CN107686490A - 一种提取利福霉素b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利福霉素B提取的工艺，具体步骤包括1、发酵液或板框滤液通过陶瓷微滤膜过滤澄清；2、将微滤膜清液通过超滤膜过滤除杂；3、将超滤膜清液通过纳滤膜浓缩；4、将纳滤膜浓液调节pH到2.0‑2.5，加乙酸丁酯萃取；5、将得到的乙酸丁酯相调节pH至7.5‑8.5进行两级错流反萃取；6、再将得到的水相调节pH至2.0‑2.5，加乙酸乙酯进行二次萃取；7、将乙酸乙酯相进行冷冻，析出晶体；8、离心，得到利福霉素B晶体；9、将离心母液减压蒸馏结晶，得到利福霉素B粗产品，返回乙酸乙酯萃取工段。本发明优点在于：去除大量杂质，提高了产品纯度、收率及单位效价；减少了生产工序段，降低了生产成本；操作简单，高效节能，最终得到的利福霉素B纯度大于98％。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及一种提取利福霉素B的方法。
背景技术
利福霉素B(rifamycins)是1959年Sensi等从地中海链霉菌(Streptomycesmediterranoi)的代谢产物中分离提取的复合物，继而又分离出A，B，C，D，E等。利福霉素B类抗生素具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。对某些革兰氏阴性菌也有效。
利福霉素B类药物的母核结构为一个有27个碳原子的大环内酰胺，环中含有一个萘核。萘环上，由一脂肪链分别与C-2和C-12的C原子相连接，构成“安莎桥”结构，故也被归入安莎霉素类抗生素。C-15位羰基以酰胺键与萘核相连，使脂肪链与萘核呈71°角，这保证了这个结构的几何稳定性。安莎桥中，离萘核最近的是C-26位，该位点上连接的甲基C-34离萘核只有利福霉素B的母核包含8个手性中心：即20S，21S，22R，23R，24R，25S，26R和27S。
利福霉素B的作用机制主要有两方面：
(1)通过与细菌的DNA依赖性RNA聚合酶(DDRP)的β-亚单位结合，抑制细菌RNA合成的起始阶段，阻碍mRNA的合成。从DNA合成RNA是细菌遗传转录的第一阶段，RNA聚合酶通过键合在一段DNA束的特定序列上催化转录过程。利福霉素B可竞争酶的结合部位：其萘核可以与聚合酶的芳香酸，特别是酪氨酸残基之间通过类似π-π键作用而形成复合物；其C-1和C-8位的羟基键合在细菌β-亚单位中氨基酸的1.4～1.9nm的空腔中；同时，其脂肪链插入酶中，使C-21和C-23位的羟基片段参与竞争RNA链上酶的结合部位，使DNA、RNA和全酶三者形成不稳定的复合物，最终致细菌死亡。
(2)另一方面，因为所有利福霉素B衍生物都具有相同的母核，所以大多数该类化合物都能抑制DNA转录RNA，其表现出的抗菌活性差异主要是因为各衍生物透过细胞壁的能力不同所致。例如，利福霉素B对分离的DNA聚合酶有良好的抑制作用，但因为其不能透过细胞壁，所以实际上抗菌活性较弱。不能透过细胞壁主要是因为其连接在萘核C-4位的羧基，而C-4位连接酰胺、肼或酯基的衍生物都具有较好的抗菌活性。
1962年，利福霉素B经化学转化为利福霉素BSV，并被最先用于临床。由于其口服吸收不佳，故从3-甲酰利福霉素BSV的多个衍生物中又筛选得到甲哌利福霉素B，即利福平。该品可口服给药，而且疗效好，但易使菌株产生耐药性，有效时间短，对艾滋病并发症中的鸟复合分枝杆菌(MAC)感染活性较低，毒性较大。
利福霉素B是利福霉素B发酵产品中的主要产物，也是多种利福霉素B类衍生物的重要合成原料。由于菌种潜力的不同，目前国内利福霉素BSV的发酵水平约为7000ug/ml，发酵生产利福霉素B的效价可达到20000ug/ml。通过发酵法生产利福霉素B，再经化学反应制备利福霉素B类半合成抗生素，较之从利福霉素BSV出发合成利福霉素B类药物，具有潜在的竞争优势。
现阶段传统利福霉素B的提取方法主要是通过在发酵液添加硫酸锌来絮凝、沉降蛋白质，然后经过板框压滤，一次萃取、三级错流反萃取、二次萃取、碱洗、减压蒸馏结晶、烘干包装。该方法有以下缺点：
1、不能有效去除利福霉素B发酵液中的杂蛋白、菌体等杂质，利福霉素B纯度不高；
2、需要在发酵液过滤器添加硫酸锌，在萃取时加入破乳剂(十二烷基三甲基溴化铵)，一方面增加生产成本，另一方面也带来新的污染；
3、因利福霉素B发酵液及其提取液中含有大量蛋白，在萃取工序段，会造成利福霉素B的大量损失，利福霉素B的收率不高；
4、萃取剂的消耗量大，成本高；
5、原始工艺三级反萃取消耗的反萃剂量大，工序多，控制繁杂；
6、传统工艺直接采用减压蒸馏浓缩结晶，得到的利福霉素B晶体纯度低，颜色深，杂质多。
有鉴于此，依然有待于提出一种改进的利福霉素B的提取方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提取利福霉素B的方法，以解决现有技术存在的效率低下和工艺繁琐等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种提取利福霉素B的方法，它包括如下步骤：
(1)将利福霉素B的发酵液或利福霉素B发酵液板框滤液依次经微滤膜过滤、超滤膜过滤和纳滤膜浓缩后，得到利福霉素B浓缩液；
(2)将步骤(1)中得到的利福霉素B浓缩液调节pH后用乙酸丁酯进行一次萃取，一次萃取完成后，取有机相并调节pH，进行反萃取；将反萃取所得水相调节pH后用乙酸丁酯进行二次萃取，得到含利福霉素B的乙酸丁酯相；
(3)将步骤(2)中所得的含利福霉素B的乙酸丁酯相冷冻、结晶并析出晶体后，将含晶体的乙酸丁酯相进行离心，得到利福霉素B晶体；离心所得液体经减压蒸馏结晶后，得到利福霉素B粗品，并加入步骤(2)中反萃取所得水相中，继续进行二次萃取。
步骤(1)中，所述的微滤膜为陶瓷微滤膜，膜孔径为2～500nm，优选为5～20nm；过滤时，温度为10～60℃，优选为20～40℃；压力为0.1～0.6Mpa，优选为0.2～0.5Mpa；膜面流速为2～8m/s。
进一步的，微滤过程中，膜孔径优选为5～20nm，温度优选为30℃，压力优选为0.3Mpa。
在微滤过程中，当膜孔径大于500nm时，会在后续的一次萃取时，产生乳化层，并且膜通量反而会快速下降，因为此时大分子蛋白和膜孔径接近，更容易堵塞膜孔；而当微滤膜孔径为5nm时，去除大分子蛋白的效果可以高达85％，但是，通量仅为孔径为200nm膜的30％，增加工艺成本。当膜面流速高于5m/s之后，对于膜通量的稳定性几乎没有增加，但是能耗增加；当膜面流速在2～4m/s时，因为膜面冲刷作用减弱，膜污染很快，不易清洗恢复。经过大量实验验证，优选膜面流速为4～5m/s，最优选膜面流速为5m/s。
经试验发现，在温度为30℃，压力为0.3MPa时，既能保证通量下降比较缓慢，同时能耗相对较低，得到的利福霉素B效价较高，大分子蛋白的去除率高达90％。加洗水透析后，利福霉素B的回收率可达到98％以上。
步骤(1)中，所述的超滤膜为有机卷式超滤膜，截留分子量为10～200KD，优选为20～80KD；过滤时，温度为20～60℃，优选为20～40℃；压力为0.1～2.0Mpa，优选为0.4～0.8Mpa。
进一步的，超滤过程中，截留分子量优选为10～200KD，温度优选为30℃，压力优选为0.4MPa。
在超滤过程中，当超滤膜截留分子量为10～20KD时，虽然可以有效的去除体系中的小分子杂蛋白，去除率高达95％以上，但是同时也截留了25％的利福霉素B，需要用大量的水透析，增加了生产成本；在截留分子量为200KD时，依旧会有少量的小分子蛋白残留，会形成较薄的乳化层，需要用破乳剂进行处理。
经试验发现，在温度为30℃，压力为0.4MPa，截留分子量为10～200KD时，过滤通量下降缓慢，小分子蛋白等杂质的去除率可达90％以上。加洗水透析后，利福霉素B的回收率可达到98％以上。
步骤(1)中，所述的纳滤膜为有机卷式纳滤膜，截留分子量为100～1000Da，优选150～500Da；过滤时，温度为20～60℃，优选30～40℃；压力为0.1～2.0Mpa，优选1.0～2.0Mpa。
进一步的，纳滤过程中，温度优选为30℃，压力优选为1.0MPa，截留分子量优选为100～1000Da。
在纳滤过程中，在纳滤膜截留分子量为100Da时，其通量仅为500Da分子量的30％，且需要2.0MPa压力作为膜设备运行的驱动力；纳滤膜分子量为1000Da时，通量比500Da大25％，比300Da分子量的纳滤膜通量大40％，但是会有8％左右的利福霉素B透过纳滤膜，造成产品的浪费。
经试验发现，在温度为30℃，压力为1.0MPa，截留分子量为100～1000Da时，过滤通量下降缓慢，且可浓缩近5倍。
步骤(2)中，进行一次萃取时，步骤(1)中得到的利福霉素B浓缩液经硫酸水溶液调节pH至2.0～2.5；进行两级错流反萃取时，用磷酸缓冲液调节有机相的pH至7.5～8.5，优选pH为8；进行二次萃取时，用硫酸水溶液调节水相的pH至2.0～2.5。
步骤(2)中，在两级错流反萃取中，第一级错流反萃取和第二级错流反萃取中，反萃剂磷酸缓冲液的用量比为2：1。此时反萃取效率最好，萃余相中的利福霉素B效价最低，利福霉素B收率最高。且在尝试进行第三次重复错流反萃取实验时，利福霉素B的收率仅提高0.7％，不具备经济价值。
步骤(3)中，冷冻温度为-10～5℃,结晶时间为30min～2h。其中，优选冷冻温度为-5℃，此时单位质量的利福霉素B的能耗最低。
步骤(3)中，离心时，转速为3000～8000rpm，时间为5～20min；优选转速为5000rpm，时间为8min，离心温度为0～10℃。
步骤(3)中，离心所用离心机为卧螺离心机。经试验发现，在转速为8000rpm，时间为5min即可达到离心效果，但是能耗高；在转速为4000rpm时，需要离心20min才可以有效分离晶体了有机相。且发明人尤其发现，在离心转速为5000rpm，离心时间为8min时，离心效率更高，能耗更低。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1、采用上述工艺，即可批量稳定生产高浓度、高效价的利福霉素B产品，且产品质量稳定，利福霉素B的总回收率在95％以上。
2、该工艺对新设备和传统工艺的参数做了大量的优化工作，得到最优的生产工艺参数，保证了生产的高效节能的运行，同时产品的品质较高。该生产工艺比较节能，相比较传统生产工艺，自动化程度高，可节省50％的人工费用，经济效益显著。
3、用陶瓷微滤过滤发酵液或发酵液板框清液，可以去除大量的大分子蛋白和菌体细胞碎片，减少后期萃取工序段因蛋白等杂志造成的乳化层较多现象，提高萃取效率，提高利福霉素B的收率，并且，可以省去前端添加硫酸锌工序及后端破乳工序，降低生产成本，同时降低污染。
4、用超滤膜对利福霉素B微滤膜清液进行浓缩，有效提高利福霉素B浓度，进而提高利福霉素B单位效价，并进一步去除大分子蛋白等杂质，提高利福霉素B采用有机超滤膜过滤利福霉素B陶瓷膜微滤清液，可以进一步去除利福霉素B提取液中的小分子蛋白等杂质。
5、采用纳滤浓缩利福霉素B，可以有效浓缩利福霉素B，提高单位效价，大幅降低后续工段萃取剂和反萃剂的用量，节约大量成本，减少利福霉素B的过程损耗，提高收率。
6、生产工艺较为简单，流程较短，控制过程简单，人员劳动强度和使用量大大减少，产品质量控制稳定。
7、采用两级错流反萃取，相比传统工艺减少一级错流反萃取，可减少反萃剂的用量，同时也减少了后续乙酸乙酯的用量。
8、采用膜分离设备，减小了设备的占地面积，降低了基建成本。
9、采用冷冻结晶的方式生产利福霉素B，利福霉素B的品质更高，杂质更少。
10、将减压蒸馏得到的粗晶体重新萃取，利福霉素B的收率可以提高5％，且始终保证利福霉素B是通过冷冻结晶方式生产，保证利福霉素B的高品质。
附图说明
图1为本发明的利福霉素B提取的流程示意图。
具体实施方式
对照例：
以下示例为利福霉素B的传统生产工艺：
先将利福霉素B发酵液通过离心机离心，得到利福霉素B离心清液，收率为91％，该清液经过单级一次萃取、三级错流萃取、单级一次萃取后、结晶后，得到利福霉素B产品。其总产品收率为58％，纯度为87％。
实施例1
如图1所示，本发明所述利福霉素B提取的方法包括以下步骤：
A、陶瓷膜微滤：将产利福霉素B的发酵液或利福霉素B发酵液板框滤液通过陶瓷微滤膜过滤澄清，去除发酵液或板框滤液中的菌体、细胞碎片及大分子蛋白等杂质，得到的微滤膜清液，其中含有大量的利福霉素B；
B、有机卷式超滤膜过滤：用超滤膜过滤陶瓷微滤膜清液，将微滤膜清液中的小分子蛋白质进一步去除；
C、有机卷式纳滤膜浓缩：超滤膜清液通过有机卷式纳滤膜浓缩，得到利福霉素B浓缩液；
D、单级一次萃取：将得到的利福霉素B浓缩液加入稀硫酸调节到pH2.5，加乙酸丁酯萃取；
E、两级错流反萃取：将得到的乙酸丁酯相加入磷酸缓冲液调节pH至8.5进行两级错流反萃取
F、单级二次萃取：将得到的含利福霉素B的水相加稀硫酸调节pH至2.5，加乙酸乙酯进行二次萃取；
G、冷冻结晶：将得到的乙酸乙酯相冷冻、结晶，析出晶体；
H：离心：将得到的含晶体的乙酸乙酯相离心，得到利福霉素B晶体；
I：减压蒸馏结晶：再将得到的离心母液进行减压蒸馏结晶，得到利福霉素B粗产品；
J：利福霉素B单级萃取：将得到的利福霉素B粗产品返回到单级二次萃取工序段，继续萃取利福霉素B。
步骤A中所述的陶瓷膜微滤膜，膜孔径为200nm，温度为50℃，压力为0.3Mpa，膜面流速为4m/s。
步骤B中的有机卷式超滤膜，其截留分子量为20KD，温度为40℃，过滤压力为0.5Mpa。
步骤C中的有机卷式纳滤膜，其截留分子量为150Da，温度为40℃，过滤压力为1.2Mpa。
步骤E中的两级错流反萃取所采用的缓冲液为磷酸缓冲液，pH为8.5，第一级错流反萃取和第二级错流反萃取时，反萃剂加入量1:1。
步骤G中的冷冻结晶采用溶媒低温热交换方式，温度为-5℃，时间30min。
步骤H中的离心机采用卧螺离心机，其转速为8000rpm，时间为10min，温度为5℃。
经过该实施例最终得到的利福霉素B产品的纯度为99.2％，总收率为95.3％，反萃剂的消耗减少30％，在萃取时无乳化层形成，无需添加破乳剂。
实施例2
如图1所示，本发明所述利福霉素B提取的方法包括以下步骤：
A、陶瓷膜微滤：将产利福霉素B的发酵液或利福霉素B发酵液板框滤液通过陶瓷微滤膜过滤澄清，去除发酵液或板框滤液中的菌体、细胞碎片及大分子蛋白等杂质，得到的微滤膜清液，其中含有大量的利福霉素B；
B、有机卷式超滤膜过滤：用超滤膜过滤陶瓷微滤膜清液，将微滤膜清液中的小分子蛋白质进一步去除；
C、有机卷式纳滤膜浓缩：超滤膜清液通过有机卷式纳滤膜浓缩，得到利福霉素B浓缩液；
D、单级一次萃取：将得到的利福霉素B浓缩液加入稀硫酸调节到pH2.2，加乙酸丁酯萃取；
E、两级错流反萃取：将得到的乙酸丁酯相加入磷酸缓冲液调节pH至8.0进行两级错流反萃取
F、单级二次萃取：将得到的含利福霉素B的水相加稀硫酸调节pH至2.2，加乙酸乙酯进行二次萃取；
G、冷冻结晶：将得到的乙酸乙酯相冷冻、结晶，析出晶体；
H：离心：将得到的含晶体的乙酸乙酯相离心，得到利福霉素B晶体；
I：减压蒸馏结晶：再将得到的离心母液进行减压蒸馏结晶，得到利福霉素B粗产品；
J：利福霉素B单级萃取：将得到的利福霉素B粗产品返回到单级二次萃取工序段，继续萃取利福霉素B。
步骤A中所述的陶瓷膜微滤膜，膜孔径为50nm，温度为40℃，压力为0.35Mpa，膜面流速为5m/s。
步骤B中的有机卷式超滤膜，其截留分子量为50KD，温度为30℃，过滤压力为0.6Mpa。
步骤C中的有机卷式纳滤膜，其截留分子量为300Da，温度为30℃，过滤压力为1.2Mpa。
步骤E中的两级错流反萃取所采用的缓冲液为磷酸缓冲液，pH为8.0，第一级错流反萃取和第二级错流反萃取时，反萃剂加入量2:1。
步骤G中的冷冻结晶采用溶媒低温热交换方式，温度为-10℃，时间2h。
步骤H中的离心机采用卧螺离心机，其转速为5000rpm，时间为8min，温度为0℃。
经过该实施例最终得到的利福霉素B产品的纯度为99.5％，总收率为96.6％，反萃剂的消耗减少25％，在萃取时无乳化层形成，无需添加破乳剂，大幅降低生产成本。
实施例3
如图1所示，本发明所述利福霉素B提取的方法包括以下步骤：
A、陶瓷膜微滤：将产利福霉素B的发酵液或利福霉素B发酵液板框滤液通过陶瓷微滤膜过滤澄清，去除发酵液或板框滤液中的菌体、细胞碎片及大分子蛋白等杂质，得到的微滤膜清液，其中含有大量的利福霉素B；
B、有机卷式超滤膜过滤：用超滤膜过滤陶瓷微滤膜清液，将微滤膜清液中的小分子蛋白质进一步去除；
C、有机卷式纳滤膜浓缩：超滤膜清液通过有机卷式纳滤膜浓缩，得到利福霉素B浓缩液；
D、单级一次萃取：将得到的利福霉素B浓缩液加入稀硫酸调节到pH2.5，加乙酸丁酯萃取；
E、两级错流反萃取：将得到的乙酸丁酯相加入磷酸缓冲液调节pH至8.0进行两级错流反萃取
F、单级二次萃取：将得到的含利福霉素B的水相加稀硫酸调节pH至2.5，加乙酸乙酯进行二次萃取；
G、冷冻结晶：将得到的乙酸乙酯相冷冻、结晶，析出晶体；
H：离心：将得到的含晶体的乙酸乙酯相离心，得到利福霉素B晶体；
I：减压蒸馏结晶：再将得到的离心母液进行减压蒸馏结晶，得到利福霉素B粗产品；
J：利福霉素B单级萃取：将得到的利福霉素B粗产品返回到单级二次萃取工序段，继续萃取利福霉素B。
步骤A中所述的陶瓷膜微滤膜，膜孔径为500nm，温度为35℃，压力为0.3Mpa，膜面流速为5m/s。
步骤B中的有机卷式超滤膜，其截留分子量为500KD，温度为30℃，过滤压力为0.45Mpa。
步骤C中的有机卷式纳滤膜，其截留分子量为1000Da，温度为30℃，过滤压力为0.8Mpa。
步骤E中的两级错流反萃取所采用的缓冲液为磷酸缓冲液，pH为8.0，第一级错流反萃取和第二级错流反萃取时，反萃剂加入量1.5:1。
步骤G中的冷冻结晶采用溶媒低温热交换方式，温度为0℃，时间1h。
步骤H中的离心机采用卧螺离心机，其转速为4000rpm，时间为20min，温度为10℃。
经过该实施例最终得到的利福霉素B产品的纯度为98.7％，总收率为93.1％，反萃剂的消耗减少20％，在单级一次萃取时有乳化层形成，需添加4‰(w/v)的破乳剂。
实施例4
如图1所示，本发明所述利福霉素B提取的方法包括以下步骤：
A、陶瓷膜微滤：将产利福霉素B的发酵液或利福霉素B发酵液板框滤液通过陶瓷微滤膜过滤澄清，去除发酵液或板框滤液中的菌体、细胞碎片及大分子蛋白等杂质，得到的微滤膜清液，其中含有大量的利福霉素B；
B、有机卷式超滤膜过滤：用超滤膜过滤陶瓷微滤膜清液，将微滤膜清液中的小分子蛋白质进一步去除；
C、有机卷式纳滤膜浓缩：超滤膜清液通过有机卷式纳滤膜浓缩，得到利福霉素B浓缩液；
D、单级一次萃取：将得到的利福霉素B浓缩液加入稀硫酸调节到pH2.0，加乙酸丁酯萃取；
E、两级错流反萃取：将得到的乙酸丁酯相加入磷酸缓冲液调节pH至7.5进行两级错流反萃取
F、单级二次萃取：将得到的含利福霉素B的水相加稀硫酸调节pH至2.0，加乙酸乙酯进行二次萃取；
G、冷冻结晶：将得到的乙酸乙酯相冷冻、结晶，析出晶体；
H：离心：将得到的含晶体的乙酸乙酯相离心，得到利福霉素B晶体；
I：减压蒸馏结晶：再将得到的离心母液进行减压蒸馏结晶，得到利福霉素B粗产品；
J：利福霉素B单级萃取：将得到的利福霉素B粗产品返回到单级二次萃取工序段，继续萃取利福霉素B。
步骤A中所述的陶瓷膜微滤膜，膜孔径为5nm，温度为50℃，压力为0.55Mpa，膜面流速为4m/s。
步骤B中的有机卷式超滤膜，其截留分子量为20KD，温度为20℃，过滤压力为0.65Mpa。
步骤C中的有机卷式纳滤膜，其截留分子量为500Da，温度为20℃，过滤压力为1.0Mpa。
步骤E中的两级错流反萃取所采用的缓冲液为磷酸缓冲液，pH为8.0，第一级错流反萃取和第二级错流反萃取时，反萃剂加入量1:1.5。
步骤G中的冷冻结晶采用溶媒低温热交换方式，温度为-5℃，时间为1.5h。
步骤H中的离心机采用卧螺离心机，其转速为6000rpm，时间为10min，温度为6℃。
经过该实施例最终得到的利福霉素B产品的纯度为99.5％，总收率为95.2％，反萃剂的消耗减少32％，在单级一次萃取时有乳化层形成，需添加2‰(w/v)的破乳剂。
实施例5
如图1所示，本发明所述利福霉素B提取的方法包括以下步骤：
A、陶瓷膜微滤：将产利福霉素B的发酵液或利福霉素B发酵液板框滤液通过陶瓷微滤膜过滤澄清，去除发酵液或板框滤液中的菌体、细胞碎片及大分子蛋白等杂质，得到的微滤膜清液，其中含有大量的利福霉素B；
B、有机卷式超滤膜过滤：用超滤膜过滤陶瓷微滤膜清液，将微滤膜清液中的小分子蛋白质进一步去除；
C、有机卷式纳滤膜浓缩：超滤膜清液通过有机卷式纳滤膜浓缩，得到利福霉素B浓缩液；
D、单级一次萃取：将得到的利福霉素B浓缩液加入稀硫酸调节到pH2.3，加乙酸丁酯萃取；
E、两级错流反萃取：将得到的乙酸丁酯相加入磷酸缓冲液调节pH至8.0进行两级错流反萃取
F、单级二次萃取：将得到的含利福霉素B的水相加稀硫酸调节pH至2.5，加乙酸乙酯进行二次萃取；
G、冷冻结晶：将得到的乙酸乙酯相冷冻、结晶，析出晶体；
H：离心：将得到的含晶体的乙酸乙酯相离心，得到利福霉素B晶体；
I：减压蒸馏结晶：再将得到的离心母液进行减压蒸馏结晶，得到利福霉素B粗产品；
J：利福霉素B单级萃取：将得到的利福霉素B粗产品返回到单级二次萃取工序段，继续萃取利福霉素B。
步骤A中所述的陶瓷膜微滤膜，膜孔径为50nm，温度为40℃，压力为0.3Mpa，膜面流速为5m/s。
步骤B中的有机卷式超滤膜，其截留分子量为50KD，温度为30℃，过滤压力为0.6Mpa。
步骤C中的有机卷式纳滤膜，其截留分子量为300Da，温度为30℃，过滤压力为1.5Mpa。
步骤E中的两级错流反萃取所采用的缓冲液为磷酸缓冲液，pH为8.0，第一级错流反萃取和第二级错流反萃取时，反萃剂加入量2:1。
步骤G中的冷冻结晶采用溶媒低温热交换方式，温度为-5℃，时间为40min。
步骤H中的离心机采用卧螺离心机，其转速为5000rpm，时间为8min，温度为4℃。
经过该实施例最终得到的利福霉素B产品的纯度为99.1％，总收率为96.5％，反萃剂的消耗减少28％，在萃取时无乳化层形成，无需添加破乳剂，大幅降低生产成本。
Claims (7)
1.一种提取利福霉素B的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)将利福霉素B的发酵液或利福霉素B发酵液板框滤液依次经微滤膜过滤、超滤膜过滤和纳滤膜浓缩后，得到利福霉素B浓缩液；
(2)将步骤(1)中得到的利福霉素B浓缩液调节pH后用乙酸丁酯进行一次萃取，一次萃取完成后，取有机相并调节pH，进行两级错流反萃取；将反萃取所得水相调节pH后用乙酸丁酯进行二次萃取，得到含利福霉素B的乙酸丁酯相；
(3)将步骤(2)中所得的含利福霉素B的乙酸丁酯相冷冻、结晶并析出晶体后，将含晶体的乙酸丁酯相进行离心，得到利福霉素B晶体；离心所得液体经减压蒸馏结晶后，得到利福霉素B粗品，并加入步骤(2)中反萃取所得水相中，继续进行二次萃取。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的微滤膜为陶瓷微滤膜，膜孔径为2～500nm；过滤时，温度为10～60℃，压力为0.1～0.6Mpa，膜面流速为2～8m/s。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的超滤膜为有机卷式超滤膜，截留分子量为10～200KD；过滤时，温度为20～60℃，压力为0.1～2.0Mpa。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的纳滤膜为有机卷式纳滤膜，截留分子量为100～1000Da；过滤时，温度为20～60℃，压力为0.1～2.0Mpa。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，进行一次萃取时，步骤(1)中得到的利福霉素B浓缩液经硫酸水溶液调节pH至2.0～2.5；进行两级错流反萃取时，用磷酸缓冲液调节有机相的pH至7.5～8.5；进行二次萃取时，用硫酸水溶液调节水相的pH至2.0～2.5。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，冷冻温度为-10～5℃,结晶时间为30min～2h。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，离心时，转速为3000～8000rpm，时间为5～20min，离心温度为0～10℃。
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Non-Patent Citations (1)
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