)和步骤4)中，混合基质的制备方法为，营养土和蛭石按体积比1：1均匀混合。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，可显著提高紫花苜蓿的空间诱变效率，并保证紫花苜蓿从返回式航天器到大田的正常过渡，快速获得一批空间诱变紫花苜蓿再生苗，且空间诱变紫花苜蓿组培苗的培养方法操作简单，具有重要的应用价值。

具体实施方式

实施例1：

1、紫花苜蓿组培实生苗的获得：

精选色泽金黄、颗粒饱满的紫花苜蓿航苜1号种子若干，在超净工作台内用2％的NaClO溶液浸泡消毒10min，用无菌水冲洗5次，再用75％酒精浸泡30s，用无菌水冲洗5次后，浸泡在无菌水中过夜，之后播种于装有MS固体培养基(约15mL)的50mL离心管内，2粒/管，共有20管，暗催芽3d后，置于光照培养箱内，培养箱内的的温度为24±2℃，光照时间为16h/d，光照强度为600μmol·m^-2·s^-1，相对湿度为60±5％，培养3d之后选取未被污染的紫花苜蓿组培苗2管，送至神舟11号飞船负责空间搭载工作的相关人员手中，在光照培养室中用相同条件进行培养，等待飞船搭载。

2、空间诱变：

挑选离心管内种子发芽一致、长势良好、子叶完全张开、茎干直立的紫花苜蓿组织培养实生苗1管，按要求封口搭载于“神舟11号飞船”，搭载时间为2016年10月17日至2016年11月18日，与天宫二号在距离地面393公里的轨道上交会对接后，在轨运行30天；其余19管材料作为地面对照(CK)，在光照培养箱内生长。

3、地面培养：

2016年11月18日，神舟11号飞船返回地面，于11月19日早上10：00拿到空间诱变的紫花苜蓿组培苗。由于神舟11号飞船上的光照不足，搭载的组培苗茎杆纤细，生长停滞，仅有两片小子叶，叶色发黄，但根部发育正常，较对照组侧根发达，因此，在地面培养初期，为使组培苗迅速适应，将其在培养箱中暗光培养2d，期间培养箱的温度为24±2℃，相对湿度为60±5％。之后将光照培养箱的光源调整为正常光照的1/3强度，即200μmol·m^-2·s^-1，适应2d，组培苗慢慢开始回绿，继续调整光照为正常光照强度的2/3，即400μmol·m^-2·s^-1，适应培养2d后，于11月25日转至正常光照600μmol·m^-2·s^-1条件，持续培养，此时组培苗顶端有小叶开始萌发。

4、炼苗：

组培苗在正常光照培养下，恢复生长，长势良好，于2016年12月06日开始进行炼苗操作。首先，在光照培养箱内，将培养瓶口打开1/4，炼苗，观察紫花苜蓿苗的生长，3天后，紫花苜蓿苗生长良好，则打开1/2瓶口，继续炼苗2天，最后，瓶口完全打开，炼苗2天，于2016年12月13日出瓶，准备移栽。

5、移栽：

2016年12月13日，将紫花苜蓿苗轻轻的从MS固体培养基中取出，用无菌水缓缓冲洗根部，去除根部残留的固体培养基，之后将幼苗移入蛭石和营养土(v：v＝1:1，重量分别为110g和400g)均匀混合的基质中，用蒸馏水浸湿，置于光照培养箱中培养，每盆每3d浇灌100mL蒸馏水，一周后，每3d浇灌改良的1/2Hogland营养液100mL。

6、扦插：

组培苗移栽后继续生长50d，紫花苜蓿苗生长健壮，长势良好，于2017年02月03日，剪取带有芽点的枝条，高度在10cm左右，取斜截面，将其在0.01mM IAA溶液中浸泡5min，插入装有混合基质(营养土和蛭石的体积比为1：1)的花盆中(花盆直径为20cm)，3株/盆，共6盆，扦插后的第一周浇灌蒸馏水，之后每3天浇灌一次1/2Hogland营养液。

7、大田管理：

紫花苜蓿母株和扦插株在室内继续生长80d后，于2017年04月22日，将其地上部进行平茬处理，母株和扦插株转移至隔离大田培养，常规管理，并于2017年08月10日，收获了当代种子。

空间诱变育种较常规育种，具有诱变频率高、变异幅度大等优点。用植物组织培养实生苗为材料，结合空间诱变育种的方法，能使植株产生比搭载种子更大的变异幅度，提高植株的诱变效率。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)地面培养：

2)炼苗：

3)移栽：

4)扦插：

5)大田管理：

2.根据权利要求1所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，进行空间诱变前的组织培养实生苗的获得方法为：挑选色泽金黄、颗粒饱满的紫花苜蓿种子，在超净工作台内用2％的NaClO溶液浸泡消毒10min，用无菌水冲洗3-5次，再用75％酒精浸泡30s，用无菌水冲洗5-7次后，浸泡在无菌水中过夜，之后播种于装有15mL MS固体培养基的50mL离心管内，2粒/管，暗催芽3d后，置于光照培养箱内培养1周，即可得到空间诱变前的组织培养实生苗。

3.根据权利要求2所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，所述MS固体培养基的制备方法为：MS+30g/L蔗糖+7g/L植物凝胶；其中MS的的制备方法为：加入1900mg/L KNO₃、170mg/L KH₂PO₄、1650mg/L NH₄NO₃、370mg/L MgSO₄·7H₂O、440mg/LCaCl₂·2H₂O、6.2mg/L H₃BO₃、0.83mg/L KI、22.3mg/L MnSO₄、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.025mg/L CuSO₄·7H₂O、0.25mg/L NaMoO₄·2H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、37.3mg/LNa₂·EDTA·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L烟酸、0.1mg/L盐酸硫胺素B1、0.5mg/L盐酸吡哆醇B6、100mg/L肌醇，pH值调为5.7-5.9。

4.根据权利要求2所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，所述光照培养箱内的温度为22-26℃，光照强度为600μmol·m^-2·s^-1，光照时间为16h/d，相对湿度为55-65％。

5.根据权利要求1所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤1)中，暗光的光照强度为200μmol·m^-2·s^-1，正常光照强度为600μmol·m^-2·s^-1，调整光照的光照强度为400μmol·m^-2·s^-1。

6.根据权利要求1所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤2)中，在炼苗过程中，于瓶口打开1/2时，添加5mL改良的无菌1/2Hogland营养液至培养瓶中，以提供紫花苜蓿苗的营养所需。

7.根据权利要求6所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤2)中，改良的1/2Hogland营养液的制备方法为：2mmol/LKNO₃、0.5mmol/LKH₂PO₄、0.5mmol/LMgSO₄·7H₂O、0.5mmol/L Ca(NO₃)₂·4H₂O、60μmol/L Fe-citrate、50μmol/LH₃BO₃、10μmol/LMnCl₂·4H₂O、1.6μmol/LZnSO₄·7H₂O、0.6μmol/LCuSO₄·5H₂O和0.05μmol/L Na₂MoO₄·2H₂O，pH值调为5.4±5.6。

8.根据权利要求1所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤3)中，塑料花盆的规格为：直径20cm、高10cm。

9.根据权利要求1所述的一种经过空间诱变的紫花苜蓿组培苗的培育方法，其特征在于，所述步骤3)和步骤4)中，混合基质的制备方法为，营养土和蛭石按体积比1：1均匀混合。