CN107683143A - 治疗支气管肺发育不良的抗flt‑1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其提供用于治疗慢性肺病症、具体地说支气管肺发育不良(BPD)的方法和组合物。在一些实施方案中，根据本发明的方法包括向患有或易患BPD的个体施用有效量的抗Flt‑1抗体或其抗原结合片段，以使得BPD的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面降低或延迟发作。

Description

治疗支气管肺发育不良的抗FLT-1抗体
相关申请
本申请要求2015年4月7日提交的美国临时申请序列号62/144,247的优先权，所述临时申请的公开内容以引用的方式在此并入。
背景
支气管肺发育不良(BPD)是主要影响早产儿的严重慢性肺病。早产儿可在其肺已经由使用补充供氧和机械呼吸辅助损害之后发展BPD。患有BPD的婴儿在肺中具有炎症和瘢痕形成，并且在严重情况下，处于长期需要呼吸机或氧支持、肺动脉高压、复发性呼吸道感染、肺功能异常、运动不耐受、晚期神经发育病状以及甚至死亡的高风险。
许多患有BPD的婴儿随时间推移恢复并改善，然而，这些儿童处于发展其他并发症(包括哮喘和病毒性肺炎)的增加的风险。并且虽然大多数婴儿存活，但是一些患有非常严重的BPD的婴儿即使在数月护理后仍将死于所述疾病。
发明概述
本发明尤其提供用于基于抗Flt-1抗体疗法治疗慢性肺病症、具体地说支气管肺发育不良(BPD)的改进的方法和组合物。如下文实施例中所描述，本发明部分基于以下发现：抗Flt-1抗体或其抗原结合片段能够抑制VEGF和其他配体结合至Flt-1受体，从而增加可用于结合至VEGF受体的VEGF和/或其他配体的量。这种增加的结合可诱导促血管生成作用，所述促血管生成作用增加毛细血管密度并促进纤维化和炎症的减轻以及与BPD相关的症状和特征的缓解。实际上，如实施例中所示，本发明人已经证明，施用抗Flt-1抗体改善BPD动物模型中肺部病理学的测量。因此，本发明提供用于治疗BPD的安全且有效的基于抗体的治疗剂。
一方面，本发明提供治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自由以下组成的组：可变轻(VL)链CDR1，其由与SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；VL CDR2，其由与SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:24中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:34中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；可变重(VH)链CDR1，其由与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；VH CDR2，其由与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及VH CDR3，其由与SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
在一些实施方案中，一个或多个CDR包括VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQ IDNO:34中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及VH CDR3，其由与SEQ IDNO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
在一些实施方案中，一个或多个CDR包括VL CDR1，其由与SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:21中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；VL CDR2，其由与SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:24中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:34中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
在一些实施方案中，一个或多个CDR包括VH CDR1，其由与SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:4中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；VH CDR2，其由与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及VH CDR3，其由与SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25的氨基酸序列定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:24的氨基酸序列定义的VL CDR1和VL CDR2，以及由SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列定义的VL CDR3。
在一些实施方案中，VL链包含分别由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32的氨基酸序列定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:15的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:16的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:18的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1和VH CDR3，以及由SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列定义的VH CDR2。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1和VH CDR3，以及由SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列定义的VH CDR2。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3。
另一方面，本发明提供治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，其中抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括：(i)轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:61中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列；和/或(ii)重链可变(VH)区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:48中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VL区包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，并且所述VH区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:89中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括：(i)轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:75至SEQ ID NO:86中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列；和/或(ii)重链，所述重链包含与SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:74中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链包含SEQID NO:76的氨基酸序列，并且所述重链包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：IgG、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、ScFv、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)。在一些实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是IgG。在一些实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是IgG1。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，所述人源化单克隆抗体含有人Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区含有增强Fc区与FcRn受体之间的结合亲和力以使得抗体的体内半衰期延长的一个或多个突变。
在一些实施方案中，Fc区含有在对应于人IgG1的Leu 234、Leu 235和/或Gly 237的位置处的一个或多个突变。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段不结合至VEGFR2和/或VEGFR3。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段不结合至小鼠或猴Flt-1。
另一方面，本发明提供治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段识别包含以下氨基酸序列的肽或其片段，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:90的位置139至148、位置139至153、位置178至206、位置199至204以及位置128至138。在一些实施方案中，所述肽由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:90的位置130至138、位置141至148、位置141至153和位置193至206。
在一些实施方案中，个体是患有或易患BPD的婴儿。在一些实施方案中，个体怀有患有或易患BPD的胎儿。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段经胃肠外施用。在一些实施方案中，胃肠外施用选自静脉内、皮内、鞘内、吸入、经皮(局部)、眼内、肌内、皮下、肺部递送和/或经粘膜施用。在一些实施方案中，胃肠外施用是静脉内施用。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段经口服施用。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段每两月一次、每月一次、每三周一次、每两周一次、每周一次、每日一次或以可变时间间隔施用。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段被递送至选自肺和心脏的一种或多种靶组织。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段被递送至肺。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段被递送至心脏。
在一些实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段引起相对于对照，健康肺组织的生长、肺炎症减轻、肺泡生成增加、血管生成增加、肺血管床的结构改善、肺瘢痕形成减少、肺生长改善、呼吸功能不全减少、运动耐受性改善、不良神经学结果减少和/或肺功能改善。
在一些实施方案中，本发明提供一种方法，所述方法还包括共同施用至少一种选自以下的另外药剂或疗法：表面活性剂、氧疗法、呼吸机疗法、类固醇、维生素A、吸入一氧化氮、高热量营养制剂、利尿剂和/或支气管扩张剂。
如本申请中使用，术语“约”和“大约”可作为等效形式使用。在本申请中与或不与约/大约一起使用的任何数字意欲涵盖由相关领域普通技术人员了解的任何正常波动。
本发明的其他特征、目的和优点在以下详细说明中是显而易知的。然而，应了解，详细说明虽然指示本发明的实施方案，但是仅通过说明给出，而不具有限制性。本发明范围内的各种变化和修改将从详细说明对本领域技术人员变得显而易知。
定义
为了更容易地理解本公开，以下首先对某些术语进行定义。对于以下术语和其他术语的另外的定义在整个说明书中列出。
亲和力：如本领域中所已知，“亲和力”是特定配体结合至其配偶体的紧密性的度量。在一些实施方案中，所述配体或配偶体是Flt-1。在一些实施方案中，所述配体或配偶体是可溶性Flt-1。在一些实施方案中，所述配体或配偶体是重组Flt-1。在一个具体实施方案中，所述配体或配偶体是人sFlt-1。在一个具体实施方案中，所述配体或配偶体是重组sFlt-1。在其他实施方案中，所述配体或配偶体是抗Flt-1抗体。亲和力可以不同方式来测量。在一些实施方案中，亲和力通过定量测定来测量。在一些此类实施方案中，结合配偶体浓度可以被固定为超过配体浓度，以便模拟生理条件。或者或另外，在一些实施方案中，结合配偶体浓度和/或配体浓度可以改变。在一些此类实施方案中，可以将亲和力与可比较条件(例如浓度)下的参考进行比较。
亲和力成熟(或亲和力成熟抗体)：如本文所用，术语“亲和力成熟”或“亲和力成熟抗体”是指在其一个或多个CDR中具有一个或多个变化的抗体，所述变化引起与不具有那些变化的亲本抗体相比，所述抗体对抗原的亲和力提高。在一些实施方案中，亲和力成熟抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟抗体可通过本领域中已知的多种程序中的任一种产生。Marks等，BioTechnology10:779-783(1992)描述通过VH和VL结构域改组进行亲和力成熟。对CDR和/或框架残基的随机诱变由以下文献描述:Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.91:3809-3813(1994)；Schier等，Gene 169:147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins等，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆。
抗体：如本文所用，术语“抗体”是指任何免疫球蛋白，不论天然的或全部或部分合成产生的。维持特异性结合能力的其所有衍生物也包括在所述术语中。所述术语也涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的任何蛋白质。此类蛋白质可源于天然来源或部分或全部合成产生。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是任何免疫球蛋白同种型的成员，包括任何人同种型：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在某些实施方案中，抗体可以是IgG免疫球蛋白类别的成员(例如，IgG1、IgG2、IgG3等)。在一些实施方案中，抗体可以是人抗体。在一些实施方案中，抗体可以是人源化抗体。
如本领域普通技术人员所已知，在自然界中产生的抗体通常包含四条多肽链，通过二硫键互连的两条重(H)链和两条轻链(L)链。每条重链和轻链由可变区(分别在本文中缩写为HCVR、VH或VH和LCVR、VL或VL)和恒定区组成。重链的恒定区包含CH1、CH2和CH3结构域(以及任选地在IgM和IgE的情况下，CH4结构域)。轻链的恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区还含有称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其按以下列顺序从氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的结合区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q)。
抗原结合蛋白：如本文所用，术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的保留特异性地结合至抗原(例如，Flt-1)的能力的一个或多个片段或部分。抗原结合部分的实例包括(i)Fab片段，一种由VH、VL、CH1和CL结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)包含单个可变结构域的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；(vii)Fab'片段，其基本上是具有铰链区的一部分的Fab；(viii)纳米抗体，含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VH和VL)由单独基因编码，但它们可使用重组方法由合成接头接合，所述接头能够使它们制成其中VH和VL区配对以形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等，(1988)Science 242:423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。抗体的抗原结合片段可任选地包括单链抗体片段。或者或另外，抗体的抗原结合片段可包括例如通过二硫键连接在一起的多个链。抗体的抗原结合片段可任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸，并且更通常包含至少约200个氨基酸。
在一些实施方案中，抗体片段含有亲本抗体的足够序列，在所述亲本抗体中所述抗体片段是与所述亲本抗体结合至相同抗原的片段；在一些实施方案中，片段以与亲本抗体可比较的亲和力结合至所述抗原和/或与亲本抗体竞争结合至所述抗原。
本领域技术人员将理解，术语“抗体片段”并不意味着并且不限于任何特定的产生模式。可通过使用任何适当的方法产生抗体片段，包括但不限于完整抗体的裂解、化学合成和重组产生。以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
改善：如本文所用，术语“改善”是指预防、减轻或缓解受试者的状态或所述状态的改善。改善包括但不要求疾病病状的完全恢复或完全预防。
大约或约:如本文所用，在应用于一个或多个目标值时，术语“大约”或“约”是指类似于所阐述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所阐述的参考值的任一方向上的(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围，除非另外说明或以另外的方式从上下文显而易见(除了这样的数值将超过可能值的100％的情况)。
与……关联：如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体的存在、水平和/或形式相关，则两个事件或实体彼此“关联”，如所述术语在本文中所用。例如，如果特定实体(例如，多肽)的存在、水平和/或形式与特定疾病、病症或/或病状的发生率和/或易感性相关(例如，跨相关群体)，则认为所述特定实体与所述疾病、病症或病状关联。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，则它们是彼此物理上“关联的”，以使得它们为且保持彼此物理接近。在一些实施方案中，彼此物理上关联的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，彼此物理上关联的两个或更多个实体不是彼此共价连接的，而是例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合非共价缔合的。
生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”是指在生物系统且具体地说生物体中具有活性的任何药剂的特征。例如，在向生物体施用时对所述生物体具有生物作用的药剂被认为具有生物活性。在肽具有生物活性的具体实施方案中，所述肽的共享肽的至少一种生物活性的一部分通常称为“生物活性”部分。在某些实施方案中，不具有固有生物活性、但是抑制一种或多种VEGF配体的结合的肽被认为具有生物活性。
载体或稀释剂:如本文所用，术语“载体”和“稀释剂”是指对制备药物制剂有用的药学上可接受的(例如，对于向人施用来说安全且非毒性的)载体或稀释性物质。示例性稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。
嵌合抗体：如本文所用，是指其氨基酸序列包含在第一物种中发现的VH和VL区序列以及在与第一物种不同的第二物种中发现的恒定区序列的抗体。在许多实施方案中，嵌合抗体具有与人恒定区连接的鼠VH和VL区。在一些实施方案中，具有与非人恒定区(例如，小鼠恒定区)连接的人VH和VL区的抗体被称为“逆嵌合抗体”。
CDR：如本文所用，是指抗体可变区内的互补决定区。在重链和轻链的各可变区中存在三个CDR，其被指定为各可变区的CDR1、CDR2和CDR3。“一组CDR”或“CDR组”是指在能够结合抗原的单个可变区中存在的三个或六个CDR的组或能够结合抗原的同源重链和轻链可变区的CDR。本领域中已经确立了用于限定CDR边界的某些系统(例如，Kabat、Chothia等)；本领域的技术人员了解这些系统之间的差异，并且能够在理解和实践所要求保护的发明所需的程度上理解CDR边界。
剂型：如本文所用，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的治疗性蛋白(例如，抗体)的物理离散单位。每个单位含有经计算产生所需治疗作用的预定量的活性物质。然而，将理解的是，组合物的总剂量将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。
功能障碍：如本文所用，术语“功能障碍”是指异常功能。分子(例如，蛋白质)的功能障碍可由与这种分子相关的活性的增加或减少引起。分子的功能障碍可由与分子本身或与与分子直接或间接相互作用或调节分子的其他分子相关的缺陷引起。
表位：如本文所用，包括由免疫球蛋白(例如抗体、其抗体片段、受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团组成。在一些实施方案中，当抗原采用相关的三维构象时，此类化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采用这种构象时，此类化学原子或基团在空间中物理上彼此接近。在一些实施方案中，当抗原采用替代构象(例如，线性化)时，至少一些此类化学原子或基团彼此物理上分离。
Fc区：如本文所用，术语“Fc区”是指两个“Fc多肽”的二聚体，每个“Fc多肽”包含抗体中排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的恒定区。在一些实施方案中，“Fc区”包括通过一个或多个二硫键、化学接头或肽接头连接的两个Fc多肽。“Fc多肽”是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且还可包含这些结构域的N末端的柔性铰链的部分或全部。对于IgG，“Fc多肽”包含免疫球蛋白结构域Cgamma2(Cγ2)和Cgamma3(Cγ3)，以及Cgamma1(Cγ1)与Cγ2之间的铰链的下部。虽然Fc多肽的边界可变化，但人IgG重链Fc多肽通常被定义为包含起始于T223或C226或P230至其羧基末端的残基，其中编号是根据Kabat等，(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Services,Springfield,VA)中的EU索引。对于IgA，Fc多肽包含免疫球蛋白结构域Calpha2(Cα2)和Calpha3(Cα3)，以及Calpha1)(Cα1)与Cα2之间的铰链的下部。Fc区可以是合成的、重组的、或产生自天然来源如IVIG。
框架或框架区：如本文所用，是指可变区减去CDR的序列。因为CDR序列可通过不同的系统确定，所以框架序列同样受到相应的不同解释。六个CDR也将重链和轻链上的框架区分成各链上的四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDRl位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，并且CDR3位于FR3与FR4之间。在不将特定子区域指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如其他所提及的框架区表示单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。如本文所用，FR表示四个子区域中的一个，FR1例如表示最靠近可变区域的氨基末端和相对于CDR1的5'的第一框架区域，并且FR表示构成框架区域的两个或更多个子区域。
功能等效物或衍生物：如本文所用，术语“功能等效物”或“功能衍生物”在氨基酸序列的功能衍生物的背景下表示保留基本上类似于原始序列的生物活性的生物活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等效物可以是天然衍生物或合成制备的。示例性功能衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，条件是蛋白质的生物活性是保守的。取代氨基酸期望地具有与所取代的氨基酸的化学-物理性质类似的化学-物理性质。合乎需要的类似化学-物理性质包括电荷、体积、疏水性、亲水性等方面的相似性。
融合蛋白：如本文所用，术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是指通过连接两种或更多种原始分离的蛋白质或其部分产生的蛋白质。在一些实施方案中，每个蛋白质之间将存在接头或间隔区(spacer)。
半衰期：如本文所用，术语“半衰期”是诸如蛋白质浓度或活性的量下降至其在一段时间开始时测量的值的一半所需的时间。
人抗体：如本文所用，意图包括具有自人免疫球蛋白序列产生(或组装)的可变区和恒定区的抗体。在一些实施方案中，尽管抗体(或抗体组分)的氨基酸序列包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的残基或元件(例如，包含例如可能(最初)已经通过体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的序列变异)，例如在一个或多个CDR中且特别是CDR3中，但是所述抗体(或抗体组分)可被认为是“人的”。
人单克隆抗体：如本文所用，意图是指具有可变区、展示单一结合特异性的抗体，其中框架区和CDR区两者均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，所述细胞具有融合至永生化细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
人源化：如本领域中所已知，术语“人源化”通常用于指其氨基酸序列包含来自在非人物种(例如，小鼠、美洲驼)中产生的参考抗体的VH和VL区序列的抗体(或抗体组分)，而且包括相对于参考抗体的那些序列中的修饰，意图使它们更“类似于人”，即更类似于人种系可变序列。在一些实施方案中，“人源化”抗体(或抗体组分)是免疫特异性地结合至目标抗原并且拥有具有基本上如人抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的框架(FR)区和具有基本上如非人抗体(例如，小鼠、美洲驼)的氨基酸序列的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体(或抗体组分)。人源化抗体包含至少一个且通常两个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体免疫球蛋白)的那些CDR区且所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。在一些实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可包含重链恒定区的CH1、铰链、CH2、CH3以及任选地CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化VL区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化VH区。在一些特定实施方案中，人源化抗体含有人源化VH和VL区。
肥大：如本文所用，术语“肥大”是指由于其组分细胞的增大所致的器官或组织的体积增加。
改进、增加或减少：如本文所用，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等效物指示相对于基线测量值，如在开始本文所述治疗之前的同一个体中的测量值，或不存在本文所述治疗时的对照受试者(或多个对照受试者)中的测量值的值。“对照受试者”是与所治疗受试者大约相同年龄的罹患与所治疗受试者相同形式疾病的受试者。
抑制：如本文所用，术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibit)”和“抑制(inhibiting)”是指减少或降低目标蛋白质或基因的活性和/或表达的过程或方法。通常，抑制蛋白质或基因是指使蛋白质或基因的表达或相关活性降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多，或表达或相关活性降低大于1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多，如通过本文描述或本领域公认的一种或多种方法所测量。
体外：如本文所用，术语“体外”是指发生在人工环境中，例如试管或反应容器中、细胞培养物等中、而不是多细胞生物体内的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体，如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的背景下，所述术语可用于指在活细胞(与例如体外系统相反)内发生的事件。
分离的抗体：如本文所用，术语“分离的抗体”意图指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性地结合至Flt-1的分离的抗体)。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
Ka：如本文所用，是指具体抗体-抗原相互作用的缔合速率；而如本文所用的术语“Kd”意图指具体抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“KD”意图指解离常数，其获自Kd与Ka的比值(即，Kd/Ka)并且被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可使用本领域完善建立的方法来确定。用于确定抗体的KD的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选地使用生物传感器系统，如系统。
轻链改组：如本文所用，术语“轻链改组”意图指重链序列保持恒定并产生轻链序列的文库的亲和力成熟步骤。针对重链筛选轻链文库以鉴定具有提高的结合亲和力的抗体。提高的结合亲和力可在纳摩尔或皮摩尔范围内。
接头：如本文所用，术语“接头”是指在融合蛋白中，除在天然蛋白中的特定位置处出现的氨基酸序列之外的氨基酸序列，并且通常被设计为柔性或插入两个蛋白质部分之间的结构，如α螺旋。接头还被称为间隔区。接头或间隔区自身通常不具有生物学功能。
单克隆抗体：如本文所用，术语“单克隆抗体”意图指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位展现出单一结合特异性和亲和力。
药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的物质。
多肽：如本文所用，术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的氨基酸的连续链。所述术语用来指具有任何长度的氨基酸链，但是本领域普通技术人员将理解所述术语不限于冗长的链并且可指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员所已知，多肽可经加工和/或修饰。
预防：如本文所用，术语“预防(prevent)”或“预防(prevention)”在与疾病、病症和/或病状的发生结合使用时是指降低发展所述疾病、病症和/或病状的风险。参见“风险”的定义。
蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指充当离散单元的一个或多个多肽。如果单个多肽为离散的功能单元并且不要求与其他多肽永久性或暂时性的物理缔合以便形成离散的功能单元，则术语“多肽”和“蛋白质”可以可互换地使用。如果离散的功能单元包含多于一个彼此物理缔合的多肽，则术语“蛋白质”是指物理连接并且一起充当离散单元的多个多肽。
风险：如将从上下文所理解，疾病、病症和/或病状的“风险”包括特定个体将发展疾病、病症和/或病状(例如BPD)的可能性。在一些实施方案中，风险被表示为百分比。在一些实施方案中，风险是从0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％直至100％。在一些实施方案中，风险被表示为相对于与参考样品或一组参考样品相关的风险的一种风险。在一些实施方案中，参考样品或一组参考样品具有疾病、病症、病状和/或事件(例如，BPD)的已知风险。在一些实施方案中，参考样品或一组参考样品来自与具体个体可比较的个体。在一些实施方案中，相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。
选择性结合：如本文所用，“选择性结合”、“选择性地结合”、“特异性结合”或“特异性地结合”是指关于结合部分和靶标，结合部分与靶标而不是与不为靶标的实体的优先结合。结合部分和非靶标之间可能发生一定程度的非特异性结合。在一些实施方案中，如果与结合部分与非靶标的结合相比，所述结合部分与靶标之间的结合大于2倍、大于5倍、大于10倍或大于100倍，则所述结合部分选择性地结合所述靶标。在一些实施方案中，如果结合亲和力小于约10-5M、小于约10-6M、小于约10-7M、小于约10-8M或小于约10-9M，则结合部分选择性地结合靶标。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指送至医疗服务提供者以诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可罹患或易患疾病或病症但是可显示或可不显示所述疾病或病症的症状。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现总体或接近总体范围或程度的目标特征或特性的定性情况。生物领域的普通技术人员将了解生物和化学现象很少(如果曾发生)达到完全和/或进行至完全或达成或避免绝对结果。因此，本文使用术语“基本上”来获得在许多生物现象和化学现象中固有的潜在完全性缺乏。
基本同源性：如本文所用，短语“基本同源性是指氨基酸序列或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解，如果两个序列在对应位置含有同源残基，则所述两个序列通常被认为是“基本上同源的”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是将具有适当相似的结构和/或功能特征的不相同的残基。例如，如本领域普通技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或为具有“极性”或“非极性”侧链。用一个氨基酸取代同一类型的另一个氨基酸通常可被认为是“同源”取代。
如本领域所熟知的，氨基酸序列或核酸序列可使用各种算法中的任一种进行比较，所述算法包括在商业计算机程序中可用的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul等，basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等，Methods in Enzymology；Altschul等，"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generationof protein database search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997；Baxevanis等，Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes andProteins,Wiley,1998；以及Misener等(编)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第132卷),Humana Press,1999。除了鉴定同源序列之外，上述程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关段残基上同源，则所述两个序列被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，所述相关段是完整序列。在一些实施方案中，所述相关段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。
基本同一性：如本文所用，短语“基本同一性”用于指氨基酸序列或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将理解，如果两个序列在对应位置含有相同残基，则所述两个序列通常被认为是“基本上相同的”。如本领域所熟知的，氨基酸序列或核酸序列可使用各种算法中的任一种进行比较，所述算法包括在商业计算机程序中可用的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN以及用于氨基酸序列的BLASTP、空位BLAST和PSI-BLAST。示例性此类程序描述于Altschul等，Basic local alignment search tool,J.Mol.Biol.,215(3):403-410,1990；Altschul等，Methods in Enzymology；Altschul等，Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,1997；Baxevanis等，Bioinformatics:A Practical Guide to theAnalysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；以及Misener等(编)，BioinformaticsMethods and Protocols(Methods in Molecular Biology,第132卷),Humana Press,1999。除了鉴定相同序列之外，上述程序通常提供同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的对应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关段残基上相同，则所述两个序列被认为是基本上相同的。在一些实施方案中，所述相关段是完整序列。在一些实施方案中，所述相关段是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个残基。
患有：“患有”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断具有或展现所述疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
表面等离子体共振：如本文所用，是指允许例如通过使用Biacore系统(PharmaciaBiosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来实时分析特异性结合相互作用的光学现象。关于进一步描述，参见Jonsson,U.等，(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；Jonsson,U.等，(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.等，(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；以及Johnnson,B.等，(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
易患：“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断患有所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体可不表现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施方案中，易患疾病、病症、病状或事件(例如，BPD)的个体可具有以下中的一个或多个特征：(1)与发展所述疾病、病症和/或病状相关的基因突变；(2)与发展所述疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；(3)与所述疾病、病症和/或病状相关的蛋白质的表达和/或活性增加和/或减少；(4)与发展所述疾病、病症、病状和/或事件相关的习惯和/或生活方式；(5)已经经历、计划经历或需要移植。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将不发展所述疾病、病症和/或病状。
靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗的疾病如BPD影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展现疾病相关病理学、症状或特征(包括但不限于肺炎症、肺瘢痕形成、肺生长受损、早期肺损伤、长期呼吸功能不全、肺部感染、运动不耐受和不良神经学结果)的那些组织。
治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”是指在施用至患有或易患疾病、病症和/或病状的受试者时足以治疗、诊断、预防所述疾病、病症和/或病状的症状和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将理解治疗有效量通常经由包括至少一个单位剂量的给药方案来施用。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment或treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓和、抑制、预防特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延迟其发作，降低其严重程度和/或降低其发生率的任何方法。为了降低发展与疾病相关的病理学的风险的目的，可向不显示所述疾病的病征和/或仅显示所述疾病的早期病征的受试者施用治疗。
某些实施方案的详细描述
本发明尤其提供用于基于使用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段作为用于治疗BPD的治疗剂来治疗慢性肺病症、具体地说支气管肺发育不良(BPD)的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供治疗BPD的方法，所述方法包括向患有或易患BPD的个体施用有效量的Flt-1抗体或其抗原结合片段，以使得BPD的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面降低或延迟发作。
本发明的各个方面在以下章节中详细描述。章节的使用并不意味着限制本发明。每个章节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外指出，否则使用“或”意味着“和/或”。
支气管肺发育不良(BPD)
通过引入表面活性剂疗法、母体类固醇、新型呼吸机策略、动脉导管未闭的侵入性管理、改善的营养和其他治疗，患有RDS的早产新生儿的临床过程和结果已在过去30年内发生了巨大变化。最近已经证明，大约三分之二的发展BPD的婴儿在出生时仅具有轻微呼吸窘迫。这表明肺损伤的发展时机是BPD病因学的关键因素。
与这种不断变化的流行病学和临床模式并行，BPD的肺组织学的关键特征也发生了变化。现在越来越多的认识到在早产后患有持续性肺病的婴儿在这种表面活性剂前(presurfactant)阶段期间具有与在死于BPD的婴儿中传统观察到的不同的临床过程和病理学。由于临床管理的变化，首次具有BPD的特征的经典进展阶段通常不存在，并且BPD已经从主要由急性肺损伤的严重程度定义改变为其当前特征描述，其主要由远端肺生长的破坏定义。因此，所谓的表面活性剂后时期的新BPD代表肺部发育的抑制与改变的肺结构、生长以及远端空腔和血管系统的功能。在生理上，这表明肺泡毛细血管表面积显著减少，从而潜在导致气体交换受损与运动不耐受、肺动脉高压和对急性呼吸道感染的较差耐受性的增加的风险。
BPD的发病机制
BPD代表在肺生长的关键期期间，即在小管期(在人中17至26周)期间(空腔分隔和血管发育显著增加的时间)肺对的损伤的反应。在一些实施方案中，增加早产新生儿对BPD发展的易感性的因素包括表面活性剂缺乏、抗氧化剂防御降低、上皮离子和水转运功能受损以及肺结构未成熟。在一些实施方案中，早产后肺损伤和随后的肺生长停止是由较差防御的发育肺的多种不良刺激(包括炎症、高氧、机械通气和感染)之间的复杂相互作用引起的。在一些实施方案中，由于母体绒毛膜羊膜炎所致的产前暴露于促炎性细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-8等)增强子宫内肺成熟，但增加了BPD的风险。
高氧和氧化应激是BPD发展的关键因素。在一些实施方案中，早产新生儿从正常胎儿的低氧张力环境向子宫外生存期的相对高氧的转变增加了BPD与肺泡化减少和畸形血管系统的风险。在一些实施方案中，氧环境中的过早变化阻碍正常上皮-间质相互作用并导致内皮细胞存活、分化和微血管系统组构的改变。在一些实施方案中，由于早产后缺乏足够的抗氧化剂，早产儿特别易受活性氧种类(ROS)诱导的损伤的影响。在一些实施方案中，抗氧化酶[例如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶]在妊娠晚期显著增加。在一些另外的实施方案中，响应于高氧增加抗氧化酶合成的能力在早产动物中降低，因此早产可在抗氧化剂的正常上调之前，其在早期产后生命期中持续存在。在一些实施方案中，内皮细胞和肺泡II型细胞对高氧和ROS诱导的损伤非常敏感，从而导致水肿增加、细胞功能障碍以及细胞存活和生长受损。
在一些实施方案中，即使在没有明显气压性损伤或容量损伤病征的情况下，用机械通气治疗早产新生儿引发并促进肺损伤伴随炎症和渗透性水肿，并且导致BPD。在一些实施方案中，呼吸机相关的肺损伤(VALI)由拉伸远端气道上皮和毛细血管内皮引起，其增加渗透性水肿、抑制表面活性剂功能并引起复杂的炎性级联。在一些实施方案中，即使短时期的正压通气(如在产房中的复苏期间)也可引起肺中的支气管上皮和内皮损伤，从而为进行性肺炎症和损伤奠定基础
无论在出生前(由绒毛膜羊膜炎)还是在早期产后期间(由于高氧或VALI)诱导的肺炎症在BPD的发展中起重要作用。在一些实施方案中，BPD的风险与气管流体嗜中性粒细胞计数、活化的巨噬细胞、高浓度的脂质产物、氧化剂灭活的α-1-抗胰蛋白酶活性和促炎性细胞因子(包括IL-6和IL-8)的持续增加以及IL-10水平降低相关。在一些实施方案中，由巨噬细胞释放早期反应细胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-8和TGF-β)以及可溶性粘附分子(即选择素)的存在可影响其他细胞释放化学引诱物，所述化学引诱物募集嗜中性粒细胞并扩大炎症反应。在一些实施方案中，在随后发展BPD的婴儿的生命的几小时内，促炎性细胞因子的浓度升高与减少的抗炎产物(即IL-10)结合出现在气管抽吸物中。在一些实施方案中，来自活化的嗜中性粒细胞的增加的弹性蛋白酶和胶原酶释放可直接破坏肺的弹性蛋白和胶原框架，并且可在患有BPD的婴儿的尿中回收胶原和弹性蛋白降解的标志物。在一些实施方案中，来自相对较低毒力生物体的感染(如解脲支原体的气道定殖)可增加炎症反应，从而进一步增加BPD的风险。在一些实施方案中，诸如营养缺乏和遗传因素(如分别维生素A和E缺乏或表面活性蛋白的单核苷酸多态性变体)的其他因素可能增加一些早产新生儿中BPD的风险。
BPD中的肺循环
除了对气道和远端空腔的不利作用外，急性肺损伤还损害早产后发育中肺循环的生长、结构和功能。在一些实施方案中，内皮细胞特别易受通过高氧或炎症引起的氧化损伤的影响。在一些实施方案中，小肺动脉的介质经历显著的变化，包括平滑肌细胞增殖、未成熟间充质细胞早熟成成熟平滑肌细胞以及成纤维细胞/肌成纤维细胞并入血管壁中。在一些实施方案中，肺血管系统中的结构变化通过缩窄血管直径和降低的血管顺应性而导致高肺血管阻力(PVR)。在一些实施方案中，除了这些结构变化之外，肺循环的特征进一步在于异常血管反应性，其也增加了PVR。在一些实施方案中，减少的血管生成可限制血管表面积，从而导致PVR的进一步升高，特别是响应于伴随运动或应激的高心输出量。
总体上，肺循环的早期损伤导致肺动脉高压的快速发展，这显著促成严重BPD的发病率和死亡率。在一些实施方案中，高死亡率在需要长期呼吸机支持的患有BPD和肺动脉高压的婴儿中发生。在一些实施方案中，肺动脉高压是更晚期BPD的标志物，并且升高的PVR还引起右心室功能不良、心输出量受损、氧输送受限、肺水肿增加以及可能更高的猝死风险。在一些实施方案中，BPD中肺循环的生理异常包括升高的PVR和异常血管反应性，如对急性缺氧的明显血管收缩反应所证明。在一些实施方案中，即使轻度缺氧也导致具有适度基础水平的肺动脉高压的婴儿的肺动脉压的显著升高。在一些实施方案中，高于92％-94％的氧饱和度的治疗水平有效地降低了肺动脉压。在一些实施方案中，降低肺动脉压或限制肺血管系统损伤的策略可限制BPD中肺动脉高压的随后发展。
最后，肺动脉高压和右心功能仍然是患有BPD的婴儿中的主要临床关注。在一些实施方案中，BPD中的肺血管疾病还包括由于受损的生长导致的肺动脉密度降低，这导致气体交换受损的生理异常以及BPD的实际发病机制。在一些实施方案中，受损的血管生成阻碍肺泡化，并且保护和增强内皮细胞存活、生长和功能的策略提供了用于预防BPD的治疗方法。
BPD中血管生成因子的改变的信号传导
多生长因子和信号传导系统在正常肺血管生长中起重要作用。在一些实施方案中，过早递送和氧张力、炎性细胞因子和其他信号的变化改变正常生长因子表达和信号传导，且由此改变肺/肺血管发育。在一些实施方案中，生长因子是VEGF。受损的VEGF信号传导一直与临床环境中BPD的发病机制相关。在一些实施方案中，发现VEGF在来自随后发展BPD的早产新生儿的气管流体样品中比来自未发展慢性肺病的早产新生儿的气管流体样品中更低(185)。在一些实施方案中，高氧下调肺VEGF表达，并且VEGF信号传导的药理学抑制损害肺血管生长并抑制肺泡化。导致血管生长减少和肺泡化受损的VEGF信号传导受损的生物学基础已经充分建立。
血管生长和肺泡化
如上所述，气道与血管之间生长的密集协调是正常肺发育所必需的。在一些实施方案中，在肺生长的关键时期(发育的囊状或肺泡阶段)期间肺血管生长的衰竭减少分隔并且最终导致具有BPD的特征的肺发育不良。在一些实施方案中，血管生成涉及在肺发育期间的肺泡化中，并且损伤和抑制肺血管生长的机制可阻碍早产后的肺泡生长。在一些实施方案中，在产后肺生长的关键时期期间抑制肺血管生长损害肺泡化。
Flt-1受体
Flt-1受体(也称为血管内皮生长因子受体1)是由FLT1基因编码的受体。信号糖蛋白的血管内皮生长因子(VEGF)家族在胚胎发生和产后生长中充当血管生成的潜在启动子。具体地说，VEGF-A配体与VEGF受体的结合已经显示促进血管渗透性并且还引发内皮细胞迁移、增殖和存活，并且新形成的内皮细胞提供新的血管系统的基本结构。对于血管形成的主要VEGF信号分子VEGF-A通过VEGF受体-1(VEGFR-1，也称为Flt-1)和VEGF受体-2(VEGFR-2，也称为Flk-1)介导其信号。Flt-1的可溶性形式(sFlt-1)也存在，但缺乏细胞内信号传导结构域且因此被认为仅通过螯合VEGF-A或与其结合的其他配体以调控能力作用。sFlt-1和不与细胞内信号转导途径相关的其他含Flt-1结合位点的分子被称为“诱饵受体”。Flt-1和Flk-1受体含有细胞外VEGF-A结合结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域，并且在成血血管细胞和内皮细胞谱系中的发育阶段和组织再生期间均显示表达。与Flk-1相比，Flt-1对VEGF-A具有大约10倍的结合亲和力(Kd约2-10pM)，但较弱酪氨酸激酶结构域表明VEGF-A与Flt-1结合后的血管生成信号转导比Flk-1信号相当弱。因此，纯合Flt-1基因敲除小鼠在胚胎期死于内皮细胞过度产生和血管组织破坏。相反，纯合Flk-1基因敲除小鼠死于由于胚胎发生期间缺乏卵黄囊血岛形成所致的组织化血管发育的缺陷。Flt-1和Flk-1受体两者均是正常发育所需的，但是VEGF-A浓度的选择性增加可允许与Flk-1受体的更大结合并且诱导增加毛细血管密度并促进纤维化和炎症的减轻以及与BPD相关的症状和特征的缓解的促血管生成作用。
如本文所用，术语“Flt-1受体”是指可溶性和膜相关Flt-1受体两者或其功能片段。
抗Flt-1抗体
如本文所用，术语“抗Flt-1抗体”是指结合至Flt-1受体(例如，可溶性或膜相关Flt-1受体)的任何抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，产生以高亲和力结合至Flt-1受体的抗Flt-1抗体。不希望受理论束缚，据信结合至Flt-1受体的抗Flt-1抗体抑制一种或多种内源性配体结合至Flt-1，且由此允许更多量的可用配体与其他VEGF受体如Flk-1受体缔合。Flk-1受体的增加的活化可增加毛细血管密度并促进纤维化和炎症的减轻以及与BPD相关的症状和特征的缓解。在一些实施方案中，结合至Flt-1受体的抗体增加可用于结合至其他VEGF受体的VEGF的量。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包含表1中提供的序列。
表1.
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自由以下组成的组：VL CDR1，其由与SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；VLCDR2，其由与SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:24中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:34中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；VH链CDR1，其由与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；VH CDR2，其由与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；以及VH CDR3，其由与SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义。在一些实施方案中，VH CDR3不是SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，VL CDR3不是SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，所述一个或多个CDR包括VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQID NO:34中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；以及VH CDR3，其由与SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义。在一些实施方案中，VH CDR3不是SEQ IDNO:15。在一些实施方案中，VL CDR3不是SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，所述一个或多个CDR包括VL CDR1，其由与SEQ ID NO:19至SEQID NO:21中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；VL CDR2，其由与SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:24中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；以及VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQ IDNO:34中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义。在一些实施方案中，VL CDR3不是SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，所述一个或多个CDR包括VH CDR1，其由与SEQ ID NO:1至SEQID NO:4中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；VH CDR2，其由与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义；以及VH CDR3，其由与SEQ ID NO:15至SEQ IDNO:18中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列定义。在一些实施方案中，VH CDR3不是SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25的氨基酸序列定义的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列定义的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24的氨基酸序列定义的VL CDR1和VLCDR2，以及由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列定义的VLCDR3。在一个具体实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含由SEQ ID NO:21的氨基酸序列定义的VL CDR1、由SEQ ID NO:24的氨基酸序列定义的VLCDR2以及由SEQ ID NO:32的氨基酸序列定义的VL CDR3。在一些实施方案中，VL CDR3不是SEQ ID NO:25。
在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:15的氨基酸序列定义的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:16的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:18的氨基酸序列定义的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1和VHCDR3，以及由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列定义的VH CDR2。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1和VH CDR3，以及由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列定义的VH CDR2。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在一个具体实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含由SEQ ID NO:3的氨基酸序列定义的VH CDR1、由SEQ ID NO:12的氨基酸序列定义的VH CDR2以及由SEQID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR3。在一些实施方案中，VH CDR3不是SEQ ID NO:15。
在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括轻链VL区，所述轻链VL区包含与SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:61中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；和/或重链VH区，所述重链VH区包含与SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:48中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述VL区包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，并且所述VH区包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:89中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链VL区不是SEQ ID NO:49。在一些实施方案中，重链VH区不是SEQ ID NO:35。
在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:75至SEQ ID NO:86中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列；和/或重链，所述重链包含与SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:74中的任一个具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述轻链包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且所述重链区包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的重链包含氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHSELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYSASWVRQAPGKGLEWVSAISWSGDSTYYAESVKGRFTIFRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWATPIESLYYYGSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKX(SEQ ID NO:108)。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的重链包含氨基酸序列ELQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYSASWVRQAPGKGLEWVSAISWSGDSTYYAESVKGRFTIFRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSWATPIESLYYYGSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:109)。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的轻链包含氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHSSYELTQPLSVSVALRQAAKITCGGNNIGSQTAQWYQQKPGQAPVLVIYANNRRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDASTQAIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSX(SEQ ID NO:110)。
在一些实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:109的重链以及SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:76的轻链。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合人Flt-1的亲和力大于约10-7M、大于约0.5x 10-7、大于约10-8、大于约0.5x10-8、大于约10-9M、大于约0.5x 10-9、大于约10-10M、大于约0.5x10-10M、大于约10-11M、大于约0.5x 10-11M、大于约10-12M或大于约0.5x10-12M。在其他实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至小鼠Flt-1的亲和力大于约10-7M、大于约0.5x 10-7、大于约10-8、大于约0.5x 10-8、大于约10-9M、大于约0.5x 10-9、大于约10-10M、大于约0.5x 10-10M、大于约10-11M、大于约0.5x 10-11M、大于约10-12M或大于约0.5x 10-12M。Flt-1抗体的亲和力可例如在表面等离子体共振测定，如BIACORE测定中进行测量。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的特征在于在与人Flt-1的竞争测定中，IC50低于约500pM、低于约400pM、低于约300pM、低于约200pM、低于约100pM、低于约50pM、低于约25pM、低于约10pM、低于约5pM或低于约1pM。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的特征在于在与小鼠Flt-1的竞争测定中，IC50低于约500pM、低于约400pM、低于约300pM、低于约200pM、低于约100pM、低于约50pM、低于约25pM、低于约10pM、低于约5pM或低于约1pM。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段抑制Flt-1受体处VEGF的结合和/或活性。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的特征在于在竞争测定中，对于VEGF与人Flt-1的结合的抑制，IC50低于约500pM、低于约400pM、低于约300pM、低于约200pM、低于约100pM、低于约50pM、低于约25pM、低于约10pM、低于约5pM或低于约1pM。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段与VEGF竞争结合可溶性Flt-1和或抑制VEGF与可溶性Flt-1的结合。在其他实施方案中，所述竞争和或抑制是以剂量依赖性方式。在具体实施方案中，VEGF与Flt-1的结合的抑制使得VEGF R2的磷酸化增加。不希望受理论约束，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段与Flt-1的结合抑制VEGF与Flt-1的结合。未结合的VEGF结合VEGF R2，这可通过测量VEGF R2的磷酸化来证明。在具体实施方案中，所述抗Flt-1抗体或抗原结合片段以剂量依赖性方式挽救VEGF R2磷酸化。例如，VEGF R2磷酸化可被挽救至少约100％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％或约5％。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段在生物测定中提供大于约95％、大于约90％、大于约85％、大于约80％、大于约75％、大于约70％、大于约65％、大于约60％、大于约55％、大于约50％、大于约45％、大于约40％、大于约35％、大于约30％、大于约25％、大于约20％、大于约15％或大于约10％挽救。在一个具体实施方案中，所述生物测定包括在sFlt-1和抗Flt-1抗体或其抗原结合片段存在下用VEGF刺激的人原代静脉内皮细胞(HUVEC)。可通过确定VEGF R2受体的磷酸化状态来测定VEGF诱导的细胞活化。在单独sFlt-1(例如没有抗Flt-1抗体)存在下，数据可被表示为相对于VEGF R2受体的磷酸化，VEGF R2受体的磷酸化的挽救百分比。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约200小时、大于约150小时、大于约100小时、大于约95小时、大于约90小时、大于约85小时、大于约80小时、大于约75小时、大于约70小时、大于约65小时、大于约60小时、大于约55小时、大于约50小时或大于约45小时以及其中的范围的半衰期。在一些实施方案中，在小鼠中测量半衰期。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约400ug/mL、大于375ug/mL、大于约350ug/mL、大于约325ug/mL、大于约300ug/mL、大于约275ug/mL、大于约250ug/mL、大于约225ug/mL、大于约200ug/mL、大于约175ug/mL、大于约150ug/mL、大于约125ug/mL、大于约100ug/mL、大于约75ug/mL或大于约50ug/mL以及其中的范围的最大血清浓度。在一些实施方案中，在小鼠中测量所述最大血清浓度。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结合Flt-1，并且与其他VEGF受体具有最小或无明显结合。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结合Flt-1，并且与VEGFR2(Flk-1)和/或VEGFR3(Flt-4)具有最小或无明显结合。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段当与人Flt-1结合时具有大于约1x 10-3M-1sec-1、大于约1x 10-4M-1sec-1、大于约1x 10-5M-1sec-1、大于约1x 10-6M-1sec-1或大于约1x 10-7M-1sec-1的ka。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段当与人Flt-1结合时具有大于约1x 10-3sec-1、大于约1x 10-4sec-1、大于约1x 10-5sec-1或大于约1x 10-6sec-1的kd。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段当与人Flt-1结合时具有大于约1x 10-8M、大于约1x 10-9M、大于约1x 10-10M、大于约1x 10-11M或大于约1x 10-12M的KD。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至可溶性Flt-1。在具体实施方案中，结合是剂量依赖性的，其中较高浓度的抗体或其抗原结合片段结合较大量的可溶性Flt-1。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约99％、大于约98％、大于约97％、大于约96％、大于约95％、大于约94％、大于约93％、大于约92％、大于约91％、大于约90％或大于约80％的人同一性百分比。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段具有大于约99％、大于约98％、大于约97％、大于约96％、大于约95％、大于约94％、大于约93％、大于约92％、大于约91％、大于约90％或大于约80％的人同源性百分比。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至Flt-1蛋白。在一些实施方案中，所述Flt-1蛋白是重组蛋白，例如重组sFlt-1。在一个具体实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合人Flt-1同种型1(NP_002010.2GI:156104876；SEQ IDNO:90)(表2)。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人Flt-1同种型X1(XP_011533316.1GI:767977511；SEQ ID NO:91)。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人Flt-1同种型2前体(NP_001153392.1GI:229892220；SEQID NO:92)。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人Flt-1同种型3前体(NP_001153502.1GI:229892300；SEQ ID NO:93)。在另一个实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至人Flt-1同种型4前体(NP_001153503.1GI:229892302；SEQ ID NO:94)。
在一些实施方案中，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至Flt-1蛋白的特定表位。例如，所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至如在表2中提供的氨基酸序列。
表2.
在一些实施方案中，在体内施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段产生至少约700ug/mL、至少约650ug/mL、至少约600ug/mL、至少约550ug/mL、至少约500ug/mL、至少约450ug/mL、至少约400ug/mL、至少约350ug/mL、至少约300ug/mL、至少约250ug/mL、至少约200ug/mL、至少约150ug/mL、至少约100ug/mL、至少约50ug/mL、至少约40ug/mL、至少约30ug/mL、至少约20ug/mL、至少约10ug/mL或至少约5ug/mL以及其中的范围的峰值血清抗体水平。在一些实施方案中，所述峰值血清抗体水平是剂量依赖性的。
在一些实施方案中，在体内施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段产生至少约450ug/mL、至少约400ug/mL、至少约350ug/mL、至少约300ug/mL、至少约250ug/mL、至少约200ug/mL、至少约150ug/mL、至少约100ug/mL、至少约50ug/mL或至少约25ug/mL以及其中的范围的谷值血清抗体水平。在一些实施方案中，所述谷值血清抗体水平是剂量依赖性的。
在一些实施方案中，在体内施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段产生与基线水平相比或与单独施用媒介物的受试者的水平相比，降低的可溶性Flt-1的血清水平。通常，就在施用前测量基线水平。在一些实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段使得与就在施用前可溶性Flt-1的基线血清水平相比，可溶性Flt-1的血清水平降低至少约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在一些实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段使得可溶性Flt-1的血清水平降低至小于约4000pg/mL、约3500pg/mL、约3000pg/mL、约2500pg/mL、约2000pg/mL、约1750pg/mL、约1500pg/mL、约1250pg/mL、约1000pg/mL、约900pg/mL、约800pg/mL、约700pg/mL、约600pg/mL、约500pg/mL、约450pg/mL、约400pg/mL、约350pg/mL、约300pg/mL、约250pg/mL、约200pg/mL、约150pg/mL、约100pg/mL、约50pg/mL或约10pg/mL以及其中的范围。在一些实施方案中，与未施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的受试者中的可溶性Flt-1的血清水平相比，施用所述抗体或其抗原结合片段产生降低的可溶性Flt-1的血清水平。在一些实施方案中，降低的可溶性Flt-1的血清水平是剂量依赖性的。
在一些实施方案中，在体内施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段使得与基线水平相比或与用单独媒介物处理的受试者的水平相比，VEGF的血清水平增加。通常，治疗前立即测量基线水平。在一些实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段使得与就在施用前VEGF的基线血清水平相比，VEGF的血清水平增加至少约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在一些实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段使得VEGF的血清水平增加至多于约500pg/mL、约450pg/mL、约400pg/mL、约350pg/mL、约300pg/mL、约250pg/mL、约200pg/mL、约150pg/mL、约100pg/mL、约50pg/mL或约25pg/mL以及其中的范围。在一些实施方案中，与未进行治疗的受试者中的VEGF的血清水平相比，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段产生增加的VEGF血清水平。在一些实施方案中，增加的VEGF血清水平是剂量依赖性的。
在一些实施方案中，在体内施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段使得肺组织的血管生成增加。在一些实施方案中，增加的血管生成通过内皮细胞标志物例如CD31的CD31染色增加来证明。在一些实施方案中，增加的染色可例如通过测量施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的大鼠的肺组织中的CD31阳性面积百分比来测量。例如，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的大鼠的肺组织中的CD31阳性面积百分比可以是总组织面积的至少约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％或约2.5％。在一个具体实施方案中，施用抗Flt-1抗体的大鼠的肺组织中的CD31阳性面积百分比可显著高于施用同种型对照抗体的大鼠的肺组织中的CD31阳性面积百分比。
在一些实施方案中，可例如通过测量施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的大鼠的肺组织中的标准化的CD31阳性百分比来测量内皮细胞标志物的增加的染色。在具体实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的大鼠的肺组织的CD31染色增加是相对于在施用同种型对照抗体的大鼠的肺组织中测量的CD31染色。例如，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的小鼠的肺组织中的标准化的CD31阳性百分比可以是至少约200％、约190％、约180％、约170％、约160％、约150％、约140％、约130％、约120％或约110％。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结合人Flt-1，并且与其他哺乳动物Flt-1受体具有最小或无明显结合(例如，结合亲和力小于10-7M或10-6M)。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结合人Flt-1并且不结合至猴Flt-1。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选择性地结合人Flt-1并且不结合至小鼠Flt-1。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合人Flt-1以及猴Flt-1。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合至食蟹猴Flt-1。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段结合人Flt-1以及小鼠Flt-1。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：IgG、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、ScFv、双抗体、三抗体和四抗体。
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是IgG。在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是IgG1。
工程改造的恒定区
在一些实施方案中，合适的抗Flt-1抗体含有结合至FcRn受体的Fc结构域或其部分。作为非限制性实例，合适的Fc结构域可源自免疫球蛋白亚类，如IgG。在一些实施方案中，合适的Fc结构域源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。特别合适的Fc结构域包括源自人或人源化抗体的那些。
预期Fc结构域与FcRn受体之间的改善的结合产生延长的血清半衰期。因此，在一些实施方案中，合适的Fc结构域(SEQ ID NO:104)包含导致与FcRn的结合改善的一个或多个氨基酸突变。影响与FcRn的结合改善的Fc结构域内的各种突变是本领域中已知的，并且可适于实践本发明。在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含在对应于人IgG1的Leu 234、Leu 235、Gly 237、Thr 250、Met 252、Ser 254、Thr 256、Thr 307、Glu 380、Met 428、His433和/或Asn 434的一个或多个位置处的一个或多个突变。
Fc结构域中的一些突变导致IgG与FcRn受体的结合减少，且由此抑制效应功能。在一些实施方案中，合适的Fc结构域包含在对应于人IgG1的Leu 234、Leu 235和Gly 237的一个或多个位置处的一个或多个突变。在一个具体实施方案中，Leu 234被突变为Ala。在另一个实施方案中，Leu 235被突变为Ala。在另一个实施方案中，Gly 237被突变为Ala。
在一些实施方案中，抗FLT-1抗体或抗原结合片段含有间隔区和/或连接至另一个实体。在一些实施方案中，接头或间隔区包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO:105)(GAG接头)具有至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在一些实施方案中，接头或间隔区包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO:106)(GAG2接头)具有至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。在一些实施方案中，接头或间隔区包含与GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQ ID NO:107)(GAG3接头)具有至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
抗Flt-1抗体和抗原结合片段的产生
适用于本发明的重组抗Flt-1抗体或抗原结合片段可通过任何可用的方式产生。例如，重组抗Flt-1抗体或抗原结合片段可通过利用经工程化以表达编码重组抗Flt-1抗体或抗原结合片段的核酸的宿主细胞系统来重组产生。
因此，本发明进一步提供编码本文所述的各种氨基酸序列的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗Flt-1抗体重链或轻链氨基酸序列(例如SEQ ID NO:62-86或SEQ ID NO:108-110中的任一个)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗Flt-1抗体重链或轻链的可变区(例如SEQ NO:35-61中的任一个)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗Flt-1抗体重链或轻链的CDR区(例如SEQ NO:1-34中的任一个)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码抗Flt-1抗体的恒定区(例如SEQ ID NO:87-89中的任一个)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗Flt-1抗体的Fc区(例如SEQ ID NO:104)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种编码本文所述的抗Flt-1抗体的接头(例如SEQ ID NO:105-107)的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码抗Flt-1抗体重链、轻链、可变区、CDR区、Fc区或接头区的多核苷酸序列还包括编码信号肽的序列。作为非限制性实例，合适的信号肽包含氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:111)。
本文描述的各种多核苷酸序列可体现在用于表达重组抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的各种载体系统中。
当重组产生抗体时，可使用任何表达系统。为了给出一些实例，已知的表达系统包括例如卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，适合于本发明的重组抗Flt-1抗体或抗原结合片段在哺乳动物细胞中产生。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l，ECACC编号：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell,Leiden,TheNetherlands)；以及由SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系。
在一些实施方案中，本发明提供由人细胞产生的重组抗Flt-1抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供由CHO细胞产生的抗Flt-1抗体或抗原结合片段。
含有本发明抗体的药物组合物
本发明进一步提供包含根据本发明的治疗活性成分(例如抗Flt-1抗体或其抗原结合片段)连同一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。此类药物组合物可任选地包含一种或多种另外的治疗活性物质。
虽然对本文提供的药物组合物的描述主要涉及适合用于向人凭医生处方施用的药物组合物，但熟练技术人员将理解此类组合物通常适合用于向所有种类的动物施用。改变适用于向人施用的药物组合物以便使得组合物适用于向各种动物施用是众所周知的，并且普通兽医药理学家可仅仅通过普通实验(如果存在)来设计和/或进行此种改变。
本文描述的药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与稀释剂或另一种赋形剂或载体和/或一种或多种其他辅助成分缔合，并且然后如果必要和/或希望，使产品成形和/或包装为所需的单剂量或多剂量单位。
根据本发明的药物组合物可以单一单位剂量和/或以多个单一单位剂量大批量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是包含预先确定的量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将要向受试者施用的活性成分的剂量和/或这种剂量的合宜分数，例如像这种剂量的一半或三分之一。
根据本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂或载体和/或任何另外成分的相对量将取决于所治疗的受试者的身份、尺寸和/或病状并且进一步取决于待施用所述组合物的途径而改变。举例来说，所述组合物可包含介于0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
药物制剂可另外包含药学上可接受的赋形剂或载体，如本文所用的赋形剂或载体包括适合于所需的具体剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington’s The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,2006；其以引用的方式并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。除了如通过产生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用而与物质或其衍生物不相容的任何常规赋形剂介质或载体以外，所述赋形剂或载体的使用被涵盖在本发明的范围内。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂或载体至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂或载体被批准用于人和用于兽医使用。在一些实施方案中，赋形剂或载体由美国食品药品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂或载体是药用级。在一些实施方案中，赋形剂或载体满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
在药物组合物的制造中使用的药学上可接受的赋形剂或载体包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂或载体可任选包含在药物组合物中。根据配制者的判断，赋形剂或载体如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂覆剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂可存在于组合物中。
合适的药学上可接受的赋形剂或载体包括但不限于水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、糖(如甘露糖醇、蔗糖、或其他)、右旋糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及其组合。如果需要，药物制剂可与助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合，所述助剂不会与活性化合物产生有害反应或干扰其活性。在一个优选实施方案中，使用适合于静脉内施用的水溶性载体。
如果需要，合适的药物组合物或药剂还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。组合物还可用传统粘合剂和载剂(如甘油三酯)配制为栓剂。口服制剂可包含标准载体，如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
药物组合物或药剂可根据常规程序配制为适用于施用至人类的药物组合物。例如，在一些实施方案中，用于静脉内施用的组合物通常是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，成分被分开供应或以单位剂型混合在一起，例如呈在气密密封容器如指示活性剂的量的安瓿或药囊中的干燥冻干粉末或无水浓缩物的形式。当组合物欲通过输注施用时，它可用含有无菌药用级水、盐水或右旋糖/水的输注瓶来分配。在组合物通过注射施用时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿以使得成分可在施用之前混合。
在配制和/或制造药剂方面的一般考虑因素可见于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy第21版,Lippincott Williams&Wilkins,2005(以引用的方式并入本文)中。
施用途径
本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段(或含有本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的组合物或药剂)通过任何适当的途径施用。在一些实施方案中，胃肠外施用抗Flt-1抗体或抗原结合片段蛋白或含有所述抗Flt-1抗体或抗原结合片段蛋白的药物组合物。胃肠外施用可以是静脉内、皮内、鞘内、吸入、经皮(局部)、眼内、肌内、皮下、肌内和/或经粘膜施用。在一些实施方案中，皮下施用抗Flt-1抗体或抗原结合片段或含有所述抗Flt-1抗体或抗原结合片段的药物组合物。如本文所用，术语“皮下组织”被定义为皮肤正下方的松散、不规则结缔组织的层。例如，可通过将组合物注射到包括但不限于大腿区域、腹部区域、臀部区域或肩胛区域的区域中来进行皮下施用。在一些实施方案中，静脉内施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段或含有所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，动脉内施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段或含有所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，口服施用抗Flt-1抗体或抗原结合片段或含有所述抗Flt-1抗体或抗原结合片段的药物组合物。如果需要，可同时使用多于一种途径。
在一些实施方案中，施用仅在个体中产生局部作用，而在其他实施方案中，施用在个体的多个部分中产生作用，例如全身作用。通常，施用引起将抗Flt-1抗体或抗原结合片段递送至一种或多种靶组织，包括但不限于肺和心脏。
剂型和给药方案
在一些实施方案中，组合物以治疗有效量和/或根据与特定所需结果(例如，治疗慢性肺病如支气管肺发育不良或降低其风险)相关的给药方案施用。
根据本发明待施用的具体剂量或量可例如取决于所需结果的性质和/或程度、取决于施用途径和/或时机的详情和/或取决于一种或多种特征(例如，体重、年龄、个人史、遗传特征、生活方式参数、心脏缺陷的严重程度和/或心脏缺陷的风险水平等、或其组合)而改变。此类剂量或量可由本领域普通技术人员确定。在一些实施方案中，根据标准临床技术确定适当的剂量或量。或者或另外，在一些实施方案中，通过使用一种或多种体外或体内测定以帮助鉴定合乎需要的或最佳的待施用的剂量范围或量来确定适当的剂量或量。
在各个实施方案中，以治疗有效量施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段。通常，治疗有效量足以实现对受试者有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜在疾病或病状)。在一些具体实施方案中，可从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线推测待施用的适当的剂量或量。
在一些实施方案中，所提供的组合物作为药物制剂而提供。在一些实施方案中，药物制剂是或包含用于根据与实现慢性肺病如支气管肺发育不良的发生率或风险降低相关的给药方案施用的单位剂量的量。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂作为单一剂量施用。在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以规则时间间隔施用。如本文所用，以一个“时间间隔”施用指示周期性地(如与一次性剂量区别)施用治疗有效量。时间间隔可通过标准临床技术来确定。在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂每两月一次、每月一次、每月两次、每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每日一次、每日两次或每六小时一次施用。用于单个个体的施用时间间隔不一定是固定时间间隔，而是可根据个体的需要随时间推移而变化。
如本文所用，术语“每两月一次”是指每两个月施用一次(即，每两个月一次)；术语“每月一次”是指每个月施用一次；术语“每三周一次”是指每三周施用一次(即，每三周一次)；术语“每两周一次”是指每两周施用一次(即，每两周一次)；术语“每周一次”是指每周施用一次；并且术语“每日一次”是指每天施用一次。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂不确定地以规则时间间隔施用。在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以规则时间间隔施用限定的时间段。在一些实施方案中，产前施用包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂。在一些实施方案中，产后施用包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以约0.5mg/kg体重、约1.0mg/kg体重、约10mg/kg体重或约20mg/kg体重的剂量施用。
在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重，例如约1mg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的剂量施用。
在一些实施方案中，将包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以约35mg、约70mg、约700mg或约1400mg的单位剂量施用至成人。在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以约35mg至约1400mg，例如约70mg至约700mg范围内的剂量施用。
在一些实施方案中，将包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以约2mg、约4mg、约40mg或约80mg的单位剂量施用至婴儿。在一些实施方案中，包含本文所述的抗Flt-1抗体或抗原结合片段的制剂以约2mg至约80mg，例如约4mg至约40mg范围内的剂量施用。在一些实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段降低至少一种BPD病征或症状的强度、严重程度或频率或延迟其发作。在一些实施方案中，施用抗Flt-1抗体或其抗原结合片段降低至少一种BPD病征或症状的强度、严重程度或频率或延迟其发作，所述BPD病征或症状选自由以下组成的组：肺炎症、肺瘢痕形成、肺生长受损、早期肺损伤、长期呼吸功能不全、肺部感染、运动不耐受和不良神经学结果。
组合疗法
在一些实施方案中，抗Flt-1抗体或抗原结合片段与当前用于治疗肌营养不良症的一种或多种已知治疗剂(例如皮质类固醇)组合施用。在一些实施方案中，已知的治疗剂根据其标准或批准的给药方案和/或时间表施用。在一些实施方案中，已知的治疗剂根据与其标准或批准的给药方案和/或时间表相比改变的方案施用。在一些实施方案中，这种改变的方案不同于标准的或批准的给药方法，在于一个或多个单位剂量的量被改变(例如，减少或增加)，和/或在于给药频率被改变(例如，在于单位剂量之间的一个或多个时间间隔扩大，从而导致更低的频率，或单位剂量之间的一个或多个时间间隔减小，从而导致更高的频率)。
实施例
实施例1.抗Flt-1抗体的体外功效
胎儿肺动脉内皮细胞分离
在第135天(分娩期第147天)从晚期妊娠对照胎羊的近端肺动脉收获肺动脉内皮细胞(PAEC)。使用标准内皮标志物的免疫组织化学证实细胞表型。然后使低传代PAEC(p4-5)暴露于单独或组合的ETX、VEGF、sFlt1或抗Flt1。
在暴露于ETX、VEGF、sFlt1和抗Flt1时，PAEC的生长
将胎儿PAEC在具有10％FBS的DMEM中以50,000个细胞/孔一式三份接种到12孔板中并允许在21％氧中粘附过夜。第二天(第0天)，将细胞用PBS洗涤两次。然后添加具有2.5％FBS的DMEM与VEGF、ETX、sFlt1或抗Flt1(单独或组合)，并且将细胞在21％氧中孵育。外源性因子的最终浓度如下：VEGF 50ng/mL、ETX 1ng/mL、sFlt1 114ng/mL和抗Flt11800ng/mL。每日更换实验培养基，并且在用0.25％胰蛋白酶移除细胞后第3天对细胞进行计数且用细胞计数器(Beckman Coulter；Fullerton,CA)计数。基于确定这是支持胎儿PAEC存活与一些增殖的最低血清浓度的先前研究，在具有2.5％FBS的DMEM中进行使用处理的生长研究。
PAEC管形成测定
为了测定体外血管生成，使用0.2％黄素单核苷酸和UV Stratalinker 1800(Stratagene)交联鼠尾胶原。将50,000个细胞/孔添加在补充有ETX、VEGF、sFlt1和抗Flt1(单独或组合)的无血清DMEM培养基中，并且对每种动物一式三份测试每种条件。然后基于确定管形成在3％氧中比21％氧中更稳健的先前研究，将PAEC在3％氧条件下孵育12-18小时。分支点计数在x10放大倍率下从每孔具有三至四个视野的三个孔中的每个以盲的方式进行。使用Olympus IX71荧光显微镜(Olympus)对孔成像。
统计分析
用Prism软件包(v.5.0a,GraphPad)进行统计分析。进行重复测量单因素方差分析(ANOVA)与Bonferroni事后检验分析(post-test analysis)。小于0.05的P值被认为是显著的。
向暴露于sFLT的PAEC施用抗Flt-1抗体
将细胞用单独或组合的重组人VEGF(50ng/mL)、重组人可溶性Flt-1(sFLT，114ng/mL)或人可溶性Flt-1的抗体(a-sFLT，1800ng/mL)处理。在处理后3天测量PAEC生长，并且在处理后24小时测量管分支点的数目。
结果
相较于仅用VEGF和处理处理的细胞，用sFLT和VEGF处理减少了PAEC的数目，从而表明sFLT防止VEGF促进细胞生长。当sFLT和a-sFLT都与VEGF组合时，PAEC的数目被提高至在仅用VEGF处理细胞时所观察到的水平，从而证明a-sFLT抑制sFLT诱导的细胞生长下降。
用单独VEGF处理就增加了管分支点的数目，与用VEGF和a-sFLT处理一样。相比之下，相较于仅用VEGF处理的细胞，用VEGF和sFLT处理减少了分支点的数目。当将sFLT和a-sFLT两者与VEGF组合时，分支点的数目可比得上与在仅VEGF组中所观察到的数目，从而证明a-sFLT抑制sFLT诱导的分支点数目的减少。
向暴露于ETX的PAEC施用抗Flt-1抗体
将细胞用VEGF(50ng/mL)、内毒素(ETX，1ng/mL)、VEGF+ETX、EXT+a-sLFT(1800ng/mL)或EXT+VEGF+a-sFLT处理。在处理后3天测量PAEC生长，并且在处理后24小时测量管分支点的数目。
结果
与对照(CTL)相比，在用VEGF处理后PAEC生长增加，并且与对照相比，仅用ETX处理的PAEC显示降低的生长。VEGF或a-sFLT与ETX的组合使细胞数目达到在对照组中观察到的水平，与用ETX、VEGF和a-sFLT处理一样，这表明用VEGF或a-sFLT处理可逆转ETX对PAEC生长的不利影响。
在仅用VEGF处理后分支点的数目增加，并且与对照组和VEGF处理组两者相比，仅用ETX处理的细胞显示分支点的数目减少。VEGF或a-sFLT与ETX的组合使分支点的数目达到在对照组中观察到的水平，与用ETX、VEGF和a-sFLT处理一样，这表明用VEGF或a-sFLT处理可逆转ETX对管中分支点的数目的不利影响。
实施例2.抗Flt-1抗体在BPD的ETX模型中的体内功效
动物
所有程序和方案均由科罗拉多大学健康科学中心(University of ColoradoHealth Sciences Center)的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)批准。定时妊娠的Sprague-Dawley大鼠购自查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories)(Wilmington,MA)，并且在分娩前在丹佛海拔(Denver’s altitude)(1,600米；气压，630mmHg；吸入氧张力，122mmHg)下的室内空气中维持至少1周。将动物随意喂食并每12小时交替地暴露于昼夜循环。用腹膜内注射戊巴比妥钠(0.3mg/g体重；Fort DodgeAnimal Health,Fort Dodge,IA)处死大鼠。
动物模型和研究设计
羊膜内ETX、维生素D和抗sFLT施用
利用了绒毛膜羊膜炎的动物模型。在妊娠期20天(分娩期：22天)时，将妊娠大鼠准备接受羊膜内(IA)注射。在大鼠肺部发育的晚期小管期期间的注射时间被选择成与处于BPD的最高风险的24至26周早产新生儿中的人肺发育的类似阶段并行。在用丁丙诺啡(0.01–0.05mg/kg，皮下注射)术前用药后，在经由面罩用1％–2％异氟烷吸入全身麻醉(麻醉机：Matrx by Midmark，型号VIP3000)下进行剖腹手术。在麻醉和剖腹手术期间，将妊娠大鼠保持在加热垫上以防止体温过低。在一项研究中将妊娠大鼠随机分配至盐水对照(CTR)、内毒素(ETX)或ETX+维生素D(vit D)组，或在另一项研究中随机分配至盐水对照(CTR)、内毒素(ETX)或ETX+抗sFLT。CTR组接受50μl的生理136盐水/羊膜囊，ETX组接受用生理盐水稀释至50μl的10μg大肠杆菌055:B55ETX(Sigma Chemical,St.Louis,MO)/囊，ETX+vit D组接受用生理盐水稀释至50μl的10μg大肠杆菌055:B55ETX和50pg，并且ETX+抗sFLT组接受10μg大肠杆菌055:B55ETX和低剂量(1x摩尔当量)或高剂量(10x摩尔当量)抗sFlt1抗体。在无菌准备下，取得3–4cm长度的中线腹部切口以使羊膜囊暴露用于IA注射。首先鉴定并注射最接近右侧卵巢的羊膜囊，且然后以逆时针顺序鉴定每个囊并用每个坝(perdam)注射最多10个囊进行注射。注射被限制至10个囊以防止由于来自累积剂量的IA ETX的全身毒性所致的产妇死亡。ETX的剂量从证明低剂量(1–5μg/囊)的ETX未能在14天龄时诱导肺结构异常的先前研究建立。vit D的剂量再次从证明高剂量(500ng/gm)的vit D产生在大鼠幼崽中发现的皮下钙沉积的先前研究建立。将腹部切口用尼龙缝合线缝合。将布比卡因(1–2mg/kg，肌内注射)施加在切口伤口上以用于术后疼痛控制。在手术后10分钟内，密切监测妊娠大鼠以确保觉醒，并且将大鼠放回至笼子且监测活动和出血或感染的迹象。
剖腹产术
在IA注射后两天，对如上所述用异氟烷吸入全身麻醉下的妊娠大鼠进行剖腹产术。最靠近右卵巢的羊膜囊中的胎儿首先分娩，随后以逆时针顺序分娩其余胎儿，以鉴定暴露于IA注射的胎儿。基于羊膜囊的顺序及其与卵巢相关的解剖位置进行剖腹产术代替阴道分娩，以便鉴定暴露于特定IA注射的胎儿。在麻醉开始后的5分钟内分娩注射的羊膜囊内的所有大鼠幼崽。然后用戊巴比妥钠对母鼠进行安乐死。将新生大鼠立即干燥并放置在加热垫上以避免体温过低。幼崽在出生时未接受补充供氧或人工通气。在出生后30分钟内，将幼崽称重并且处死用于组织学，或与寄养母鼠一起放置饲养14天。在出生时收获大鼠肺并且在14天龄收获大鼠肺用于组织学评估。在整个研究期间，从出生每日监测并记录幼年大鼠的存活。存活率被计算为存活幼崽的数目除以在每一分娩胎仔中接受羊膜内注射的囊的数目。
研究测量
用于组织学分析的组织
将动物用腹膜内戊巴比妥钠处死。将导管置于气管内，并且将肺用4％多聚甲醛膨胀，且在20cm H2O压力下维持60分钟。将气管周围用绷带系紧以维持压力，并将气管插管取出。在室温下将肺浸泡在4％多聚甲醛中过夜以进行固定。分别从每只动物的固定肺的右下叶和左叶的中平面取得2-mm厚的横切片。将来自每只动物的两个切片进行加工并包埋在石蜡中以用于研究。
支气管肺泡灌洗(BAL)
根据标准技术在出生当天(第0天)进行支气管肺泡灌洗并测量肺中的sFLT水平。
辐射状肺泡计数(RAC)
如所描述(Cooney TP,Thurlbeck WM.The radial alveolar count method ofEmery and Mithal:a reappraisal 1–postnatal lung growth.Thorax 37:572–579,1982；Cooney TP,Thurlbeck WM.The radial alveolar count method of Emery andMithal:a reappraisal 2–intrauterine and early postnatal lung growth.Thorax37:580–583,1982)通过Emery和Mithal的RAC方法评估肺泡化。呼吸性细支气管被鉴定为由壁的一部分中的上皮内衬的细支气管。从呼吸性细支气管的中心，一条垂直线被降至腺泡结缔组织或隔膜或胸膜的边缘，并且对由此线相交的间隔的数目进行计数。
统计分析
用Prism软件包(v.5.0a,GraphPad)进行统计分析。进行重复测量单因素方差分析(ANOVA)与Bonferroni事后检验分析(post-test analysis)。小于0.05的P值被认为是显著的。
结果
与对照组相比，sFLT水平在子宫内暴露于ETX的大鼠中增加，并且用维生素D处理使sFLT的水平降低至在对照组中观察到的水平。这证明用维生素D治疗可经由维生素D对肺中sFLT水平的作用用作用于治疗BPD的治疗剂。
如通过形态测定分析所示，与对照组相比，RAC在子宫内暴露于ETX的大鼠中降低，并且与仅暴露于ETX的组相比，在暴露于ETX的大鼠中用抗sFLT子宫内给药增加RAC。这证明用抗sFLT治疗可用作治疗BPD的治疗剂。
实施例4.抗Flt-1抗体在BPD的sFLT模型中的体内功效
动物
所有程序和方案均由科罗拉多大学健康科学中心(University of ColoradoHealth Sciences Center)的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee)批准。妊娠Sprague-Dawley大鼠购自查尔斯河实验室(Wilmington,MA)，并且在分娩前在丹佛海拔(1,600米；气压，630mmHg；吸入氧张力，122mmHg)下的室内空气中维持至少1周。将动物随意喂食并每12小时交替地暴露于昼夜循环。用腹膜内注射戊巴比妥钠(0.3mg/g体重；Fort Dodge Animal Health,Fort Dodge,IA)处死大鼠。
研究设计
羊膜内sFlt-1施用
在妊娠期20天(分娩期：22天)时，将妊娠大鼠准备接受羊膜内注射。在大鼠肺部发育的晚期小管期期间的注射时间被选择成与处于BPD的最高风险的24至26周早产新生儿中的人肺发育的类似阶段并行。在用丁丙诺啡(0.01–0.05mg/kg，肌内注射)术前用药后，在经由面罩用1％–2％异氟烷吸入全身麻醉(麻醉机：Matrx by Midmark，型号VIP3000)下对妊娠大鼠进行剖腹手术。在麻醉和剖腹手术期间，将妊娠大鼠保持在加热垫上以防止体温过低。将妊娠大鼠随机分配至盐水对照或sFlt-1组；盐水组接受50μL生理盐水/羊膜囊，并且sFlt-1组接受用生理盐水稀释至50μL的50μg重组人sFlt-1-Fc(R&D Systems,Minneapolis,Minnesota)/囊。一个sFLT组接受低剂量(1x摩尔当量)的抗sFLT，并且另一个sFLT组接受高剂量(10x摩尔当量)的抗sFLT。在无菌准备下，制作3–4cm长度的中线腹部切口以使羊膜囊暴露用于羊膜内注射。首先鉴定并注射最接近右侧卵巢的羊膜囊，且然后以逆时针顺序鉴定每个囊并用每个坝(per dam)注射最多10个囊进行注射。鉴于羊膜内sFlt-1通过膜内路径被吸收到母体循环中，将sFlt-1注射限制至10个囊/妊娠大鼠是为了实现个体母鼠上sFlt-1的一致总剂量，所述膜内路径的特征在于胎盘的胎儿表面上的胎儿血管系统的微观网络以介导羊膜内物质转移到胎儿和母体循环中。类似地，考虑到羊膜腔与母体和胎儿循环之间通过膜内途径的连通，在单独胎仔中给予羊膜内盐水以充当对照。在剖腹手术期间检查并记录每只母鼠的羊膜囊的总数。将腹部切口用尼龙缝合线缝合。将布比卡因(1–2mg/kg，皮下注射)施加在切口伤口上以用于术后疼痛控制。在手术后10分钟内，密切监测妊娠大鼠以确保觉醒，并且将大鼠放回至笼子且监测活动、吃喝的能力以及出血或感染的迹象。
剖腹产术
在羊膜内注射后两天，对如上所述用异氟烷吸入全身麻醉下的妊娠大鼠进行剖腹产术。最靠近右卵巢的羊膜囊中的胎儿首先分娩，随后以逆时针顺序分娩其余胎儿，以鉴定暴露于羊膜内注射的胎儿。在分娩时进一步验证每只母鼠的羊膜囊的总数。基于羊膜囊的顺序及其与卵巢相关的解剖位置进行剖腹产术而不是允许阴道分娩的主要原因是鉴定暴露于羊膜内注射的胎儿。在麻醉开始后的5分钟内分娩注射的羊膜囊内的所有大鼠幼崽。然后用戊巴比妥钠处死母鼠。将新生大鼠立即放置在加热垫上以避免体温过低，并用纱布海绵手动干燥。幼崽在出生时未接受补充供氧或人工通气。记录出生时的存活率。在出生后30分钟内，将所述幼崽称重并与寄样母鼠一起放置在常规笼子中。在生命的前24小时，密切监测新生幼崽的死亡或呼吸窘迫的迹象。
在出生时收获大鼠肺用于蛋白质印迹分析，并且在出生时和14天龄收获大鼠肺用于组织学评估。在出生和7天和14天龄时将心脏解剖并称重。对于在每个时间点的每次测量，在每组中对3至9只大鼠进行了研究。在整个研究期间，从出生每日监测并记录幼年大鼠的存活。存活率被计算为存活幼崽的数目除以在每一分娩胎仔中接受羊膜内注射的囊的数目。体重是在出生时和在被处死用于研究测量时测量的体重。
研究测量
用于组织学分析的组织
将动物用腹膜内戊巴比妥钠处死。将导管置于气管内，并且将肺用4％多聚甲醛膨胀，且在20cm H2O压力下维持60分钟。将气管周围用绷带系紧以维持压力，且然后将气管插管取出。然后在室温下将肺浸泡在4％多聚甲醛中24小时以进行固定。分别从每只动物的固定肺的右下叶和左叶的中平面取得2-mm厚的横切片以加工并包埋在石蜡中。
免疫组织化学
将具有5μm石蜡切片的载玻片用苏木精和伊红染色以用于评估肺泡结构并且用血管性血友病因子(von Willebrand Factor)(vWF)(一种内皮细胞特异性标志物)染色以量化血管密度。
肺血管密度
肺血管密度通过对在每高倍视野具有50μm或或更小的外径的vWF染色的血管进行计数来测定。含有外径>50μm的大气道或血管的视野被避免。
辐射状肺泡计数(RAC)
如所描述(Cooney TP,Thurlbeck WM.The radial alveolar count method ofEmery and Mithal:a reappraisal 1–postnatal lung growth.Thorax 37:572–579,1982；Cooney TP,Thurlbeck WM.The radial alveolar count method of Emery andMithal:a reappraisal 2–intrauterine and early postnatal lung growth.Thorax37:580–583,1982)通过Emery和Mithal的RAC方法评估肺泡化。呼吸性细支气管被鉴定为由壁的一部分中的上皮内衬的细支气管。从呼吸性细支气管的中心，一条垂直线被降至腺泡结缔组织或隔膜或胸膜的边缘，并且对由此线相交的间隔的数目进行计数。
右心室肥大的指标
将右心室(RV)和左心室加隔膜(LV+S)解剖并称重。测定RV与LV+S重量的比值(RV/LV+S％)和RV/体重(RV/BW％)以评价右心室肥大(RVH)。
统计分析
使用InStat 3.0软件包(GraphPad Software,San Diego,CA)进行统计分析。使用t检验或Newman-Keuls事后分析的ANOVA进行组之间的统计学比较以获得显著性。P<0.05被认为是显著的。
结果
用sFLT+抗-sFLT处理的动物中肺血管密度与仅用sFLT处理的动物相比增加。
通过辐射状肺泡计数(RAC)方法评估肺泡化。当通过形态测定分析进行分析时，sFLT大鼠与对照组(CTL)相比显著降低了RAC(P<0.001)。与sFLT组相比，用低剂量的a-sFLT处理显著增加了RAC(P<0.01)。这表明用a-sFLT处理可逆转由sFLT引起的肺泡化的减少。
通过称重右心室(RV)和左心室加隔膜(LV+S)并计算比值来评估右心室肥大。与对照组相比，暴露于sFLT的动物具有增加的RV/(LV+S)比值。与sFLT组相比，用低剂量的a-sFLT处理降低了RV/(LV+S)比值。这表明用a-sFLT处理可逆转由sFLT引起的右心室肥大。
测定右心室(RV)与体重的比值以评价右心室肥大。与对照组相比，暴露于sFLT的动物具有增加的RV/体重比值。与sFLT组相比，用低剂量的a-sFLT处理显著降低了RV/体重比值。这表明用a-sFLT处理可逆转由sFLT引起的右心室肥大。
实施例5.抗Flt-1抗体在BPD的内毒素(ETX)诱导的模型中的体内功效
研究设计
羊膜内sFlt-1和ETX施用
在妊娠期20天(分娩期：22天)时，将妊娠大鼠准备接受羊膜内注射。将妊娠大鼠随机分配至盐水对照或ETX(内毒素)组；盐水组接受生理盐水注射到羊膜囊中，并且ETX组接受10μg内毒素/囊。在羊膜内施用后，将腹部切口闭合并密切监测大鼠以确保手术后觉醒。
剖腹产术和处理
在羊膜内注射后两天，对全身麻醉下的妊娠大鼠进行剖腹产术，如上所述。将幼崽用1mg/kg抗sFLT单克隆抗体、10mg/kg抗sFLT单克隆抗体或10mg/kg IgG对照(小鼠IgG1同种型对照)一周两次处理持续两周。
研究测量
在第14天，收获大鼠肺以用于形态测定分析和组织学评估。在出生时和在处死时测量动物的体重。将肺在20cm H20下用4％多聚甲醛膨胀后固定。通过辐射状肺泡计数(RAC)评估远端空腔结构。收集心脏以确定右心室肥大(RV/LS+S重量)
体重
测量动物的体重以确定产后抗Flt-1单克隆抗体处理是否改善产前ETX处理后体重。对子宫内施用ETX、随后用IgG(对照)或抗Flt-1mAb(1mg/kg或10mg/kg)产后处理的动物称重。仅接受ETX或ETX+IgG的动物的重量显著低于对照动物。接受ETX+任一剂量的抗Flt-1mAb的动物的重量与对照动物的重量没有显著差异。这些数据表明，给予产后抗Flt-1mAb的动物在内毒素诱导的BPD模型中可具有生长优势。
辐射状肺泡计数(RAC)
测量辐射状肺泡计数以确定产后抗Flt-1单克隆抗体处理是否改善产前ETX处理后的肺泡生长。对子宫内施用ETX、随后用IgG(对照处理)或抗Flt-1单克隆抗体(1mg/kg或10mg/kg)产后处理的动物的肺进行研究。与对照动物相比，仅接受ETX或ETX+IgG的动物展示显著降低的肺泡生长。接受ETX+10mg/kg抗Flt-1单克隆抗体的动物中的肺泡生长显著优于接受单独ETX的动物中的肺泡生长。这些数据表明，给予产后抗Flt-1单克隆抗体的动物在内毒素诱导的BPD模型中可具有改善的肺结构。
右心室肥大的指标
测量右心室以确定产后抗Flt-1单克隆抗体处理是否预防产前ETX处理后右心室肥大(RVH)。对子宫内施用ETX、随后用IgG(对照处理)或抗Flt-1单克隆抗体(1mg/kg或10mg/kg)产后处理的动物的心脏进行研究。与对照动物相比，仅接受ETX或ETX+IgG的动物展示显著增加的右心室比值。接受ETX+任一剂量的抗Flt-1单克隆抗体的动物的右心室比值与对照动物的右心室比值无显著差异。接受ETX+任一剂量的抗Flt-1单克隆抗体的动物的右心室比值与接受ETX的动物的右心室比值显著不同。这些数据表明，给予产后抗Flt-1单克隆抗体的动物在内毒素诱导的BPD模型中可具有减少的肺动脉高压。
肺结构
对肺结构和肺血管密度进行评估以确定产后抗Flt-1单克隆抗体处理是否修复产前ETX处理后的肺结构。对子宫内施用ETX、随后用IgG(对照处理)或抗Flt-1单克隆抗体(1mg/kg或10mg/kg)产后处理的动物的肺进行研究。这些数据表明，产后抗sFlt-1单克隆抗体在实验性绒毛膜炎中可修复肺结构。
等效案和范围
本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效案。本发明的范围不意图限于以上描述，而是如以下权利要求书中所阐述。
表3.
表4.

Claims (44)

1.一种治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括
向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自由以下组成的组：
可变轻(VL)链CDR1，其由与SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；
VL CDR2，其由与SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:24中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义，
VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:34中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义，
可变重(VH)链CDR1，其由与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义，
VH CDR2，其由与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及
VH CDR3，其由与SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个CDR包括所述VL CDR3，其由所述与SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:34中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及所述VH CDR3，其由所述与SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述一个或多个CDR包括VL CDR1，其由与SEQ IDNO:19至SEQ ID NO:21中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；VL CDR2，其由与SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:24中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及VL CDR3，其由与SEQ ID NO:25至SEQ ID NO:34中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个CDR包括所述VH CDR1，其由所述与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；所述VH CDR2，其由所述与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:14中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义；以及所述VH CDR3，其由所述与SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列定义。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25的氨基酸序列定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25的氨基酸序列定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VL链，所述VL链包含分别由SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:24的氨基酸序列定义的VL CDR1和VL CDR2，以及由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列定义的VLCDR3。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述VL链包含分别由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32的氨基酸序列定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:15的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:16的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:18的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
12.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1和VH CDR3，以及由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列定义的VH CDR2。
13.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1和VH CDR3，以及由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列定义的VHCDR2。
14.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
15.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括VH链，所述VH链包含分别由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17的氨基酸序列定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
16.一种治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括
向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括：(i)轻链可变(VL)区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:61中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列；和/或(ii)重链可变(VH)区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:48中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述VL区包含SEQ ID NO:60的所述氨基酸序列并且所述VH区包含SEQ ID NO:45的所述氨基酸序列。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区，所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:87至SEQ ID NO:89中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
19.一种治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括
向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段包括：(i)轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:75至SEQ ID NO:86中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列；和/或(ii)重链，所述重链包含与SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:74中的任一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述轻链包含SEQ ID NO:76的所述氨基酸序列并且所述重链包含SEQ ID NO:71的所述氨基酸序列。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：IgG、F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、ScFv、双抗体、三抗体和四抗体。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是IgG。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是IgG1。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段是人源化单克隆抗体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述人源化单克隆抗体含有人Fc区。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述Fc区含有增强所述Fc区与FcRn受体之间的结合亲和力以使得所述抗体的体内半衰期延长的一个或多个突变。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Fc区含有在对应于人IgG1的Leu234、Leu 235和/或Gly 237的位置处的一个或多个突变。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段不结合至VEGFR2和/或VEGFR3。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段不结合至小鼠或猴Flt-1。
31.一种治疗支气管肺发育不良(BPD)的方法，所述方法包括
向需要治疗的个体施用有效量的抗Flt-1抗体或其抗原结合片段，
其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段识别包含以下氨基酸序列的肽或其片段，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:90的位置139至148、位置139至153、位置178至206、位置199至204以及位置128至138。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述肽由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO:90的位置130至138、位置141至148、位置141至153和位置193至206。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体是患有或易患BPD的婴儿。
34.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述个体怀有患有或易患BPD的胎儿。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段经胃肠外施用。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述胃肠外施用选自静脉内、皮内、鞘内、吸入、经皮(局部)、眼内、肌内、皮下、肺部递送和/或经粘膜施用。
37.如权利要求37所述的方法，其中所述胃肠外施用是静脉内施用。
38.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段经口服施用。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段每两月一次、每月一次、每三周一次、每两周一次、每周一次、每日一次或以可变时间间隔施用。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段被递送至选自肺和心脏的一种或多种靶组织。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段被递送至所述肺。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段被递送至所述心脏。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗Flt-1抗体或其抗原结合片段的所述施用引起相对于对照，健康肺组织的生长、肺炎症减轻、肺泡生成增加、血管生成增加、肺血管床的结构改善、肺瘢痕形成减少、肺生长改善、呼吸功能不全减少、运动耐受性改善、不良神经学结果减少和/或肺功能改善。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括共同施用至少一种选自以下的另外药剂或疗法：表面活性剂、氧疗法、呼吸机疗法、类固醇、维生素A、吸入一氧化氮、高热量营养制剂、利尿剂和/或支气管扩张剂。
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