CN110520439A - 抗分泌粒蛋白iii(scg3)抗体及其用途 - Google Patents

抗分泌粒蛋白iii(scg3)抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

公开了对分泌粒蛋白III(Scg3)特异性的抗体。还公开了使用该抗体、其抗原结合片段或包含它们的药物组合物治疗诸如糖尿病性视网膜病变、新生血管性年龄相关性黄斑变性、早产儿视网膜病变和癌症等疾病的方法。

Description

抗分泌粒蛋白III(SCG3)抗体及其用途
政府利益的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的#R01GM094449下由政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用和以电子方式提交的材料通过引用并入
本申请要求于2016年11月8日提交的美国临时专利申请No.62/419,195的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容在此通过引用整体并入。
作为本公开的单独部分，本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过引用整体并入并标识如下：文件名：51085A_Seqlisting.txt；大小：23,905字节；创建：2017年11月6日
技术领域
本公开总体上涉及抗分泌粒蛋白III抗体及其用途。
背景技术
糖尿病性视网膜病变(DR)和年龄相关性黄斑变性(AMD)是视力丧失的主要原因。DR影响全世界约9300万人，包括约2800万有威胁视力的糖尿病性黄斑水肿(DME)和增生型糖尿病性视网膜病变(PDR)。DR早期的特征在于内皮细胞(EC)和周细胞凋亡、血管渗漏和白细胞附着，并且可以向无细胞毛细血管、微动脉瘤、视网膜静脉阻塞、DME和PDR进展。AMD有两种临床形式：干性(萎缩性)和湿性(新生血管性或渗出性)。有脉络膜新血管形成(CNV)的新生血管性AMD(nAMD)折磨10-20％患有该疾病的个体，但是在因该疾病严重视力丧失的所有病例中占约90％。
血管生成因子在伴视网膜血管渗漏的DME、伴视网膜新血管形成的PDR、和nAMD发病机制中起重要作用。批准血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂，包括LUCENTIS(雷珠单抗)和EYLEA(阿柏西普)，是DR和nAMD治疗的重大突破(Schwartz等人Expert Opin EmergDrugs.2014；19(3):397-405；Shao等人Dev Ophthalmol.2016；55:125-36)。然而，抗VEGF疗法的效力有限并且仅在不到50％的DR和nAMD病例中可改善视力(Dedania和Bakri ClinOphthalmol.2015；9:533-42)，提示其他血管生成因子可能参与这些疾病的发病机制。由于选择有限，对一种抗VEGF药物反应差的患者经常转换到另一种VEGF抑制剂(Pinheiro-Costa等人Ophthalmologica.2014；232(3):149-55)，尽管它们的作用机制相似。另外，大多数血管生成因子在正常和患病血管中均调节新血管形成，因此针对这些靶标的疗法可能因此影响正常血管和细胞而具有有害效果。因此，所有VEGF抑制剂被批准仅通过玻璃体内施用来用于AMD治疗。尽管单次玻璃体内注射的副作用率低，但重复玻璃体内注射可能会对眼睛造成不良影响，例如眼内炎、视网膜脱离，眼压升高和白内障。在早期或高风险受试者中预防DME、PDR和nAMD需要反复玻璃体内注射VEGF抑制剂。因此，抗VEGF疗法未被批准用于预防DME、PDR或nAMD。为了解决现有治疗的问题，需要通过局部滴眼剂或持续时间长的DR和AMD新疗法来避免或减少玻璃体内注射的频率。
抗VEGF治疗还已经评价了用于治疗早产儿视网膜病变(ROP)，这是儿童失明的最常见原因。在美国ROP每年影响14,000至16,000名早产婴儿，在其他国家有相似的高发生率。ROP的特征在于病理性视网膜新血管形成(NV)，并且可能向着伴发严重的视力损害甚至失明的部分或完全视网膜脱离进展。患有ROP的婴儿被认为有较高的风险在成年期发生其它眼病，例如视网膜脱离、近视、斜视、弱视和青光眼(Davidson and Quinn，Pediatrics.2011；127(2):334-9)。ROP目前用激光疗法或冷冻疗法治疗(Hellstrom等人，Lancet.2016；40(3):189-202)。不幸的是，这两种治疗都会破坏周边视力来挽救中心视力，并且没有解决ROP的根本原因。几项用VEGF抑制剂的临床试验显示对ROP的效力有限(Sankar等人，Cochrane Database Syst.Rev.2016；2:CD009734)，并且对ROP来说抗VEGF疗法的安全性是一个主要顾虑。VEGF对于胚胎和新生儿阶段的血管形态发生和视网膜发育至关重要。具有VEGF受体1或2的纯合缺失的小鼠在宫内死亡(Fong等人，Nature.1995；376(6535):66-70；Shalaby等人，Nature.1995；376(6535):62-6)。类似地，具有单个VEGF等位基因缺失的小鼠是胚胎致死的(Ferrara等人，Nature.1996；380(6573)；439-42)。标示外使用VEGF抑制剂治疗ROP也与明显不良后果相关(Beharry等人，Semin Perinatol.2016；40(3)189-202)。这些发现提高了对早产儿抗VEGF疗法的重大安全性顾虑。因此，由于效力和安全性有限，VEGF抑制剂在批准它们用于nAMD后的十多年未被批准用于ROP治疗，并且目前没有FDA批准用于ROP的药物。
开发具有高效力、VEGF非依赖性机制和灵活施用途径的新的抗血管生成疗法是对于DR、nAMD和ROP优先考虑的事情，并可以有效治疗其它疾病，包括癌症。
发明内容
本公开涉及与分泌粒蛋白III(Scg3)特异性结合的抗体及其片段和衍生物，以及它们在治疗包括糖尿病性视网膜病变(DR)、新生血管性年龄相关性黄斑变性(nAMD)、早产儿视网膜病变(ROP)和癌症在内的疾病中的用途。
在一个方面，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其交叉阻断参考抗体与Scg3的结合，其中所述参考抗体选自由下列组成的组：包含SEQ ID NO：3-8的互补决定区(CDR)的抗体；包含SEQ ID NO：11-16的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：19-24的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：27、4、28、22、29和24的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：27、4、28、32、29和24的CDR的抗体；以及包含SEQ ID NO：3、4、28、22、29和24的CDR的抗体。例如，所述参考抗体选自由下列所组成的组：包含含有SEQ ID NO：1的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：9的重链可变区和含有SEQ ID NO：10的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：17的重链可变区和含有SEQ ID NO：18的轻链可变区的抗体；包含含有SEQID NO：25的重链可变区和含有SEQ ID NO：26的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：30的重链可变区和含有SEQ ID NO：31的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：38的重链可变区和含有SEQ ID NO：33的轻链可变区的抗体；以及包含含有SEQ ID NO：34的重链可变区和含有SEQ ID NO：35的轻链可变区的抗体。
在另一个方面，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其结合分泌粒蛋白III并包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含选自由SEQ IDNO：3、11、19和27组成的组中的氨基酸序列；(b)CDR-H2包含选自由SEQ ID NO：4、12和20组成的组中的氨基酸序列；(c)CDR-H3包含选自由SEQ ID NO：5、13、21和28组成的组中的氨基酸序列；(d)CDR-L1包含选自由SEQ ID NO：6、14、22和32组成的组中的氨基酸序列；(e)CDR-L2包含选自由SEQ ID NO：7、15、23和29组成的组中的氨基酸序列；以及(f)CDR-L3包含选自由SEQ ID NO：8、16和24组成的组中的氨基酸序列。例如，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：3所展示的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：4所展示的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：5所展示的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：6所展示的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：7所展示的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO：8所展示的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：11所展示的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：12所展示的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：13所展示的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：14所展示的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：15所展示的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO：16所展示的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：19所展示的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：20所展示的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：21所展示的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：22所展示的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ IDNO：23所展示的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO：24所展示的氨基酸序列的CDR-L3。在一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：27所展示的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：4所展示的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ IDNO：28所展示的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：22所展示的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：29所展示的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO：24所展示的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQID NO：27所展示的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：4所展示的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：28所展示的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：32所展示的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：29所展示的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO：24所展示的氨基酸序列的CDR-L3。在又一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：3所展示的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：4所展示的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：28所展示的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQID NO：22所展示的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO：29所展示的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO：24所展示的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其结合分泌粒蛋白III并包含含有SEQ ID NO：1、9、17、25、30、38或34的重链可变区和含有SEQ ID NO：2、10、18、26、31、33或35的轻链可变区。例如，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：1的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的轻链可变区。在另一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：9的重链可变区和含有SEQ ID NO：10的轻链可变区。在又一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：17的重链可变区和含有SEQ ID NO：18的轻链可变区。在一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：25的重链可变区和含有SEQ ID NO：26的轻链可变区。在另一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：30的重链可变区和含有SEQ ID NO：31的轻链可变区。在又一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：38的重链可变区和含有SEQ ID NO：33的轻链可变区。在另一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：34的重链可变区和含有SEQ ID NO：35的轻链可变区。在一个方面，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其结合分泌粒蛋白III并包含含有与SEQ ID NO：1、9、17、25、30、38或34至少90％同一的氨基酸序列的重链可变结构域并包含含有与SEQ ID NO：2、10、18、26、31、33或35至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本公开提供编码本文所述的抗体或抗原结合片段的核酸。在一个方面，本公开提供包含编码本文所述的抗体或抗原结合片段的核酸的表达载体以及用所述表达载体转化的宿主细胞。
在一个方面，本公开提供药物组合物，其包含本文所述的抗体或抗原结合片段和生理上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。在另一个方面，本公开提供试剂盒，其包含本文所述的抗体或抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。
本公开还提供本文所述的抗体和抗原结合片段的医学用途。在一个方面，治疗有此需要的受试者的nAMD的方法包括施用治疗有效量的本文所述的抗体、其抗原结合片段或药物组合物。例如，所述抗体、其抗原结合片段、或药物组合物以有效抑制CNV和/或息肉状脉络膜血管病变(PCV)的量施用，后者被认为是nAMD的变体。
在一个方面，提供治疗有此需要的受试者的糖尿病性视网膜病变的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的抗体、其抗原结合片段或药物组合物。在另一个方面，提供治疗有此需要的受试者的早产儿视网膜病变的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的抗体、其抗原结合片段或药物组合物。例如，所述抗体、其抗原结合片段、或药物组合物以有效减少视网膜血管渗漏和/或视网膜新血管形成和/或脉络膜新血管形成的量施用。
在一个方面，提供治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的抗体、其抗原结合片段或药物组合物。例如，所述抗体、其抗原结合片段、或药物组合物以有效降低肿瘤负荷(例如，减小肿瘤大小或降低体内癌细胞数量)的量施用。
在另一个方面，提供治疗有此需要的受试者的血管生成相关疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的抗体、其抗原结合片段或药物组合物。例如，血管生成相关疾病是选自下列的疾病：新生血管性青光眼，角膜新血管形成，翼状胬肉，视网膜静脉阻塞，由于近视的视网膜和黄斑新血管形成，炎性病症，遗传性视网膜营养不良，和镰状细胞视网膜病变，关节炎，滑膜炎，骨髓炎，骨赘形成，多发性硬化，血管畸形，自身免疫病，动脉粥样硬化，移植性动脉病，肥胖症，银屑病，疣，变应性皮炎，瘢痕疙瘩，化脓性肉芽肿，水疱病，卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)(例如，在艾滋病患者中)，原发性肺动脉高压，哮喘，鼻息肉，炎性肠病，牙周病，肝硬化，腹水，腹膜粘连，子宫内膜异位症，子宫出血，卵巢囊肿，卵巢过度刺激，再狭窄，和囊性纤维化。
前述概要并非旨在限定本发明的每个方面，并且本公开的其它特征和优点将从包括附图在内的以下详细描述中变得显而易见。本公开旨在作为统一文档叙述，并且应当理解，本文描述的特征的所有组合都在考虑之内，即使所述特征的组合并未在本公开的相同句子、段落或部分中一起找到。另外，作为另外的方面，本公开包括以任何方式在范围上比上面具体提到的变化形式更窄的所有本发明实施方式。关于在没有指示具体数量的情况下描述或要求保护的本公开的方面，应当理解，除非上下文明确要求更有限制的含义，否则这意味着“一或多”。关于作为集内的一个或多个来描述的元素，应该理解，该集合内的所有组合均考虑在内。如果本公开的方面被描述为“包含”特征，则实施方式也考虑了“由所述特征组成”或“基本上由所述特征组成”。在本公开的方面被描述为“治疗方法”的情况下，应领会，也考虑了所公开的抗体或其抗原结合片段在所提及的疾病或病症中的应用。例如，本公开考虑了本文所述的抗体或其抗原结合片段在下列各项中的应用：治疗有此需要的受试者的新生血管性年龄相关性黄斑变性；治疗有此需要的受试者的糖尿病性视网膜病变；或治疗有需要的受试者的早产儿视网膜病变；治疗有此需要的受试者的眼睛中血管生成相关疾病，所述疾病任选选自新生血管性青光眼、角膜新血管形成、翼状胬肉、视网膜静脉阻塞、由于近视的视网膜和黄斑新血管形成、炎性病症，、遗传性视网膜营养不良和镰状细胞视网膜病变。根据本申请的整个内容，本公开的其它特征和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且所有这样的特征旨在作为本公开的方面。
附图说明
图1A至图1I描绘了Scg3作为血管生成因子的体外表征。图1A显示了在48孔板中用Scg3(1μg/mL)或VEGF(50ng/mL)处理的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的内皮增殖测定的结果(n＝4)，图1B显示了用Scg3(1μg/mL)、VEGF(50ng/mL)或亲和纯化的抗-Scg3多克隆抗体(pAb)(2μg/mL)处理的人视网膜微血管内皮细胞(HRMVEC)的内皮细胞增殖测定的结果(n＝8)。细胞数量在48小时时定量。图1C至1E显示了用HUVEC的小管形成测定的结果和每视野的总小管长度(图1C)、每视野的小管数量(图1D)和每视野的分支点数(n＝4)(图1E)的定量。图1F显示了用Scg3(15ng/mL)、VEGF(2.5ng/mL)或抗-Scg3 pAb(30μg/mL)处理的HRMVEC的球状体发芽(平均发芽长度)(n＝8)。图1G显示了用VEGF和Scg3处理的HRMVEC的迁移(n＝3)。图1H显示了用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(对照)、VEGF(100ng/mL)和Scg3(1μg/mL)处理的细胞的内皮通透性(n＝3)。将单有PBS、VEGF或Scg3的FITC-葡聚糖添加到具有transwell插件的板的下室中，并在24小时后，从上室收集培养基并定量泄漏的FITC。图1I显示了用Scg3(15ng/mL)、VEGF(2.5ng/mL)、或抗-Scg3 pAb(30μg/mL)处理的HUVEC的球状体发芽(平均发芽长度)(n＝8)。
图2A至图2C描绘了糖尿病和健康动物中角膜血管生成的定量。图2A显示了用PBS、Scg3、肝细胞瘤衍生生长因子相关蛋白3(HRP-3或Hdgfrp3)和VEGF处理的健康和糖尿病小鼠的角膜血管总数(左手条形图＝健康；右手条形图＝糖尿病)。图2B显示了血管分支点的数量。图2C显示了总血管生成评分。该研究是盲法的，n值表示分析的角膜数。统计显著性使用单向ANOVA检验计算。
图3A至图3F描绘了糖尿病性视网膜病变的抗-Scg3疗法。图3A显示了在用抗-Scg3pAb、针对无关抗原的模拟亲和纯化pAb、对照兔IgG、抗-Scg3单克隆抗体(mAb)克隆49(全部为0.36μg/μL/眼)、阿柏西普(2μg/μL/眼)或PBS经由玻璃体内注射处理的链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠中DR的抗-Scg3疗法。图3B显示了用Scg3(1μg/mL)，VEGF(50ng/mL)、或抗-Scg3 mAb(2μg/mL)处理的细胞中抗-Scg3 mAb抑制Scg-3诱导的HRMVEC增殖(n＝3)。图3C显示用对照兔IgG(0.36μg/μL/眼)、抗-Scg3 mAb(克隆49)(0.36μg/μL/眼)或阿柏西普(2μg/μL/眼)处理的Ins2Akita糖尿病小鼠中DR的抗-Scg3疗法(n＝3至4)。图3D显示了用抗-Scg3 mAb克隆78(0.36μg/μL/眼，n＝4)处理的STZ诱导的糖尿病小鼠中DR的抗-Scg3疗法。统计显著性使用单向ANOVA检验计算。图3E显示了在抗-Scg3 mAb克隆7、克隆16、克隆49、克隆153、克隆162和克隆190的存在下，Scg3对克隆49的竞争性结合，图3F显示了Scg3对克隆78的竞争性结合(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对比单独的单链可变片段(scFv)，t-检验。
图4A至图4D描绘了OIR的抗-Scg3疗法。图4A显示了用PBS、对照兔IgG(0.36μg/μL/眼)、阿柏西普(2μg/μL/眼)，抗-Scg3 pAb(0.36μg/μL/眼)or抗-Scg3 mAb(Clone 49)(0.36μg/μL/眼)处理的Ins2Akita糖尿病小鼠中OIR的代表性图像(n＝4至13)。箭头指示新血管形成(NV)和NV簇。图4B显示了NV的定量，图4C显示NV簇数的定量，图4D显示分支点的定量。统计显著性使用单向ANOVA检验计算。
图5A至图5E描绘了激光诱导的CNV渗漏的抗-Scg3疗法。在小鼠第0天用激光光凝处理。在第3天玻璃体内注射PBS、对照兔IgG(0.36μg/μL/眼)、阿柏西普(2μg/μL/眼)、抗-Scg3 pAb(0.36μg/μL/眼)或抗-Scg3 mAb(克隆49)(0.36μg/μL/眼)。图5A显示了第7天的荧光素血管造影图像，图5B显示了图5A中CNV荧光强度的定量。在第8天处死小鼠。图5C显示了CNV 3D体积的定量，图5D显示CNV病变大小的定量，图5E显示了CNV血管密度(即荧光强度)。在条形图的底部指示了激光光斑点的数量，并使用单向ANOVA检验计算与对照IgG相比的统计显著性。
图6A至图6C描绘了抗-Scg3mAb对Scg3功能活性的中和。图6A显示了抗-Scg3mAb抑制Scg3诱导的HRMVEC增殖。细胞在存在或不存在抗-Scg3克隆49mAb(2μg/mL)下与Scg3(1μg/mL)一起温育48h。定量每孔的细胞数(n＝6)。图6B显示了抗-Scg3mAb阻断Scg3诱导的Src激酶活化。HRMVECS在存在或不存在抗-Scg3克隆49mAb(2μg/mL)下与Scg3(1μg/mL)一起温育10min并通过Western印迹分析。图6C显示了磷酸化Src(P-Src)信号强度的定量(n＝5)。
图7A至图7D描绘了基质胶诱导的CNV的抗-Scg3疗法。图7A显示了荧光素血管造影的代表性图像。基质胶在第0天视网膜下注射。随后在第0、2和4天皮下注射兔对照IgG(25μg/kg体重)、小鼠对照IgG1(25μg/kg)、阿柏西普(250μg/kg)、抗-Scg3 pAb(25μg/kg)或抗-Scg3 mAb克隆49或克隆78(25μg/kg)。在第7天进行荧光素血管造影以分析CNV渗漏。图7B显示了用兔对照IgG、小鼠对照IgG1、阿柏西普、抗-Scg3 pAb或抗-Scg3 mAb克隆49处理的小鼠中CNV渗漏的定量。测试的小鼠数量显示在条形图的底部，并使用单向ANOVA检验计算统计显着性。图7C显示了用抗-Scg3mAb克隆78处理的小鼠中荧光素血管造影的代表性图像。图7D显示了用对照IgG和抗-Scg3mAb克隆78处理的小鼠中CNV渗漏的定量。
图8A至图8C描绘了Scg3和VEGF表达的调节。图8A显示了来自用Scg3(1μg/mL)和VEGF(100ng/mL)处理的HRMVEC的Western印迹，表明Scg3不调节VEGF表达，反之亦然(n＝6)。图8B显示了Scg3表达的定量(n＝5)。图8C显示了VEGF表达的定量(n＝3)。
图9A和图9B描绘了癌症的抗-Scg3疗法。图9A显示了比较配体组学分析，表明Scg3是肿瘤相关的内皮配体。图9B显示了与对照小鼠IgG1(n＝4)相比，腹膜内施用抗-Scg3mAb显著降低了小鼠中人乳腺癌异种移植物的大小。
具体实施方式
本公开提供了抗-Scg3抗体及其片段和衍生物，以及它们在例如治疗DR、nAMD、ROP和癌症中的用途。
分泌粒蛋白III(Scg3或1B1075)属于粒蛋白家族，其调节分泌颗粒的生物发生(Hosaka和Watanabe.Endocrine journal.2010；57(4):275-86；Taupenot等人N Engl JMed.2003；348(12):1134-49)。粒蛋白家族的其它成员包括嗜铬粒蛋白A(CgA)、嗜铬粒蛋白B(CgB)和分泌粒蛋白II-VII(Scg2-7)(Helle KB.Biol Rev Camb Philos Soc.2004；79(4):769-94)。CgA可调节血管生成(Helle和Corti.Cell Mol Life Sci.2015；72(2):339-48)。Scg3是CgA的结合配偶体并在分泌颗粒生物发生和肽激素分泌中起重要作用(Hosaka和Watanabe.Endocrine journal.2010；57(4):275-86)。据报道，Scg3由功能障碍的β细胞分泌，因此在1型糖尿病中可能上调(Dowling等人Electrophoresis.2008；29(20):4141-9)。Scg3从动脉粥样硬化病变中的活化血小板释放(Coppinger等人Blood.2004；103(6):2096-104)，动脉粥样硬化病变是糖尿病的血管并发症之一(Rask-Madsen and King.CellMetab.2013；17(1):20-33)。像它的其它家族成员一样，Scg3是一种经典的信号肽，可以分泌到细胞外间隙(Dowling等人Electrophoresis.2008；29(20):4141-9)。
Scg3尚未被报道为细胞配体或血管生成因子。Scg3作为抗血管生成疗法的靶标在美国专利申请No.14/708,073中讨论，该专利申请通过引用并入本文中。本公开涉及抗-Scg3疗法，例如抗-Scg3 mAb，其提供了独特的疾病相关活性、高效力、副作用最少、灵活的施用途径和与VEGF截然不同的信号传导途径的优点，用于治疗和预防DR、nAMD和癌症。
以下定义可用于帮助技术人员理解本公开。除非本文另有定义，否则用于本公开中的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数形式的术语应包括多数形式，而多数形式的术语应包括单数形式。一般而言，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的命名法和技术是本领域公知和常用的那些。在实施本发明时，使用了分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学中的许多常规技术，它们都在本领域的技术范围内。这样的技术更详细地描述于，例如，下列文献中：分子克隆：实验室手册第3版(Molecular Cloning：a Laboratory Manual 3rd edition)，J.F.Sambrook和D.W.Russell编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001；用于免疫疗法的重组抗体(Recombinant Antibodies for Immunotherap)y，Melvyn Little编著，CambridgeUniversity Press 2009；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(M.J.Gait编著，1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”(R.I.Freshney编著，1987)；“酶学方法(Methods in Enzymology)”(Academic Press，Inc.)；“分子生物学现行方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)”(F.M.Ausubel等人编著，1987，并定期更新)；“PCR：聚合酶链式反应(PCR：The Polymerase Chain Reaction)”(Mullis等人编著，1994)；“分子克隆的实用指南(APractical Guide to Molecular Cloning)”(Perbal Bernard V.，1988)；“(噬菌体展示：实验室手册)Phage Display：A Laboratory Manual”(Barbas等人，2001)。这些参考文献和包含本领域技术人员广泛已知和依赖的标准方案的其它参考文献，包括制造商的说明书，其内容通过引用并入作为本公开的一部分。
用于本文中时，“抗体”是指它们在生物化学和生物技术领域中的平常含义。在本文使用的术语含义内的抗体包括：从生物来源分离的抗体，例如由杂交瘤产生的抗体，通过重组DNA技术制备的抗体(在本文中有时也称为重组抗体)，包括通过涉及激活内源基因方法和涉及表达外源表达构建体的方法制备的抗体，包括在细胞培养物中制备的抗体以及在转基因植物和动物中制备的抗体，以及通过涉及化学合成的方法、包括肽合成和半合成而制备的抗体。除非另有明确说明，否则在本文使用的术语范围内是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和多价(例如双特异性)抗体等。在一个方面，抗体不是多克隆抗体。原型抗体是四聚体糖蛋白，其包含由二硫键接合在一起的两个相同的轻链-重链二聚体。有两种类型的脊椎动物轻链，κ和λ。每条轻链包含恒定区和可变区。κ和λ轻链的区别通过它们的恒定区序列来区分。有五种类型的脊椎动物重链：α、δ、ε、γ和μ，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链包含可变区和恒定区，其通常包含三个结构域。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为CDR，散布有更保守的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链形成两个区域：Fab(片段，抗原结合)区，也称为可变(Fv)区，和Fc(片段，可结晶)区。重链和轻链的可变区(Fv)含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定(Fc)区可介导与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。本文提及的术语“抗体”包括完整的全长抗体(例如，具有两条重链和两条轻链的免疫球蛋白)。应领会，本文所述的抗体特征也适用于其保留了抗原结合区或其单链的任何片段或衍生物。
术语抗体的“抗原结合区”是指赋予抗原特异性的区域或部分；因此，其抗原结合片段包括保留特异性结合抗原的能力的抗体部分(例如，HLA-肽复合物)。
术语“片段”用于本文时是指与相应的全长抗体相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。包含在术语“片段”内的抗体片段的例子包括：Fab片段；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab’)2片段；包含通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的单结构域抗体(dAb)(Ward等人Nature 1989；341:544-546)；分离的CDR；和scFv。
术语“衍生物”是指已被化学修饰的抗体或其抗原结合片段，例如经由缀合到另一个化学部分(例如，聚乙二醇或白蛋白，例如人血清白蛋白)、磷酸化、和/或糖基化。
“scFv”是单价分子，其可以通过使用重组方法将Fv片段的两个结构域VL和VH通过合成接头进行接合来工程改造，所述合成接头使得它们能够被制成单条蛋白链(参见例如，Bird等人Science，1988；242:423-426；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.1988；85:5879-5883)。这样的单链抗原结合肽也意欲包括在术语“抗体”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
术语“交叉阻断”、“交叉阻断的”和“交叉阻断性”在本文中可互换使用，意指抗体或其它抗原结合蛋白干扰(例如，抑制)其它抗体或抗原结合蛋白与Scg3结合的能力。检测交叉阻断的方法在下文描述。
术语“治疗有效的”或“有效的”取决于受试者的状况和施用的特异性抗体或其抗原结合片段。该术语是指达到期望的临床效果的有效量。有效量随所治疗的病症的性质、期望的活性的时间长度以及受试者的年龄和状况而变化，并最终由保健提供者确定。在各个方面，治疗有效量是有效预防与本文所述的疾病或病症(例如，DR、nAMD、ROP和与过度血管生成相关的疾病)相关的症状、延迟其发作或减轻其严重性的量，所述疾病或病症包括血管生成(例如PDR)、内皮细胞和/或周细胞凋亡、血管渗漏(例如视网膜血管渗漏)、白细胞附着、无细胞毛细血管、微动脉瘤、视网膜静脉阻塞、新血管形成(例如，脉络膜和视网膜)、视力丧失、以及任何前述各项的组合。在另一个方面，治疗有效量是有效降低肿瘤负荷、抑制细胞增殖(例如，癌细胞增殖)、减小肿瘤大小、抑制肿瘤生长、或任何前述各项的组合的量。
术语“治疗”包括防止性(例如预防性)、姑息性、治疗性和治愈性疗法。
本公开提供了与Scg3特异性结合的抗体及其抗原结合片段，例如抗-Scg3单克隆抗体。在一个方面，结合Scg3并包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的抗体或其抗原结合片段，其中(a)CDR-H1包含选自由SEQ ID NO：3、11、19和27组成的组中的氨基酸序列；(b)CDR-H2包含选自由SEQ ID NO：4、12和20组成的组中的氨基酸序列；(c)CDR-H3包含选自由SEQ ID NO：5、13、21和28组成的组中的氨基酸序列；(d)CDR-L1包含选自由SEQ ID NO：6、14、22和32组成的组中的氨基酸序列；(e)CDR-L2包含选自由SEQ ID NO：7、15、23和29组成的组中的氨基酸序列；以及(f)CDR-L3包含选自由SEQ ID NO：8、16和24组成的组中的氨基酸序列。在另一个方面，结合分泌粒蛋白III的抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO：1、9、17、25、30、38或34至少90％同一的氨基酸序列的重链可变区并包含含有与SEQ ID NO：2、10、18、26、31、33或35至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
表1中提供了本文所述的抗体和抗原结合片段的序列信息(下划线的CDR序列)。
表1
在一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：3；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：5；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：6；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：7；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：8。任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO：1至少90％同一的氨基酸序列的重链可变区和含有与SEQ ID NO：2至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：11；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：12；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：13；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：14；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：15；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：16。任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ IDNO：9至少90％同一的氨基酸序列的重链可变区和含有与SEQ ID NO：10至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在又一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：19；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：20；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：21；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：22；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：23；and(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ IDNO：17至少90％同一的氨基酸序列的重链可变区和含有与SEQ ID NO：18至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：27；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：28；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：22；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：29；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ ID NO：25至少90％同一的氨基酸序列的重链可变区和含有与SEQ ID NO：26至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：27；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：28；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：32；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：29；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ IDNO：30至少90％同一的氨基酸序列的重链可变区和含有与SEQ ID NO：31至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在又一个例子中，所述抗体或其抗原结合片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：3；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：28；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：22；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：29；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。任选地，所述抗体或其抗原结合片段包含含有与SEQ IDNO：38至少90％同一的氨基酸序列的重链可变区和含有与SEQ ID NO：33或35至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
对于本文公开的任何抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ ID NO：1、9、17、25、30、38或34至少90％同一的氨基酸序列的重链可变域并包含含有与SEQ ID NO：2、10、18、26、31、33或35至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区，所述重链可变结构域和/或轻链可变区与前述SEQ ID NO之一至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一。
在一个方面，所述抗原结合片段是Fab片段、F(ab’)2片段或scFv。
在另一个方面，本公开提供一种抗体或其抗原结合片段，其交叉阻断参考抗体与分泌粒蛋白III结合，其中所述参考抗体选自由下列所组成的组：包含SEQ ID NO：3-8的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：11-16的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：19-24的CDR的抗体；包含SEQID NO：27、4、28、22、29和24的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：27、4、28、32、29和24的CDR的抗体；以及包含SEQ ID NO：3、4、28、22、29和24的CDR的抗体。例如，所述参考抗体选自由下列所组成的组：包含含有SEQ ID NO：1的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：9的重链可变区和含有SEQ ID NO：10的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：17的重链可变区和含有SEQ ID NO：18的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ IDNO：25的重链可变区和含有SEQ ID NO：26的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：30的重链可变区和含有SEQ ID NO：31的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：38的重链可变区和含有SEQ ID NO：33的轻链可变区的抗体；以及包含含有SEQ ID NO：34的重链可变区和含有SEQ ID NO：35的轻链可变区的抗体.
所述抗体或其抗原结合片段是使用任何合适的方法产生的，例如，从被免疫的动物中分离、重组或合成生成、或基因工程改造。例如，与特定抗原结合的单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法获得(参见，例如，Kohler等人Nature 256:495，1975；Coligan等人(编著)，免疫学现行方案(Current Protocols in Immunology)，1:2.5.12.6.7(JohnWiley&Sons 1991)；美国专利No.RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993；单克隆抗体，杂交瘤：生物分析的新维度(Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimensionin Biological Analyses)，Plenum Press，Kennett，McKearn，和Bechtol(编著)(1980)；以及抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Harlow and Lane(编著)，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1988)；Picksley等人“产生针对在大肠杆菌中表达的蛋白的单克隆抗体(Production of monoclonal antibodies against proteinsexpressed in E.coli)”,在Glover等人(编著)的DNA克隆2：表达系统(DNA Cloning 2：Expression Systems)第二版中，93页(Oxford University Press 1995))。单克隆抗体可以根据本领域已知的和本文描述的方法，通过用包含人Scg3或其片段的免疫原注射动物例如大鼠、仓鼠、兔、或优选小鼠、包括例如本领域已知的转基因或敲除的小鼠而获得。特异性抗体产生的存在可以在初始注射后和/或加强注射后，通过获得血清样品并使用本领域已知和本文中描述的几种免疫检测方法中的任何一种检测与人Scg3或肽结合的抗体的存在来监测。从产生期望抗体的动物中，除去淋巴样细胞，最常见的是来自脾或淋巴结的细胞，以获得B淋巴细胞。然后将B淋巴细胞与药物致敏的骨髓瘤细胞融合伴侣、优选与被免疫的动物同源并任选具有其它所希望的性质(例如，不能表达内源Ig基因产物，例如P3X63-Ag8.653(ATCC No.CRL 1580)；NSO，SP20)的骨髓瘤细胞融合伴侣融合以产生杂交瘤，其是永生的真核细胞系。所述淋巴样(例如，脾)细胞和骨髓瘤细胞可以与膜融合促进剂、例如聚乙二醇或非离子洗涤剂合并几分钟，然后在支持杂交瘤细胞但不是未融合的骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上以低密度平板接种。优选的选择培养基是HAT(次黄嘌呤，氨基喋呤，胸苷)。足够的时间后，通常约一至两周后，观察细胞集落。分离单个集落，并且可以使用本领域已知和本文描述的各种免疫测定中的任何一种来测试细胞产生的抗体与人Scg3的结合活性。将杂交瘤克隆(例如，通过有限稀释克隆法或通过软琼脂噬斑分离)，并选择和培养产生Scg3特异性抗体的阳性克隆。来自杂交瘤培养物的单克隆抗体可以从杂交瘤培养物的上清液中分离。用于产生鼠单克隆抗体的替代方法是将杂交瘤细胞注射到同系小鼠、例如已经处理过的(例如，姥鲛烷致敏的)小鼠的腹膜腔中，以促进含有单克隆抗体的腹水形成。单克隆抗体可以通过各种成熟的技术分离和纯化。这样的离技术包括用蛋白A琼脂糖的亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱(参见，例如，Coligan 2.7.1-2.7.12页和2.9.1-2.9.3页；Baines等人，“免疫球蛋白G(IgG)的纯化(Purification of Immunoglobulin G(IgG))”，在分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，第10卷，79-104页中(TheHumana Press，Inc.1992))。单克隆抗体可以使用基于抗体的特定性质(例如，重链或轻链同种型、结合特异性等)选择的合适配体，通过亲和色谱纯化。固定在固体支持物上的合适配体的例子包括蛋白A、蛋白G、抗恒定区(轻链或重链)抗体、抗独特型抗体和TGFβ结合蛋白、或其片段或变体。
抗体的片段、衍生物或类似物也可以使用本领域公知的技术容易地制备。源自于抗体的抗原结合片段可以，例如，通过抗体的蛋白水解性水解获得，例如，根据常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体。举例来说，抗体片段可以通过用胃蛋白酶来酶促裂解抗体以提供称为F(ab’)2的5S片段来产生。该片段可以使用硫醇还原剂进一步裂解以产生3.5S Fab’单价片段。任选地，可以使用由二硫键裂解产生的巯基的封闭基团来进行裂解反应。作为替代方案，使用木瓜蛋白酶的酶促裂解直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法例如由下列文献描述：Goldenberg，美国专利No.4,331,647，Nisonoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89:230，1960；Porter，Biochem.J.73:119，1959；Edelman等人，在酶学方法(Methods in Enzymology)1:422中(Academic Press 1967)；以及Andrews，S.M.和Titus，J.A.在免疫学现行方案(Current Protocols in Immunology)(Coligan J.E.等人，编著)中，John Wiley&Sons，New York(2003)，2.8.1-2.8.10和2.10A.1-2.10A.5页。也可以使用其它裂解抗体的方法，例如分离重链以形成单价轻链重链片段(Fd)、进一步裂解片段、或其它酶促、化学或遗传技术，只要片段与完整抗体识别的抗原结合即可。
抗体或其片段也可以是遗传工程改造的。例如，在各个方面，抗体或抗体片段包含，例如，通过重组DNA工程技术生成的可变区结构域。在这方面，任选通过抗体的氨基酸序列中的插入、缺失或改变来修饰抗体可变区，以产生目的抗体。编码目的CDR的多核苷酸例如通过使用聚合酶链反应或基因合成以利用抗体产生细胞的mRNA作为模板合成可变区来制备(参见，例如，Courtenay Luck，“单克隆抗体的遗传操作(Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies)”，在Ritter等人(编著)的单克隆抗体：产生，工程改造和临床应用(Monoclonal Antibodies:Production，Engineering and Clinical Application)中，166页(Cambridge University Press 1995)；Ward等人，“遗传操作和抗体表达(GeneticManipulation and Expression of Antibodies)”，在Birch等人(编著)的单克隆抗体：原理及应用(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications)中，137页(WileyLiss，Inc.1995)；以及Larrick等人，方法：酶学中方法的同伴(Methods:A Companion toMethods in Enzymology)，2：106-110，1991)。现行的抗体操作技术允许构建工程可变区结构域，其含有来自第一抗体的至少一个CDR和任选的一个或多个构架氨基酸以及来自第二抗体的其余部分可变区结构域。这样的技术用于例如将抗体人源化或改善其对结合靶标的亲和力。人源化抗体是其中非人免疫球蛋白的重和轻可变链的CDR被转移到人可变结构域中的抗体。恒定区不需要存在，但如果它们存在，则在各种实施方式中，它们任选与人免疫球蛋白恒定区基本同一，即至少约85-90％、约95％或更高同一。因此，在一些情况下，除了可能的CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本同一。例如，在一个方面，人源化抗体是人免疫球蛋白(宿主抗体)，其中宿主抗体的高变区残基被来自具有所期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换。
抗体的抗原结合片段的一种形式是包含抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的肽。CDR(也称为“最小识别单位”或“高变区”)可以通过构建编码目的CDR的多核苷酸来获得。这样的多核苷酸，例如，通过使用聚合酶链反应以利用抗体产生细胞的mRNA作为模板合成可变区来制备(参见，例如，Larrick等人，方法：酶学中方法的同伴(Methods:ACompanion to Methods in Enzymology)2:106，1991；Courtenay-Luck，“单克隆抗体的遗传操作(Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies)”，在Ritter等人(编著)的单克隆抗体：产生，工程改造和临床应用(Monoclonal Antibodies:Production，Engineeringand Clinical Application)中，166页(Cambridge University Press 1995)；以及Ward等人，“遗传操作和抗体表达(Genetic Manipulation and Expression of Antibodies)”，在Birch等人(编著)的单克隆抗体：原理及应用(Monoclonal Antibodies:Principles andApplications)中，137页(Wiley-Liss，Inc.1995))。
因此，在一个实施方式中，其抗原结合片段包含至少一个如本文所述的CDR。其抗原结合片段可包含至少两个、三个、四个、五个或六个如本文所述的CDR。所述抗体或其抗原结合片段还可包含本文所述抗体的至少一个可变区结构域。所述可变区结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并一般将包含至少一个负责结合人Scg3的CDR序列，例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和/或本文具体描述的并与一个或多个构架序列相邻或与其一起在框内的轻链CDR。一般而言，可变(V)区结构域可以是免疫球蛋白重链(VH)和/或轻链(VL)可变结构域的任何合适排列。因此，例如，所述V区结构域可以是单体的并且是VH或VL结构域，其如下所述能够以至少等于1x 10-7M或更低的亲和力独立地结合Sgc3。或者，所述V区结构域可以是二聚体的并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。所述V区二聚体包含至少一个VH和至少一个VL链，其可以是非共价结合的(下文称为FV)。如果需要，所述链可以直接共价偶联，例如经由两个可变结构域之间的二硫键，或通过接头、例如肽接头共价偶联，以形成单链Fv(scFV)。
所述可变区结构域可以是任何天然存在的可变结构域或其工程版本。工程版本是指使用重组DNA工程技术创造的可变区结构域。这样的工程版本包括，例如，通过特定抗体的氨基酸序列中的插入、缺失或改变或对其进行插入、缺失或改变而从特定抗体的可变区创造的那些。具体例子包括含有来自第一抗体的至少一个CDR和任选的一个或多个构架氨基酸以及来自第二抗体的可变区结构域其余部分的工程可变区结构域。
在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段可以与聚合物、脂质或其它部分化学键合。例如，所述抗体或其抗原结合片段可包含一种或多种水溶性聚合物附着物，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见，例如，美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段衍生物包含单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其它碳水化合物基聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇中的一种或多种，以及这样的聚合物的混合物。在某些实施方式中，一种或多种水溶性聚合物随机附着于一个或多个侧链上。在某些实施方式中，PEG可起到改善结合剂例如抗体的治疗能力的作用。某些这样的方法在例如美国专利No.4,522,587中讨论，所述美国专利在此为了任何目的通过引用并入。
所述抗体或其片段优先与Scg3结合，意味着所述抗体或其片段结合Scg3的亲和力大于它结合不相关的对照蛋白。更优选地，所述抗体或其片段特异性识别并结合Scg3或其部分。“特异性结合”是指所述抗体或其片段与Scg3结合的亲和力比对无关对照蛋白的亲和力大至少5、10、15、20、25、50、100、250、500、1000、或10,000倍。在一些变化形式中，所述抗体或其片段基本上排他性地结合Scg3，即，借助于结合亲和力的可测量的差异，能够将Scg3与其它已知多肽(例如，其它粒蛋白)区分开。抗体或其片段对Scg3的结合亲和力可以小于或等于1x 10-7M，小于或等于1x 10-8M，小于或等于1x 10-9M，小于或等于1x 10-10M，小于或等于1x 10-11M，或者小于或等于1x 10-12M。亲和力可以通过亲和ELISA测定来确定。在某些实施方式中，亲和力可以通过BIAcore(GE Healthcare Bio-Sciences，Pittsburgh，PA)或Octet(Pall ForteBio，Menlo Park，CA)测定来确定。在某些实施方式中，亲和力可以通过动力学方法确定。在某些实施方式中，亲和力可以通过平衡/溶液法确定。这样的方法在本文中进一步详细描述或是本领域中已知的。
在各个方面，所述抗体或其抗原结合片段在本文所述的基于细胞的测定和/或本文所述的体内测定中调制Scg3功能和/或交叉阻断本申请中描述的抗体之一的结合和/或被本申请中描述的抗体之一交叉阻断结合Scg3。因此，可以使用本文描述的测定法鉴定这样的抗体或其抗原结合片段。
应领会，本公开的抗体或抗原结合片段相对于本文提供的氨基酸序列可具有至少一个氨基酸取代，条件是所述结合剂保留结合特异性。因此，对抗体或其抗原结合片段的修饰包括在本发明的范围内。这些可包括氨基酸取代，其可以是保守的或非保守的，不破坏抗体或其抗原结合片段的Scg3结合能力。保守氨基酸取代可包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成来掺入。这些包括肽模拟物和其它反向或反转形式的氨基酸部分。保守氨基酸取代还可以涉及用标准(normative)残基取代天然氨基酸残基，使得对该位置处氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响。非保守取代可涉及将一类氨基酸或氨基酸模拟物的成员与来自具有不同物理性质(例如大小，极性，疏水性，电荷)的另一类中的成员交换。这样的取代的残基可以被引入人抗体的与非人抗体同源的区域中、或所述分子的非同源区域中。
此外，本领域技术人员可以生成在每个目标氨基酸残基处含有氨基酸取代的测试变体。然后可以使用本领域技术人员已知的活性测定法筛选所述变体。这样的变体可用于搜集关于合适的变体的信息。例如，如果发现对特定氨基酸残基的改变导致活性破坏、不利降低或不适合，则可以废除具有这样的改变的变体。换句话说，基于从这样的常规实验搜集的信息，本领域技术人员可以容易地确定应该避免单独的或与其它突变相结合的进一步取代的氨基酸。
有经验的技术人员将能够使用公知的技术确定如本文阐述的多肽的合适变体。在某些实施方式中，本领域技术人员可以通过靶向不被认为对活性重要的区域来鉴定可以改变而不破坏活性的合适的分子区域。在某些实施方式中，可以鉴定所述分子在相似多肽中保守的残基和部分。在某些实施方式中，即使对生物活性或结构可能重要的区域也可以进行保守氨基酸取代而不破坏生物活性或不会不利影响多肽结构。
另外，本领域技术人员可以回顾鉴定相似的多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这样的比较，可以预测蛋白质中与相似的蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基的重要性。对于这样预测的重要氨基酸残基，本领域技术人员可以选择化学上相似的氨基酸取代。
本领域技术人员还可以分析相似多肽中的三维结构和与该结构相关的氨基酸序列。鉴于这样的信息，本领域技术人员可以预测抗体相对于其三维结构的氨基酸残基比对。在某些实施方式中，本领域技术人员可以选择对于预测在蛋白质表面上的氨基酸残基不进行根本改变，因为这样的残基可能参与与其它分子的重要相互作用。
如果抗体或其抗原结合片段与上表1中的至少一种CDR、和/或与交叉阻断表1中的至少一种抗体与Scg3结合的抗-Scg3抗体的CDR具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；和/或被表1中的至少一种抗体交叉阻断与Scg3、和/或与抗-Scg3抗体的CDR结合，则其在本发明的范围内，其中所述抗-Scg3抗体在细胞基测定中可以阻断Scg3的作用。如果抗体或其抗原结合片段与表1中至少一种抗体的可变区具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列并交叉阻断表1中的至少一种抗体与Scg3的结合，和/或被表1中抗体的至少一种抗体交叉阻断与Scg3的结合；和/或可以在细胞基测定中阻断Scg3的作用，则其也在本发明的范围内。
在一个方面，本公开提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段的编码核酸。本公开还提供了包含所述核酸的表达载体。编码各CDR序列的核酸可以基于CDR的氨基酸序列确定，并酌情使用寡核苷酸合成技术、定点诱变和聚合酶链反应(PCR)技术与任何所需的抗体可变区构架和恒定区多核苷酸序列一起合成。从遗传序列数据库例如GENBANK中，本领域技术人员可广泛获得可变区构架和恒定区的编码。
在一个方面，本公开提供了用编码本文所述抗体或抗原结合片段的表达载体或核酸转染的宿主细胞。在某些实施方式中，抗体片段的表达可优选在原核宿主细胞例如大肠杆菌(Escherichia coli)中(参见，例如，Pluckthun等人，Methods Enzymol.1989；178:497-515)。在某些其它实施方式中，抗体或其片段的表达可优选在真核宿主细胞、包括酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、动物细胞(包括哺乳动物细胞)或植物细胞中。合适的动物细胞的例子包括但不限于骨髓瘤(例如小鼠NSO系)、COS、CHO或杂交瘤细胞。植物细胞的例子包括烟草、玉米、大豆和水稻细胞。以这种方式产生抗体的具体方法通常是公知的和常规使用的。例如，Maniatis等人描述了基本的分子生物学程序(分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，New York，1989；也参见Maniatis等人，第3版，Cold Spring HarborLaboratory，New York，(2001))。可以进行DNA测序(例如，如Sanger等人，PNAS 1977；74:5463中所述)以及可以根据本领域已知的方法进行定点诱变(Kramer等人，Nucleic AcidsRes.1984；12:9441；Kunkel Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985；82:488-92；Kunkel等人，Methods in Enzymol.1987；154:367-82)。另外，许多出版物描述了适合于通过操作DNA、创建表达载体以及转化和培养适当的细胞来制备抗体的技术(Mountain A和Adair，J R，在生物技术和基因工程评论(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews)(Tombs，M P编著，10，第1章，1992，Intercept，Andover，UK)中；“分子生物学现行方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)”，1999，F.M.Ausubel(编著)，Wiley Interscience，New York)。本领域技术人员将理解，一些蛋白质，例如抗体，可以经历多种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度往往取决于用于表达所述蛋白质的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺中的变化。经常修饰的是由于羧肽酶的作用而失去羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)(如Harris，RJ.Journal of Chromatography 1995；705:129-134中所述)。
任选地，抗体或其抗原结合片段的亲和力通过许多亲和力成熟方案中的任何一种来改善，所述方案包括维持CDR(Yang等人，J.Mol.Biol.，1995；254:392-403)、链改组(Marks等人，Bio/Technology 1992；10:779-783)、使用大肠杆菌的突变菌株(Low等人，J.Mol.Biol.，250，350-368，1996)、DNA改组(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)、和噬菌体展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.，256，7-88，1996)。Vaughan等人讨论了亲和力成熟的其它方法(Nature Biotechnology 1998；16，535-539)。
抗体或其片段的亲和力、以及抗体或其片段抑制结合的程度可以由本领域普通技术人员使用常规技术例如Scatchard等人描述的那些技术、或通过表面等离子体共振(SPR；BIAcore)或通过Octet测定来确定。对于SPR，靶分子被固定在固相上并暴露于沿着流动池运行的流动相中的配体。如果发生配体与固定化靶标的结合，则局部折射率改变，导致SPR角的变化，这可以通过检测反射光强度的变化来实时监测。可以分析SPR信号的变化速率以产生结合反应的缔合和解离阶段的表观速率常数。这些值的比率给出了表观平衡常数(亲和力)(参见，例如，Wolff等人Cancer Res.53:2560-65(1993))。对于Octet亲和力定量，将抗原用生物素标记并与探针上的链霉亲和素结合。通过检测反射光强度的变化，以与BIAcore类似的方式定量与抗原结合的抗体。抗体结合亲和力可以按类似的方式定量(Estep等人，MAbs.5:270-278(2013))。
例如，本发明的抗体可以属于任何免疫球蛋白类别，例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA。在各种实施方式中，抗体是IgG，例如IgG2或IgG4。它可以得自或源自于动物，例如，家禽(例如鸡)和哺乳动物，哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或其它啮齿动物、牛、马、绵羊、山羊、骆驼、人类、或其它灵长类动物。抗体可以是内化抗体。抗体的产生一般性公开在，例如，美国专利公布No.2004/0146888 A1中。
抗体或其它结合剂能够干扰另一种与Scg3结合的程度，以及因此是否根据本发明可以说是交叉阻断，可使用竞争结合测定来确定。一种特别合适的定量测定法使用Biacore机器，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一种合适的定量交叉阻断测定法是Octet测定。另一种合适的定量交叉阻断测定法使用基于ELISA的方法来测量抗体或其它结合剂之间在它们与Scg3结合方面的竞争。交叉阻断(即竞争)测定法在本领域中有描述，例如国际专利公布No.WO 2006/119107。
在一个方面，本公开提供药物组合物，其包含本文所述的抗-Scg3抗体或其抗原结合片段以及药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。包含抗-Scg3抗体的组合物可以是任何合适的剂型，包括但不限于片剂、胶囊、植入物、储库剂、液体、贴剂、锭剂、乳膏、凝胶、软膏、洗剂、喷雾剂、滴耳剂和滴眼剂。所使用的特定载体仅受化学-物理考虑事项例如溶解度和与缺乏抗体或共同治疗的反应性、以及施用途径的限制。生理上可接受的载体在本领域中是公知的。适于注射使用的说明性药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(例如，参见美国专利No.5,466,468)。注射制剂进一步描述于，例如，制药和药学实践(Pharmaceutics and Pharmacy Practice)，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia.Pa.，Banker和Chalmers编著，238-250(1982)页，以及ASHP注射药物手册(ASHP Handbook on Injectable Drugs)，Toissel，第四次编著，622-630页(1986))。在一个方面，包含抗-Scg3抗体的药物组合物与提供关于使用这样的药物组合物的说明书的包装材料一起放置在容器内，例如在试剂盒中。通常，这样的说明书包括描述试剂浓度的有形表达，以及在某些实施方式中，重构所述药物组合物可能必要的赋形剂成分或稀释剂(例如水、盐水或PBS)的相对量。载体可进一步包含任何和所有的溶剂、分散媒介、介质、包衣剂、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬液、胶体等。这样的介质和药剂对药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或药剂与所述活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以掺入所述组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于人类时不产生变态反应性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
施用这样的药物组合物的合适方法是本领域公知的。尽管可以使用多于一种途径来施用药剂(例如本文所述的抗体或抗原结合片段)，但是特定途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。取决于情况，将包含抗-Scg3抗体或其抗原结合片段的药物组合物施加或滴注到体腔中、通过皮肤或粘膜吸收、摄入、吸入、施用于眼睛、和/或引入循环。例如，在某些情况下，将会希望通过静脉内、皮下、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内、病灶内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠手段注射或输注、通过持续释放系统、或通过植入装置来递送包含所述药剂的药物组合物。如果需要，所述组合物(或抗体或其抗原结合片段)经由动脉内或静脉内施用给进目的区域来区域性施用。或者，所述组合物经由植入已在其上吸收或囊封了目标分子的膜、海绵或其它适当的材料来局部施用，例如，如Mylonas等人，Curr Eye Res.2016年9月9日电子发表，和Birch等人，Am J Ophthalmol.2013；156(2):283-292中所述。在使用植入装置的情况下，所述装置一方面植入任何合适的组织或器官，并且目标分子的递送是，例如，经由扩散、定时释放的浓注或连续施用。在其它方面，所述药剂在肿瘤切除术或其它外科手术期间直接施用于暴露的组织。在一个方面，所述药物组合物局部施用于眼睛，例如眼部、眼内、结膜、角膜内、玻璃体内和/或眼球后。治疗剂递送方法是有经验的技术人员公知的，其中的一些方法进一步描述于，例如，美国专利No.5,399,363中。
特定受试者的具体施用方案将部分取决于所使用的抗体或抗原结合片段、抗体或抗原结合片段的施用量、施用途径、以及任何副作用的原因和程度。根据本发明施用于受试者(例如哺乳动物，如人类)的抗体或抗体片段的量应足以在合理的时间帧内实现期望的反应。在各个方面，所述方法包括施用，例如从约0.1μg/kg直至约400mg/kg或更高(例如，0.1μg/kg直至约100mg/kg或更高)。例如，剂量范围从约0.1μg/kg直至约10mg/kg；或约5μg/kg直至约100mg/kg；或约10μg/kg直至约100mg/kg；或约1mg/kg直至约50mg/kg；或约2mg/kg直至约30mg/kg；或约3mg/kg直至约25mg/kg；或约3mg/kg直至约25mg/kg；或约5mg/kg直至约10mg/kg；或约10mg/kg直至约20mg/kg；或约10mg/kg直至约30mg/kg；或约50mg/kg直至约300mg/kg；或约100mg/kg直至约250mg/kg；或约100mg/kg直至约200mg/kg。在各个方面，所述方法包括向人类受试者的眼睛施用，例如，从约0.05mg至约10mg，例如，约0.1mg至约0.5mg，约0.05mg至约1mg，约0.2mg至约2mg，约0.5mg至约2.5mg，约2mg至约4mg，或约1mg至约5mg。一些病症或疾病状态需要延长治疗，这可能需要或可能不需要在多次施用中施用抗-Scg3治疗剂量(例如，每天、每周3次、每周一次、每两周一次、或每月一次，治疗周期为3天、7天、2周、3周、1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、2年或更长)。
在一个方面，本公开提供在有此需要的受试者中治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段或包含它们的药物组合物。在一个方面，所述抗体、其抗原结合片段、或药物组合物以有效抑制脉络膜新血管形成的量施用。
在另一个方面，本公开提供治疗有此需要的受试者的糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿(DME)和/或增生型糖尿病性视网膜病变(PDR))或早产儿视网膜病变的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段或包含它们的药物组合物。在一个方面，所述抗体、其抗原结合片段、或药物组合物以有效抑制脉视网膜血管渗漏和/或视网膜新血管形成的量施用。
在一个方面，所述抗体或其抗原结合片段或包含它们的药物组合物以有效抑制脉络膜新血管形成和/或视网膜新血管形成的量施用。与施用所述抗体、其抗原结合片段或药物组合物之前相比，脉络膜新血管形成和/或视网膜新血管形成被抑制了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。测量脉络膜和/或视网膜新血管形成的方法是本领域已知的，包括，例如，成像技术包括血管造影术(例如，使用荧光素或吲哚氰绿)，和光学相干断层扫描(OCT)。
在另一个方面，所述抗体或其抗原结合片段或包含它们的药物组合物以与治疗前相比有效减少视网膜血管渗漏的量施用。与施用所述抗体、其抗原结合片段或药物组合物之前相比，视网膜血管渗漏被抑制了例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。测量视网膜血管渗漏的方法是本领域已知的，包括例如视网膜渗透性测定(例如，使用伊文思蓝(Evans blue)染料或荧光标记)，以及成像技术包括血管造影(例如，使用荧光素或吲哚氰绿)，和OCT。
在另一个方面，所述抗体或其抗原结合片段或包含它们的药物组合物以有效治疗癌症的量施用。所述方法包括使癌细胞与有效抑制癌细胞的增殖或调制肿瘤生长的量的本文所述的抗体或其抗原结合片段或包含它们的药物组合物接触。在一些实施方式中，癌细胞在受试者中，并且所述接触包括向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。应理解，本公开的抗体及其抗原结合片段可以用于体外和体内抑制癌细胞增殖的方法中(例如，在治疗受试者的癌症的方法中)。癌症和肿瘤的例子包括但不限于，膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌(例如视网膜母细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤和眼内淋巴瘤)、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、肝癌、口腔癌、口咽癌、食道癌和胃癌。
“抑制”癌细胞增殖不要求100％防止增殖。增殖速率的任何降低都考虑在内。类似地，“调制”肿瘤生长是指减小肿瘤的大小、减缓肿瘤生长、或抑制已有肿瘤的大小增加。不要求完全消除肿瘤；肿瘤大小的任何减小或肿瘤生长的减慢均构成受试者中有益的生物效应。肿瘤质量、体积和/或长度可以使用本领域已知的方法评估，所述方法例如卡尺、超声成像、计算机断层扫描(CT)成像、磁共振成像(MRI)、光学成像(例如生物发光和/或荧光成像)、数字减影血管造影(DSA)、正电子发射断层扫描(PET)成像和/或其它成像分析。还可以使用测量例如DNA合成、代谢活性、与细胞增殖相关的抗原和/或ATP的细胞测定法来分析肿瘤细胞增殖。在各种实施方式中，本公开的方法将肿瘤的大小减小至少约5％(例如，至少约10％、至少约15％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、或至少约80％)。在这方面，与不存在本发明方法的情况下(例如，在生物学上匹配的对照受试者或未暴露于本公开的抗体或抗原结合片段的样本中)观察到的增殖水平相比，癌细胞增殖被抑制了例如，至少约5％、至少约10％或至少约20％。效果通过例如肿瘤大小的减小、癌症标志物水平的降低或维持、或癌细胞群的减少或维持来检测。在一些实施方式中，与不存在本公开的抗体或其抗原结合片段情况下的增殖相比，增殖减少了至少约30％、至少约40％、至少约50％、或至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多(约100％)。
在另一个方面，所述抗体或其抗原结合片段或包含它们的药物组合物以有效治疗与过度血管生成相关的疾病的量施用。血管生成相关疾病的例子包括但不限于：眼睛的疾病，包括新生血管性青光眼、角膜新血管形成、翼状胬肉、视网膜静脉阻塞、由于近视的视网膜和黄斑新血管形成、炎性病症、遗传性视网膜营养不良、和镰状细胞视网膜病变，以及非眼疾病，包括关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成、多发性硬化、血管畸形、自身免疫病、动脉粥样硬化、移植性动脉病、肥胖症、银屑病、疣、变应性皮炎、瘢痕疙瘩、化脓性肉芽肿、水疱病、卡波西肉瘤(例如在艾滋病患者中)、原发性肺动脉高压、哮喘、鼻息肉、炎性肠病、牙周病、肝硬化、腹水、腹膜粘连、子宫内膜异位症、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢过度刺激、再狭窄、和囊性纤维化(参见，例如，Carmeliet，Nature Medicine 2003；9(6):654-660；以及Houtman，FASEB Breakthroughs in Bioscience 2010；第1-17页)。
在禁止对人体实施的方法申请专利的管辖区中，向人类受试者“施用”组合物的含义应局限于开出人类受试者将会通过任何技术(例如，口服，吸入，局部应用，注射，插入等)自我施用的受控物质的处方。在各个方面，本公开提供了所述抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗眼病包括糖尿病性视网膜病变和脉络膜新血管形成和本文所述的其它眼睛相关的疾患、以及治疗如本文所述的癌症的药物中的用途。本公开还提供了所述抗体或其抗原结合片段在治疗眼病包括糖尿病性视网膜病变和脉络膜新血管形成和本文所述的其它眼睛相关病患中的用途，以及在治疗如本文所述的癌症中的用途。还提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段用于治疗眼病，包括糖尿病性视网膜病变和脉络膜新血管形成和本文所述的其它眼睛相关病患，以及用于治疗如本文所述的癌症。在不禁止对人体实施的方法申请专利的管辖区中，组合物的“施用”包括对人体实施的方法以及前述活动二者。
以下实施例仅作为说明提供，而并非意欲是限制性的。
实施例
实施例1
糖尿病视网膜病变的抗Scg3疗法
材料和方法
抗体.按照描述制备重组HRP-3(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。从无血清杂交瘤条件培养基中针对人Scg3产生抗Scg3 mAb(克隆49和克隆78，小鼠IgG1)(Sino Biological)，并使用蛋白G柱纯化。从9E10杂交瘤的条件培养基中纯化抗c-MycmAb，并用作小鼠对照IgG1。从兔血清中纯化对照兔IgG。
糖尿病小鼠.按照描述(Zhong等人Diabetes.2012；61(2):492-504)，用链佐星(STZ；Sigma)或模拟柠檬酸盐缓冲液对C57BL/6小鼠(6周龄，雄性；Jackson Laboratory)诱导1型糖尿病。简言之，将小鼠饥饿4h，然后经由腹膜内注射连续5天接受STZ(40μg/g体重)或柠檬酸钠缓冲液(137mM，pH4.5)。在注射前即刻，将STZ溶解在柠檬酸盐缓冲液中(7.5mg/ml)。每两周监测小鼠的血糖，并且当血糖>350mg/dL时，通常开始于STZ处理后2周，被认为是糖尿病。将小鼠在STZ后长大4个月以发展DR。
杂合Ins2Akita小鼠(Jackson Laboratory)，其在4-6周龄时发生高血糖，监测其血糖。糖尿病表型和相关并发症在雄性中比在雌性中更严重和进展更快。Ins2Akita雄性在6月龄大时出现视网膜血管渗漏，因此在本研究中被选择用于抗-Scg3疗法。
克隆噬菌体.按照描述构建克隆噬菌体(Caberoy等人J Biomol Screen.2009；14(6):653-61)。简言之，通过PCR扩增无终止密码子的绿色荧光蛋白(GFP)的编码序列，消化并克隆到T7Bio3C噬菌体载体(Caberoy等人J Mol Recognit.2010；23(1):74-83)的NotI和XhoI位点以生成GFP-噬菌体。设计具有人工密码子的野生型人VEGF1-110(hVEGF)的编码序列，商业合成(GenScript)并克隆到T7Bio3C的NotI和XhoI位点以产生hVEGF-噬菌体。这两种克隆噬菌体通过测序进行验证。
OPD文库纯化.源自于成年小鼠眼睛和E18胚胎的开放阅读框噬菌体展示(OPD)文库以前有描述(Caberoy等人J Biomol Screen.2009；14(6):653-61；Caberoy等人J MolRecognit.2010；23(1):74-83)。未选择的文库的下一代DNA测序(NGS)分析表明该组合文库由至少9,500种不同的蛋白质组成。根据Novagen T7选择系统手册(Millipore)对OPD文库和对照克隆噬菌体进行扩增和纯化，并进行修饰。简言之，将BLT5615细菌在LB培养基中培养到OD600为0.5，并用异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；1mM)在37℃伴随振荡诱导30min。将所述文库或对照克隆噬菌体(～4x 109噬斑形成单位(pfu))添加到IPTG诱导的BLT5615(200ml)中，并在37℃下伴随振荡温育直至细菌裂解。在用DNase I(40μg)另外温育15min后，将这两个文库以相等的噬菌体滴度汇合以改善文库表现。将hVEGF-噬菌体和GFP-噬菌体以相等的滴度混合，并以1:1,000的比率稀释到汇合的文库中。添加并溶解NaCl(10g)后，将合并的文库裂解物在4℃.下以13,200x g离心10min。添加聚乙二醇8000(PEG-8000，40g)并溶解在上清液中，将其在4℃温育过夜并在相同条件下离心。将噬菌体沉淀团重悬于Tris-NaCl缓冲液(1M NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA)中并离心。将上清液加到不连续的CsCl梯度(20.8％、31.25％、41.7％和62.5％，w/v)上，并在Beckman SW41转子中在23℃下以35,000rpm离心60min。收集恰好高于41.7％CsCl的噬菌体条带，针对PBS进行透析并通过噬菌体噬斑测定法进行滴定。
体内结合选择.糖尿病和对照C57BL/6小鼠(23周龄或STZ后4个月)通过腹膜内注射氯胺酮(90μg/g)和甲苯噻嗪(8μg/g)进行麻醉。将纯化的文库静脉内注射到麻醉的小鼠(3只小鼠/组/轮，1x 1012pfu/小鼠)中并循环20min。未结合的噬菌体通过心内灌注PBS除去。分离视网膜并在含有1％Triton X-100的PBS中匀浆以释放内皮结合的噬菌体。通过噬斑测定法，按照描述，将等份的裂解液用于定量噬菌体滴度。裂解液中剩余的噬菌体在IPTG诱导的BLT5615细菌中扩增，并如上所述再纯化。纯化的噬菌体用作下一轮体内选择的输入物。在3轮选择后，用引物5’-GCGGTTCAGGCTCGCGGCCG-3’(SEQ ID NO：36)and 5’-CCGCTCCCACTACCCTCGAG-3’(SEQ ID NO:37)通过PCR扩增富集的噬菌体克隆的cDNA插入片段。从琼脂糖凝胶中纯化出在400-1,500bp之间的PCR产物，并通过NGS鉴定。
比较配体组学数据分析.将NGS数据针对NCBI CCDS数据库进行比对以鉴定富集的配体。通过NGS鉴定的cDNA插入片段的拷贝数代表它们的关联配体与视网膜内皮的相对结合活性，并通过卡方检验定量比较以鉴定DR相关配体。将NGS数据的CCDS ID批量转换为Uniprot登录号，并通过PANTHER和DAVID进行分析。鉴定的配体基于基因本体论(GO)术语“细胞组分”和“生物学过程”进行分类。
细胞增殖测定.将4-8次传代的HRMVEC(Cell Systems)或HUVEC(Lonza)与指定浓度的Scg3、VEGF165或PBS对照一起在96孔或48孔板中按描述培养(LeBlanc等人PLoSOne.2015；10(5):e0127904)。
需要时，将亲和纯化的抗-Scg3 pAb或mAb在Amicon离心过滤装置(10kDa)中用PBS洗涤三次，浓缩并添加到细胞中。每24h添加新鲜培养基、生长因子和抗体。在48h时通过胰蛋白酶消化收集每个孔中的细胞，重悬于有1mM台盼蓝的PBS中并定量。
小管形成测定.所述测定按描述进行(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。简言之，将基质胶在EBM-2培养基中1:4(vol/vol)稀释，在96孔板(50μl/孔)中铺板并使其在37℃下固化30min。将HUVEC在无血清293 SFM II培养基(LifeTechnologies)中饥饿过夜，收获并铺在基质胶上(15,000个细胞/孔)。将细胞与Scg3、VEGF或PBS一起在293 SFM II培养基中于37℃温育4h。拍摄亮视野图像。使用ImageJ软件(NIH)定量每个视野的总小管长度、小管数量和分支点数。
伤口愈合测定.按照描述通过体外伤口愈合测定来分析细胞迁移(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。简言之，将HMRVEC在12孔板中培养直至～90-100％汇合并在补充有0.2％FBS的293 SFM II培养基中饥饿3h。使用无菌的200-μl尖端在每个孔中产生约1mm宽的限定且清晰的划痕。漂洗后，将细胞在含有0.2％FBS的新鲜293 SFM II培养基中在Scg3或VEGF存在下培养。通过相差显微镜在0和20h监测细胞迁移。使用ImageJ定量原始划痕内的裸露区域中被迁移细胞覆盖的百分比。
体外内皮通透性测定.所述测定按描述进行(Martins-Green等人MethodsEnzymol.2008；443(137-53)。将HUVEC在24孔板的transwell插入物中平板接种并培养至汇合。将FITC-葡聚糖(3-5kDa)(1mg/ml)与Scg3、VEGF或PBS一起添加到下室中。24小时后，使用荧光板读数器定量上室中的FITC浓度，并针对标准曲线进行计算。
球状体发芽.所述测定按描述用HRMVEC进行(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。简而言之，通过将甲基纤维素以1.2％(w/v)溶解于EBM-2培养基中并在4℃下以5,000x g离心2h以清除碎片，从而制备甲基纤维素溶液。收获80％汇合时的细胞，计数，重悬于含有20％甲基纤维素和10％胎牛血清(FBS)的EBM-2培养基中，以750个细胞/孔接种于非粘着性96孔圆底板中并培养24h。收获球状体，重悬于含有纤维蛋白原(2.5mg/ml)和抑肽酶(0.05mg/ml)的EBM-2培养基中，并接种于24孔板(～50个球状体/毫升/孔)中。通过向每个孔添加凝血酶(12单位/毫升)诱导凝结。使包埋球状体的纤维蛋白凝胶在室温下凝结5min，然后在37℃凝结20min。将纤维蛋白凝胶在含有0.05mg/ml抑肽酶的基础培养基中在有或者没有抗-Scg3mAb下与Scg3、VEGF或PBS一起温育48h。使用相差显微镜拍摄照片，并使用ImageJ定量平均发芽长度。
蛋白质下拉.将Scg3(5μg/ml)在含有0.5％Triton X-100和BSA(1mg/ml)的PBS溶液中与阿柏西普、VEGFR-Fc或VEGFR2-Fc(5μg/ml)一起在4℃下温育1h。加入蛋白G珠(20μl)并在4℃下伴随端对端旋转温育30min。通过离心将珠子用PBS洗涤三次，用低pH缓冲液(100mM甘氨酸，pH 2.7)洗脱，并使用抗-Scg3 pAb通过Western印迹进行分析。
ERK活化.按照描述检测ERK1/2活化(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。将HUVEC在293 SFM II培养基中于37℃预培养15min x 3次，以降低其他生长因子的作用。将细胞与Scg3、VEGF或PBS一起在EBM-2培养基中于37℃温育10或30min，裂解并使用针对磷酸化ERK1/2(pEKR1/2)、ERK1/2或β-肌动蛋白的抗体通过Western印迹进行分析。
Akt活化.Akt活化以与EKR活化类似的方式进行。将HUVEC用293 SFM II培养基预温育15min x 4次。将细胞与Scg3、VEGF或PBS一起在37℃温育10min，裂解并使用针对磷酸化Akt T308(pAkt)、总Akt或β-肌动蛋白的抗体通过Western印迹进行分析。
免疫组织化学.按照描述，使用亲和纯化的抗-Scg3 pAb进行小鼠视网膜的免疫组织化学分析(Guo等人Molecular biology of the cell.2015；26(12):2311-20)。简言之，将麻醉的小鼠(C57BL/6，8周龄)用10％福尔马林心内灌注。分离眼睛并在4℃固定过夜。去除角膜和晶状体后，将眼杯体用蔗糖梯度溶液在4℃温育(10％和20％，各3小时；30％过夜)，然后进行3轮冻融和OCT(最佳切割温度化合物)包埋。将7-μm厚度的冷冻组织切片与抗-Scg3 pAb一起温育，然后与Alexa Fluor 488-标记的山羊抗兔IgG抗体一起温育。用DAPI显现细胞核。信号通过共聚焦显微镜分析。
在视网膜和玻璃体液中的Scg3表达.从4个月的糖尿病和年龄匹配的对照小鼠收集玻璃体液(2μl/眼)。分离它们的视网膜并在SDS-PAGE上样缓冲液中匀浆。使用抗-Scg3pAb或抗-β-肌动蛋白抗体通过Western印迹分析样品。
角膜血管生成测定.所述测定按描述进行(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。
简单说，将无菌Whatman滤纸(3级)切成块(0.125mm2/块)并在Scg3(0.25μg/μl)、VEGF(0.1μg/μl)、HRP-3(1μg/μl)或PBS溶液中于4℃浸泡2h。将浸泡的纸植入麻醉的C57BL/6小鼠的角膜囊袋中(8周龄；1块纸/角膜；2个囊袋/小鼠，一个眼睛总是用于PBS)。6天后，使用裂隙灯显微镜评价角膜血管生成并拍照。对进入角膜的新发芽血管的数量、它们的分支点和半定量评分进行定量并针对对侧眼睛的PBS进行归一化。然后用CO2对小鼠实施安乐死，并立即用荧光DiI染料心内灌注。通过共焦显微镜分析坦平安装的角膜以检测DiI标记的血管。
伊文思蓝测定.按照描述，通过伊文思蓝(EB)测定法定量视网膜血管渗漏(Scheppke等人J Clin Invest.2008；118(6):2337-46)。简言之，将亲和纯化的抗-Scg3pAb、针对无关抗原的亲和纯化的pAb(Plekha1)(模拟对照)、兔对照IgG、抗-Scg3 mAb和小鼠对照IgG1在Amicon离心过滤装置(10kDa)中用PBS洗涤三次并浓缩。将抗-Scg3 mAb、模拟亲和纯化的pAb、兔对照IgG、抗-Scg3 mAb、小鼠对照IgG1(0.36μg/1μl/眼)或阿柏西普(2μg/1μl/眼)玻璃体内注射到糖尿病小鼠的一只眼睛中，对侧眼睛注射PBS。在玻璃体内注射后1.5h，静脉内注射EB(0.15毫克/克体重)。在EB注射后2.5h，将麻醉的小鼠用预温热的(37℃)柠檬酸钠溶液(100mM，pH4.5)心内灌注。分离视网膜并用甲酰胺(50μl/视网膜)在70℃温育过夜以提取EB。将溶液在4℃下以180,000x g离心1h。将上清液中的EB在620nm和740nm(背景)下定量，并与标准曲线比较。在心内灌注之前从EB注射的小鼠收集血样，在25℃下以3,550x g直接离心15min，稀释并在相同波长下定量。使用以下公式计算EB渗漏：[渗漏的EB浓度(mg/ml)/视网膜重量(mg)]/[血EB浓度(mg/ml)x循环时间(h)]。将数据针对对侧眼中的PBS归一化，并表示为渗漏减少的百分比。
氧诱导的视网膜病变(OIR).OIR按描述进行(LeBlanc等人Mol Vis.2016；22L374-86；Connor等人Nat Protoc.2009；4(11):1565-73)。简言之，将出生后第7天(P7)的小鼠(C57BL/6)暴露于调节舱中的75％氧气。在P12时，将抗-Scg3 pAb、对照IgG、抗-Scg3 mAb(0.36μg/1μl/眼)、阿柏西普(2μg/1μl/眼)或PBS玻璃体内注射到麻醉的小鼠中，注射后将其返回室内空气。在P17时，使小鼠通过吸入CO2安乐死。分离的视网膜用Alexa Fluor 488-同工凝集素B4染色，摊平安装并通过共焦显微镜分析。按照描述定量新血管形成(Connor等人Nat Protoc.2009；4(11):1565-73)。另外，定量整个视网膜中的新生血管簇数量。在每个视网膜的相同区域中定量规定区域内的分支点数量。所有数据针对未注射的眼睛进行归一化。
统计.数据表示为平均值±SEM。通过单向ANOVA检验或Student’s t检验分析组间差异。通过卡方检验比较NGS数据集。
结果
定量配体组学谱型分析.细胞配体，例如血管生成因子，传统上通过技术上具有挑战性的低通量方法来鉴定。描绘具有治疗潜力的病原性配体甚至更令人生畏。为了应对这一挑战，开发了开放阅读框噬菌体展示(OPD)，用于在没有受体信息的情况下对细胞配体进行无偏鉴定。OPD进一步与下一代测序(NGS)相结合，作为配体组学的第一个范例，用于全面绘制细胞范围的内皮配体图谱。在本实施例中，将比较性配体组学应用于糖尿病和对照小鼠以系统地鉴定DR相关的内皮配体并研究它们的病理作用和治疗潜力。
为了在小鼠中建立DR，用链脲佐菌素(STZ)诱导1型糖尿病，其破坏β胰岛细胞，并将高血糖小鼠长4个月以发展DR。正如预期，观察到糖尿病小鼠的视网膜血管渗漏增加了3.4倍。对于配体组学分析，将OPD文库静脉内注射到糖尿病和模拟处理的对照小鼠中进行三轮体内结合选择以富集视网膜内皮配体(Fieger等人J Biol Chem.2003；278(30):27390-8)。
通过NGS分析富集的克隆的所有cDNA插入片段。鉴定了总共489,126和473,965个有效序列读数并与NCBI CCDS数据库中的1,548(糖尿病视网膜)和844(健康视网膜)种蛋白质进行比对。鉴定的配体参与多种细胞过程，其中～11.5％与血管生成、凋亡、细胞迁移和附着有关。
据预测，通过NGS鉴定的cDNA插入片段的拷贝数与其关联配体的内皮结合活性相关。为了证实这种相关性，构建了表达人VEGF(hVEGF-噬菌体，阳性对照)或绿色荧光蛋白(GFP-噬菌体，阴性对照)的两种克隆噬菌体。HVEGF-噬菌体展示野生型人VEGF蛋白，但对于最大沉默突变具有人工改变的密码子，并且可以通过NGS与内源性VEGF区分开。在体内选择之前，将等滴度的具有非小鼠密码子的hVEGF-噬菌体和GFP-噬菌体稀释到小鼠OPD文库(1:1,000)中，并通过NGS在富集的文库克隆内同时鉴定。在三轮选择后，在NSG中GFP-噬菌体的消耗和hGEGF-噬菌体的相对富集(GFP-噬菌体对比VEGF-噬菌体)证实了拷贝数反映了它们在体内的差异结合活性。此外，所述结果将GFP-噬菌体制定为非特异性结合的基线。发现417/844和817/1,548种分离的配体分别超过该基线特异性结合健康和糖尿病视网膜。
通过比较配体组学鉴定Scg3为DR-高配体.糖尿病和健康视网膜的整个配体组谱的总体结合活性模式相对类似。然而，更详细的比较揭示了各个配体的细微差异。Scg3在糖尿病视网膜中检测到1,731个拷贝，但在健康视网膜中没有拷贝，这意味着其受体可能在糖尿病内皮上上调。相反，肝细胞瘤衍生生长因子相关蛋白3(Hdgfrp3，HRP-3)对糖尿病视网膜的内皮结合活性降低了227倍，暗示其受体在糖尿病中可能下调。VEGF结合活性仅降低5.9倍，表明在4个月糖尿病小鼠中VEGF受体的视网膜内皮表达改变轻微。
作为比较配体组学的概念验证，通过卡方(χ2)检验进行糖尿病对比对照视网膜的整个配体组谱的定量比较。从总共1,772个非冗余配体中鉴定出1,114个DR相关的内皮配体(p<0.05)，其基于它们与糖尿病视网膜内皮的结合增加或减少而被表征为“DR-高”和“DR-低”配体。然而，卡方值对比糖尿病:对照的结合活性比的图揭示了许多配体在两种状态之间的结合活性变化轻微，但统计上显著。为了改善鉴定疾病相关配体的可靠性，DR-高或DR-低配体进一步用以下更严格的任意标准限定：p<0.001；糖尿病:对照结合活性比>10或<0.1；DR或对照中的拷贝数>30。使用这些标准，获得了353个DR-高和105个DR-低配体(表2)。Scg3和HRP-3分别被鉴定为DR-高和DR-低配体。还发现Scg2与糖尿病视网膜血管的结合增加(表3)，但由于其相对低的结合活性而不够格作为DR-高配体。分析了使用所有鉴定的配体的活性图的总体结合活性模式中的变化。结果表明，整个配体组的内皮结合活性在糖尿病小鼠中明显改变(对于1,772个配体，Pearson相关系数r＝0.498)。
表2：通过比较配体组学鉴定的DR相关内皮配体
*P<0.001，DR对比对照，χ2检验。活性比＝(DR+1)/(对照+1).
表3：通过比较配体组学鉴定的已知或推定的内皮配体
入选标准：在糖尿病和对照视网膜中结合活性＞10(即GFP-噬菌体的活性)。表的参考文献在补充参考文献中列出。
通过几种已知和推定的糖尿病相关内皮配体的鉴定，支持了比较配体组学的有效性(表2和3)。源自于淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的淀粉样蛋白β是已知的内皮配体并且与RAGE(晚期糖基化终产物的受体)结合，其在糖尿病内皮上上调(Caberoy等人EMBO J.2010；29(23)：3898-910)。C1qb是C1q补体因子的β亚基，其与至少两种内皮受体cC1qR和gC1qR/p33相互作用，以产生促炎细胞因子(Vogel等人Journal of CellularBiochemistry.1994；54(3)：299-308)。C1q在动脉粥样硬化病变部位大量存在(Peerschke等人Mol Immunol.2004；41(8)：759-66)，动脉粥样硬化是最常见的糖尿病血管并发症之一。肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)是已知的促有丝分裂内皮配体(Oliver等人J ClinInvest.1998；102(6)：1208-19)。HRP-3与HDGF在相同的蛋白质家族中(Izumoto等人Biochem Biophys Res Commun.1997；238(1)：26-32)
并在本实施例中被独立地验证为DR-低血管生成因子，暗示HDGF也可以是DR-低配体。最后，粘附分子例如纤连蛋白1(Fn1)、IVα3型胶原(Col4a3)和钙黏着蛋白1(Cdh1)的受体在糖尿病视网膜内皮上的上调，可能有助于DR中的白细胞附着(Rask-Madsen等人CellMetab.2013；17(1):20-33；Forbes等人Physiol Rev.2013；93(1):137-88)。
Scg3作为新型血管生成因子的独立验证.为了证明比较配体组学的有效性，选择DR-高的Scg3和DR-低的HRP-3用于独立验证它们不同的疾病相关模式。选择这两种孤儿配体是因为它们对糖尿病性视网膜内皮的结合活性的高倍变化。另外，HRP-3最近被配体组学鉴定为健康视网膜中的血管生成因子(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。为了确定Scg3是否也是血管生成因子，进行了几项体外功能分析。Scg3显着促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人视网膜微血管内皮细胞(HRMVEC)的增殖(图1A和1B)。另外的分析显示Scg3刺激EC的小管形成。在显微镜分析中定量的小管长度、分支点数和小管数量证实了Scg3诱导小管形成(图1C-E)。此外，结果揭示Scg3显著促进HRMVEC的球状体发芽(图1F)。伤口愈合测定表明Scg3促进HRMVEC的迁移(图1G)，并且体外通透性测定显示Scg3诱导内皮通透性(图1H)。在所有这些测定中，VEGF充当阳性对照并显著刺激内皮增殖、小管形成、迁移和通透性。
表征糖尿病和对照小鼠的视网膜和玻璃体液中的Scg3表达。免疫组织化学揭示Scg3在视网膜神经节细胞、内和外丛状层、光感受器内段和视网膜色素上皮(RPE)细胞中表达。在内和外核层以及光感受器外段中检测到的Scg3信号很少。该表达模式与其在分泌颗粒中调节神经递质储存和转运的作用一致。结果进一步揭示了Scg3在糖尿病和对照视网膜的匀浆中以相似的水平表达。Scg3分泌通过Western印迹得出其在小鼠眼睛的无细胞玻璃体液中的存在而得到验证。有趣的是，与健康小鼠相比，Scg3在4个月的糖尿病小鼠的玻璃体液中显著上调，暗示Scg3分泌可能是一个受调节的过程，类似于CTLA-4的受调节分泌(Valk等人Trends Immunol.2008；29(6):272-9)。
疾病高和疾病低血管生成因子的验证.为了验证DR高的Scg3和DR-低的HRP-3作为疾病相关的血管生成因子，在糖尿病和对照小鼠中进行角膜囊袋测定。相对于健康小鼠，Scg3优先诱导糖尿病小鼠的血管生成。相反，HRP-3选择性地刺激健康但不是糖尿病小鼠的血管生成。正如所料，用VEGF的对照测定在健康和糖尿病小鼠中均促进血管生成。这些发现不仅通过裂隙灯检查观察到，而且还通过用亲脂性荧光DiI染料染色角膜血管而得到证实。角膜血管、分支点和综合评分的定量印证了Scg3和HRP-3的相反血管生成模式(图2A-2C)。该定量还证实，除了综合评分表明VEGF在糖尿病小鼠中比在对照小鼠中的血管生成活性更高之外，VEGF在健康和糖尿病小鼠中均具有相似的活性(图2C)。数据表明，Scg3和HRP-3分别是真正的糖尿病高和糖尿病低的血管生成因子，这进而又支持了定量和比较配体组学的有效性。
Scg3和VEGF的不同受体信号传导通路.糖尿病和对照小鼠中角膜血管生成活性的不同模式提示Scg3和VEGF可能具有不同的受体和信号传导通路。实际上，Scg3不能与阿柏西普相互作用，阿柏西普是一种工程嵌合受体，由VEGF受体1(VEGFR1)的第二结合结构域和VEGFR2的第三结构域与人IgG Fc融合组成。该发现通过使用VEGFR1-Fc和VEGFR2-Fc的蛋白质下拉测定独立地验证。虽然Scg3和VEGF二者都激活ERK1/2，但只有VEGF而不是Scg3刺激Akt的磷酸化。这些数据表明具有不同受体的Scg3和VEGF可以部分会聚它们的细胞内信号传导以差异化调节血管生成。
抗Scg3疗法减轻糖尿病视网膜血管渗漏.鉴于血管生成因子在DR中的致病作用，DR高的Scg3被评为抗血管生成疗法的靶标，以减轻糖尿病性视网膜血管渗漏。亲和纯化的抗-Scg3多克隆抗体(pAb)能够阻断Scg3诱导的HRMVEC增殖(图1B)，但单独抗-Scg3 pAb对内皮增殖没有影响。PAb的中和活性通过球状体发芽测定被独立地证实(图1F)。重要的是，玻璃体内注射抗-Scg3疗法显著减少了STZ诱导的糖尿病小鼠的视网膜血管渗漏，具有与阿柏西普类似的疗效(图3A)。作为对照，针对无关抗原的模拟亲和纯化的pAb对糖尿病视网膜血管渗漏没有抑制。
抗-Scg3疗法的独立验证.然而，尽管有亲和纯化和各种控制，pAb仍可以非特异性地识别其它蛋白质，具有脱靶效应。与pAb不同，单克隆抗体(mAb)与其它蛋白质甚少交叉反应，并且被公认为用于靶标验证以及疗法的选择性试剂。开发了抗Scg3 mAb(克隆49和克隆78)，其识别人类和小鼠二者的Scg3。玻璃体内注射Scg3中和mAb克隆49或克隆78减轻STZ诱导的糖尿病小鼠的视网膜血管渗漏(图3A和图3D)并中和了Scg3诱导的HRMVEC增殖(图3B)，证明Scg3是真正的用于DR的抗血管生成疗法的靶标。
在胰岛素2基因中有突变的Ins2Akita小鼠自发地发展为1型糖尿病(Wang等人JClin Invest.1999；103(1):27-37)并用于独立地验证抗-Scg3mAb的疗效。该小鼠在6个月大时发生视网膜血管渗漏。玻璃体内注射抗-Scg3 mAb显著抑制Ins2Akita小鼠的视网膜渗漏，效力与阿柏西普相似(图3C)，进一步确证了Scg3作为DR疗法的靶标。
评价克隆49和表1中描述的其它抗-Scg3 mAb与Scg3的竞争性结合。将抗Scg3scFv克隆49(图3D)和克隆78(图3E)表达并纯化。它们与预先固定在ELISA板上的Scg3的结合活性在存在或不存在过量抗-Scg3克隆7、克隆16、克隆49、克隆78、克隆153、克隆162和克隆190mAb以阻断scFv结合的情况下进行定量。结合的scFv通过ELISA测定检测。还使用Octet RED96系统(Pall ForteBio)进行结合测定，如Estep等人，MAbs 2013；5:270-278中所述。这两种类型的结合测定显示克隆48和克隆78与Scg3结合，但不相互阻断，表明它们结合Scg3上的不同表位。这两种结合测定还证明了克隆153、克隆162和克隆190与克隆78竞争与Scg3的结合，表明在这些mAb之中表位共用。
视网膜血管生成的抗Scg3疗法.与在疾病发作后10至20年可能发生PDR的糖尿病患者相反，糖尿病啮齿动物不会向PDR发展，可能是由于它们的寿命相对较短。氧诱导的视网膜病变(OIR)是早产儿视网膜病变(ROP)的动物模型，并已广泛用作伴视网膜新血管形成的增生性视网膜病变的替代模型。(Stahl等人Invest Ophthalmol Vis Sci.2010；51(6):2813-26；Connor等人Nat Protoc.2009；4(11):1565-73)。评估了抗-Scg3疗法预防由OIR诱导的视网膜新血管形成的能力。玻璃体内注射Scg3中和性pAb改善了OIR诱导的病理性新血管形成，其特征在于新生血管簇和迂曲的血管。血管密度、新生血管簇和血管分支点的定量表明抗-Scg3显著抑制OIR诱导的新血管形成(图4A-4D)。对于阿柏西普也观察到类似的治疗效果。这些数据证明了抗-Scg3对PDR患者以及ROP患者的治疗潜力。
讨论
比较配体组学.定量配体组学全面定量配体结合活性的的可靠性在美国专利申请号14/708,073中进一步讨论，该专利申请通过引用并入本文。应用比较配体组学来系统地描绘在疾病状态下结合改变的疾病相关配体。抗-Scg3疗法DR的成功证明确证了这种方法的效用。总之，这些发现表明，通过比较配体组学进行内源性配体的结合活性的谱型分析是系统地鉴定疾病相关配体的有力方法，并且可以扩展到定义疾病相关配体的致病贡献和治疗潜力，疾病相关配体可取决于情况加速或延迟疾病发病机制。
DR-高的Scg3证明了比较配体组学的主要优点。常规配体筛选方法可能忽视了在健康细胞中具有相对低结合活性的疾病高配体。结果，Scg3从未被报道为血管生成因子。比较配体组学分析可以有效筛选疾病高配体，然后在健康和患病的细胞或条件下进行额外的功能分析。
Scg3通过配体组学鉴定为DR-高配体，在糖尿病和健康视网膜中分别有1,731和0个拷贝(表2)。这些数字将基于通过NGS分析的序列总数而平行地增加或减小。因此，Scg3与健康视网膜内皮的结合降低可能并不表明Scg3受体完全不存在，而是提示其相对低的表达。实际上，通过健康角膜中的体内血管生成测定(Scg3对比PBS)检测到弱的Scg3血管生成活性，虽然没有统计显著性。此外，Scg3能够在相对高的剂量下刺激HUVEC，提示可以通过其它功能测定来检测Scg3对非糖尿病EC的调节。
Scg3作为DR相关的血管生成配体.Scg3的功能作用定义不明，主要表征为内分泌和神经内分泌细胞中分泌颗粒生物发生和激素肽分泌的调节因子(Hosaka等人Endocrinejournal.2010；57(4):275-86)。
然而，分泌的Scg3从未被描述为外源性调节任何细胞的配体。本实施例发现Scg3是DR相关的血管生成因子。糖尿病视网膜渗漏和OIR诱导的视网膜新血管形成的抗Scg3疗法表明Scg3是这两种疾病模型中的致病性配体，并且是DME和PDR的抗血管生成疗法的潜在靶标。由于治疗选择有限，对一种抗VEGF药物反应差的DME患者经常转换到另一种VEGF抑制剂，尽管它们的作用机制相似。开发靶向不同信号传导通路的抗血管生成疗法可促进抗VEGF耐受性DR的替代或组合疗法。
基于不同的血管生成活性模式，证明了Scg3和VEGF具有不同的受体信号传导通路。VEGF具有三种受体，VEGFR1、2和3。前两种受体在眼新生血管形成的发病机制中起关键作用(Robinson等人J Cell Sci.2001；114(Pt 5):853-65)，而VEGFR3参与淋巴管生成(Kaipainen等人Proc Natl Acad Sci U S A.1995；92(8):3566-70)。该实验通过蛋白质下拉和ELISA独立证实Scg3不与VEGFR1和2结合。因为一些血管生成因子可以诱导VEGF表达(Matei等人Cancer Biol Ther.2007；6(12):1951-9)，所以进一步证实了Scg3不上调VEGF表达，反之亦然。这些数据表明Scg3和VEGF具有不同的血管生成活性谱，支持用其抑制剂的DR替代或联合疗法。
抗-Scg3疗法的其它潜在优点是极少的副作用和灵活的施用途径。与具有单个VEGF等位基因缺失的小鼠的胚胎致死性相反(Ferrara等人Nature.1996；380(6573):439-42)，具有Scg3基因纯合缺失的小鼠(即1B1075基因，相当于100％Scg3阻断)显示正常的表型(Kingsley等人EMBO J.1990；9(2):395-9)，这提示抗-Scg3疗法可能具有极少的副作用。
抗血管生成疗法的潜在临床应用是在疾病发作之前预防DME/PDR(JeganathanVS.Current pharmaceutical biotechnology.2011；12(3):369-72.)。然而，由于玻璃体内注射相关和不相关的不良作用，抗VEGF治疗对于预防DME/PDR具有有限的效益-风险比。副作用极少的全身抗-Scg3疗法可以改善该比率并为预防PDR/DME提供机会。与LUCENTIS相似，Scg3中和性mAb可以人源化，以便抗-Scg3疗法的试验台到病床旁的转化。
VEGF对于胚胎和新生儿阶段的血管和视网膜发育至关重要。具有VEGF受体1或2的纯合缺失的小鼠在宫内死亡(Fong等人，Nature.1995；376:66-70；Shalaby等人，Nature.1995；376:62-66)。类似地，具有单个VEGF等位基因缺失的小鼠是胚胎致死的(Ferrara等人，Nature.1996；380:439-442)。
在所有的VEGF或VEGFR敲除小鼠中，早亡归咎于血管发生中的严重缺陷，这可进而又影响胚胎发生。早产儿ROP的抗VEGF疗法与不良副作用有关(Beharry等人，SeminPerinatol.2016；40:189-202；Lepore等人，Ophthalmology.2014；121:2212-2219)。由于功效和安全性的不确定性(Sanker等人，Cohrane Database Syst.Rev.2016；2:CD009734)，VEGF抑制剂尚未被批准用于ROP疗法。本实施例确立了抗-Scg3疗法对OIR具有高效力。Scg3的高疾病选择性表明抗-Scg3疗法可能对正常血管的副作用极少。这一概念得到所报道的Scg3基因纯合缺失小鼠(即1B1075基因，相当于100％Scg3阻断)的正常表型支持(Kingsley等人，EMBO J.1990；9:395-399)，表明对血管发生和胚胎发生的副作用极少。图4中的结果证明抗-Scg3抗体是有希望的ROP药物疗法，具有高功效和安全性。
总之，进行通过比较配体组学的高通量筛选以系统地鉴定疾病相关配体。Scg3被表征为独特的血管生成因子，其优先诱导糖尿病的、而不是健康的脉管系统中的血管生成，并且是DME、PDR和ROP的抗血管生成疗法的有希望的靶标。抗Scg3抗体显著减轻OIR诱导的病理性视网膜新生血管形成，表明抗-Scg3疗法可以治疗DME和PDR，以及成为ROP的首选药物疗法，具有高功效和安全性。
实施例2
CNV的抗Scg3疗法
材料和方法
抗体.亲和纯化的抗-Scg3 pAb获自Proteintech(Rosemont，IL，USA)。从无血清杂交瘤条件培养基产生抗Scg3 mAb(克隆49和克隆78，小鼠IgG1)，并使用蛋白G柱纯化(Kim等人Clin Immunol.2011；138(1):60-6)。
所有抗体在Amicon离心过滤装置(10kDa截止值，Millipore，Billerica，MA，USA)中用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。
细胞培养.人脐静脉内皮细胞(HUVEC)以前有描述(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。
人视网膜微血管内皮细胞(HRMVEC)和具有血清和CultureBoost的完整经典培养基试剂盒来自Cell Systems(Kirkland，WA)(LeBlanc等人Mol Vis.2016；22:374-86)。人VEGF165和抗-VEGF抗体来自R&D Systems(Minneapolis，MN)。阿柏西普由RegeneronPharmaceuticals(Tarrytown，NY)制造。
传代4至8次的HRMVEC在96孔板中在存在或不存在抗-Scg3mAb的情况下，培养用Scg3(Sino Biological，中国北京)或培养基对照按描述培养(LeBlanc等人PLoSOne.2015；10(5):e0127904)。在48h时通过胰蛋白酶消化收集每孔中的细胞并定量。
球状体发芽测定.所述测定按描述用HRMVEC进行(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。简言之，通过将甲基纤维素(Sigma，St.Louis，MO)以1.2％(w/v)溶解于EBM-2培养基(Lonza，Allendale，NJ)中并在4℃下以5,000x g离心2h以清除碎片，从而制备甲基纤维素溶液。收获80％汇合时的细胞，计数，重悬于含有20％甲基纤维素和10％胎牛血清(FBS)的EBM-2培养基中，以750个细胞/孔接种于非粘着性96孔圆底板中并培养24h。收获球状体，重悬于含有纤维蛋白原(2.5mg/ml)和抑肽酶(0.05mg/ml)的EBM-2培养基中，并接种于24孔板(～50个球状体/毫升/孔)中。通过向每个孔添加凝血酶(12单位/毫升)诱导凝结。使包埋球状体的纤维蛋白凝胶在室温下凝结5min，然后在37℃凝结20min。将纤维蛋白凝胶在含有0.05mg/ml抑肽酶的基础培养基中与Scg3、VEGF或PBS一起温育48h。使用相差显微镜拍摄照片，并使用ImageJ软件(NIH)定量平均发芽长度。
Src活化.按照描述检测Src活化(LeBlanc等人PLoS One.2015；10(5):e0127904)。将HRMVEC在补充有0.2％FBS的EBM-2培养基中温育过夜，以降低其它生长因子的作用。将细胞在有或者没有抗-Scg3 mAb的EBM-2培养基中与Scg3或PBS一起在37℃温育10min，裂解并使用针对磷酸化Src(P-Src)、Src或β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX)的抗体通过Western印迹进行分析。将Western印迹信号数字化。
Scg3和VEGF表达.将HRMVEC平板接种在6孔板中，并在补充有2％FBS的EBM-2培养基中与Scg3、VEGF或PBS一起温育48h。洗涤后，收集细胞并使用抗-Scg3 mAb和抗VEGF抗体通过蛋白质印迹进行分析。将Western印迹信号数字化。
激光诱导CNV的疗法.按照以前的描述(LeBlanc等人Mol Vis.2016；22:374-86)，在第0天对C57BL/6小鼠(6-7周龄，Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)进行激光光凝(氩激光，532nm，100mW，100ms，100μm，4斑点/视网膜)以诱导CNV。按照描述排除具有脉络膜出血和线性或融合病变的病变(Poor等人Invest Ophthalmol Vis Sci.2014；55(10):6525-34)。
在第3天，玻璃体内注射。抗-Scg3 pAb、对照IgG、抗-Scg3克隆49mAb(0.36μg/1μl/眼)、阿柏西普(2μg/1μl/眼)或PBS。根据它们的相对玻璃体积。用于nAMD疗法的阿柏西普在小鼠中2μg/眼相当于在人类中2mg/眼。在第7天，接收腹膜内注射荧光素钠(0.1ml，2.5％)的小鼠在注射后6min通过荧光素血管造影术分析CNV渗漏。激光斑点的强度使用ImageJ定量。在第8天，分离视网膜色素上皮细胞(RPE)-脉络膜-巩膜复合体的眼杯体，用AlexaFluor 488-同工凝集素B4染色，摊平安装并通过共聚焦显微镜分析(LeBlanc等人MolVis.2016；22(374-86)；Chan等人PLoS One.2015；10(3):e0120587)。CNV 3D体积从z-stack图像解卷积并使用Volocity软件定量。定量每个病变的最大CNV z-stack图像的面积大小及其荧光强度，以使用ImageJ确定CNV大小和血管密度。数据针对PBS对照归一化。
基质胶诱导CNV的疗法.将生长因子减少的基质胶(Corning，Corning，NY)用PBS1:4稀释，并在第0天按照描述(Cao等人Invest Ophthalmol Vis Sci.2010；51(11):6009-17)注射到C57BL/6小鼠的视网膜下腔中(6-7周龄，0.8μl/视网膜)。在第0、2和4天皮下注射抗-Scg3 pAb、兔对照IgG、抗-Scg3 mAb、小鼠对照IgG1(抗-c-Myc，克隆9E10)(Developmental Studies Hybridoma Bank，Iowa City，IA)、阿柏西普或PBS。为避免人类偏倚，将试剂编码用于盲法研究。在第7天，进行荧光素血管造影以分析如上所述的CNV渗漏。
统计分析.数据表示为平均值±SEM并通过单向ANOVA检验进行分析。P<0.05的差异被认为是显著的。
结果
Scg3作为新型血管生成因子的体外表征.进行3D内皮球体发芽测定以表征体外Scg3的血管生成活性。结果显示，Scg3显著刺激了HUVEC的发芽(P<0.001，图1I)。作为阳性对照，VEGF诱导相似的内皮发芽(P<0.01)，进一步支持Scg3是血管生成因子。
激光诱导的CNV用中和性pAb的抗Scg3疗法.为了研究Scg3对CNV发病机理的可能贡献，分析了抗-Scg3pAb减轻小鼠的CNV的能力。通过激光光凝诱导小鼠的CNV。在光凝后3天玻璃体内注射抗Scg3 pAb、对照IgG(0.36μg/眼)或阿柏西普(2μg/眼)。第7天的荧光素血管造影显示抗-Scg3 pAb显著降低CNV血管渗漏，具有与阿柏西普相似的功效(P<0.05，图5A和图5B)。用Alexa Fluor 488-异凝集素B4标记眼杯体中的CNV血管，并通过共聚焦显微镜分析。抗Scg3pAb显著降低CNV的大小。CNV 3D体积、病变面积和血管密度的定量揭示抗-Scg3 pAb显著抑制CNV，具有与阿柏西普相似的功效(图5D至图5E)。
激光诱导的CNV用中和性mAb的抗Scg3疗法.尽管进行了亲和纯化，但识别多个表位的抗-Scg3 pAb可能与其它蛋白质非特异性结合而有脱靶效应。单克隆抗体与其它蛋白质的交叉反应极少，因此被公认为用于靶标验证以及疗法的选择性试剂。为了表征抗-Scg3克隆49mAb的中和活性，证明了Scg3显著诱导HRMVEC的增殖(P<0.05)以及所述mAb抑制Scg3诱导的增殖(P<0.05，图6A)。这些结果证实Scg3是促进内皮细胞生长的血管生成因子，以及克隆49mAb是Scg3-中和抗体。此外，信号传导研究揭示Scg3显著刺激HRMVEC中Src激酶的磷酸化(P<0.05)以及克隆49mAb阻断Scg3诱导的Src活化(P<0.05，图6B和图6C)。使用克隆49mAb的数据证实了抗-Scg3 pAb的治疗活性，证明了Scg3在CNV发病机理中起重要作用，并且是CNV的抗血管生成疗法的有希望的靶标。
基质胶诱导的CNV的抗Scg3疗法.为了验证Scg3的致病作用，按照描述(Cao等人Invest Ophthalmol Vis Sci.2010；51(11):6009-17)，通过将基质胶(0.8μl/视网膜)注射到视网膜下腔中以诱导CNV来产生CNV的替代小鼠模型。
为了避免玻璃体内注射的副作用，在该CNV模型中研究了概念验证全身抗-Scg3疗法。在第0、2和4天皮下注射抗-Scg3 pAb、克隆49或克隆78mAb、对照兔IgG、小鼠IgG1(25μg/千克体重)、阿柏西普(250μg/Kg)或PBS。荧光素血管造影术显示抗-Scg3 pAb显著防止基质胶诱导的CNV的发作(P<0.01，对比兔对照IgG)(图7A和图7B)。结果用克隆49mAb(P<0.01，对比对照小鼠IgG1)(图7A和图7B)和克隆78mAb(P<0.05，对比对照IgG)(图7C和图7D)独立地验证。作为阳性对照，阿柏西普也显著抑制基质胶诱导的CNV(图7B)。
Scg3和VEGF表达的交叉调节.许多血管生成因子，例如血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和表皮生长因子(EGF)，可上调VEGF表达(Wang等人Cancer research.1999；59(7):1464-72；Seghezzi等人J Cell Biol.1998；141(7):1659-73；Maity等人Cancer research.2000；60(20):5879-86)。
因此，它们可通过VEGF间接促进血管生成。为了研究这种可能性，分析了Scg3对HRMVEC中VEGF表达的作用。结果显示Scg3没有上调VEGF表达，反之亦然(图8A至8C)。如先前报道，作为阳性对照，VEGF显著促进其自身表达(P<0.05)(Kweider等人J Biol Chem.2011；286(50):42863-72)。这些结果表明Scg3和VEGF不能调节彼此的表达。
讨论
该研究将Scg3表征为CNV中的血管生成因子和nAMD疗法的潜在靶标。与其他血管生成因子相比，Scg3因其疾病相关性而独特。Scg3不结合或诱导正常血管的血管生成。因此，抗-Scg3疗法应该对CNV血管具有相对高的选择性。此外，具有Scg3遗传消融的小鼠(即1B1075基因，相当于100％Scg3阻断)具有正常表型(37)，表明抗-Scg3可能对正常血管和其他细胞的副作用极少。实际上，发现以过高剂量玻璃体内注射Scg3中和性mAb没有视网膜毒性，并且使用FITC-膜联蛋白V标记(未发表的数据)发现，高浓度的克隆49mAb没有诱导可检测的HRMVEC凋亡。这些发现为CNV的全身性抗-Scg3疗法提供了机会。图7中的结果证明了基质胶诱导的CNV的全身性抗-Scg3疗法具有高效力。具有灵活施用途径的抗Scg3将避免在眼睛中玻璃体内注射相关的不良作用。尽管本实施例作为概念验证证明了经由皮下注射的CNV的全身性抗-Scg3疗法，但可以探索用于全身疗法的不同选择，包括不同的注射部位、缓释制剂、和用PEG化抗体来延长半衰期，以最大化功效。
抗-Scg3 mAb和阿柏西普二者均以大于50％的抑制显著改善了激光或基质胶诱导的CNV。此外，机械研究显示，Scg3和VEGF二者均激活ERK1/2激酶。关键问题是Scg3和VEGF是否可能共有相同的受体通路以稳固抑制CNV和激活ERK1/2。发现Scg3不与VEGF受体(VEGFR)结合。此外，VEGF，但不是Scg3，激活Akt激酶和信号转导因子和转录激活因子3(STAT3)。该研究进一步揭示了Scg3不能上调VEGF表达，反之亦然(图8A)。总之，这些结果表明Scg3是具有VEGF非依赖性信号传导机制的血管生成因子，为用它们的抑制剂的nAMD替代或联合疗法提供了分子基础。Scg3和VEGF可具有不同的受体，它们激活不同的细胞内信号传导通路，其最终会聚于一些常见的信号传导分子(例如，EKR1/2)以调节血管生成。与Scg3抑制剂的联合疗法因此可以潜在地协同或相加地改善CNV疗法的功效。
未探索的领域是nAMD的预防疗法。例如，有AMD易感基因、吸烟、单侧眼有玻璃膜疣或CNV的患者发生nAMD的风险高。由于注射相关的不良作用，玻璃体内抗VEGF疗法对于在CNV发作前预防nAMD的效益-风险比相对较低。副作用极少的全身抗-Scg3疗法可以改善该比率，从而为预防高风险人群的患者的nAMD提供机会。因此，Scg3是治疗和预防nAMD两方面的有希望的靶标。
实施例3
癌症的抗Scg3疗法
比较配体组学分析揭示，Scg3与小鼠视网膜母细胞瘤结合有198个拷贝而与正常视网膜结合为零拷贝(图9A)。将人MDA-MB-231乳腺癌细胞(2x 106细胞/小鼠)植入免疫缺陷NSG小鼠的外侧乳腺垫中。在肿瘤生长至～160mm3大小后，通过腹膜内注射用抗-Scg3mAb克隆49或对照小鼠IgG1(5mg/千克体重)处理小鼠。在下一次处理之前定量肿瘤大小，总共处理4次。
与用对照小鼠IgG处理的小鼠相比，用抗-Scg3抗体处理的动物显示出显著更小的肿瘤体积(图9B)。当与用对照IgG处理的肿瘤相比时，用抗-Scg3 mAb第一次处理后的肿瘤生长显著降低。使用抗-Scg3 mAb的附加处理在所有测量的时间点均显著抑制肿瘤生长。没有观察到副作用的临床征象，例如体重减轻、食欲减退、毛发蓬乱或呼吸困难，证明抗-Scg3mAb的副作用极少。
前述实施例证明了Scg3在正常血管中具有极少的结合和血管生成活性，但在多种血管疾病中明显上调其结合和血管生成活性。与对血管和视网膜发育至关重要的VEGF相反，Scg3在正常血管和视网膜形态发生中起作用甚微。报道了Scg3基因纯合缺失的小鼠具有正常表型(Kingsley等人EMBO J.1990；9(2):395-9)，而具有单个VEGF等位基因缺失的小鼠是胚胎致死的(Ferrara等人Nature.1996；380(6573):439-42)。抗Scg3疗法，包括抗-Scg3 mAb，可有效治疗与DR、伴有CNV/PCV的nAMD、ROP和癌症相关的症状，并为目前的抗VEGF治疗选择提供有前途的替代方案。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文中，如同每个单独的出版物或专利申请被专门和个别地指出通过引用并入那样。虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和示例较详细地描述了前述发明，但是根据本公开的教导，可以在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改，对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。

Claims (39)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其交叉阻断参考抗体与分泌粒蛋白III的结合，其中所述参考抗体选自由下列组成的组：包含SEQ ID NO：3-8的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：11-16的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：19-24的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：27、4、28、22、29和24的CDR的抗体；包含SEQ ID NO：27、4、28、32、29和24的CDR的抗体；以及包含SEQ ID NO：3、4、28、22、29和24的CDR的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自由下列组成的组：包含含有SEQ ID NO：1的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：9的重链可变区和含有SEQ ID NO：10的轻链可变区的抗体；包含含有SEQID NO：17的重链可变区和含有SEQ ID NO：18的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：25的重链可变区和含有SEQ ID NO：26的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：30的重链可变区和含有SEQ ID NO：31的轻链可变区的抗体；包含含有SEQ ID NO：38的重链可变区和含有SEQ ID NO：33的轻链可变区的抗体；以及包含含有SEQ ID NO：34的重链可变区和含有SEQ ID NO：35的轻链可变区的抗体。
3.一种抗体或其抗原结合片段，其结合分泌粒蛋白III并且包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中(a)CDR-H1包含选自由SEQ ID NO：3、11、19和27组成的组中的氨基酸序列；(b)CDR-H2包含选自由SEQ ID NO：4、12和20组成的组中的氨基酸序列；(c)CDR-H3包含选自由SEQ ID NO：5、13、21和28组成的组中的氨基酸序列；(d)CDR-L1包含选自由SEQ ID NO：6、14、22和32组成的组中的氨基酸序列；(e)CDR-L2包含选自由SEQ IDNO：7、15、23和29组成的组中的氨基酸序列；以及(f)CDR-L3包含选自由SEQ ID NO：8、16和24组成的组中的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：3；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：5；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：6；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：7；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：8。
5.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：11；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：12；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：13；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：14；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：15；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：16。
6.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：19；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：20；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：21；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：22；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：23；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。
7.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：27；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：28；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：22；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：29；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。
8.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：27；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：28；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：32；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：29；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。
9.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中(a)CDR-H1包含SEQ ID NO：3；(b)CDR-H2包含SEQ ID NO：4；(c)CDR-H3包含SEQ ID NO：28；(d)CDR-L1包含SEQ ID NO：22；(e)CDR-L2包含SEQ ID NO：29；以及(f)CDR-L3包含SEQ ID NO：24。
10.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：1的重链可变区和含有SEQ ID NO：2的轻链可变区。
11.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：9的重链可变区和含有SEQ ID NO：10的轻链可变区。
12.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：17的重链可变区和含有SEQ ID NO：18的轻链可变区。
13.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：25的重链可变区和含有SEQ ID NO：26的轻链可变区。
14.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：30的重链可变区和含有SEQ ID NO：31的轻链可变区。
15.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：38的重链可变区和含有SEQ ID NO：33的轻链可变区。
16.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：34的重链可变区和含有SEQ ID NO：35的轻链可变区。
17.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有与SEQ IDNO：1、9、17、25、30、38或34至少90％同一的氨基酸序列的重链可变结构域，并包含含有与SEQ ID NO：2、10、18、26、31、33或35至少90％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、F(ab’)2片段、或单链可变片段(scFv)。
19.一种编码根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。
20.一种包含根据权利要求19所述的核酸的表达载体。
21.一种用权利要求20的表达载体转染的宿主细胞。
22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和生理上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
23.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求22所述的药物组合物。
24.一种治疗有此需要的受试者的新生血管性年龄相关性黄斑变性的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求22所述的药物组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物以有效抑制脉络膜新血管形成或息肉状脉络膜血管病变的量施用。
26.一种治疗有此需要的受试者的糖尿病性视网膜病变的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求22所述的药物组合物。
27.一种治疗有此需要的受试者的早产儿视网膜病变的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求22所述的药物组合物。
28.一种治疗有此需要的受试者的眼睛中血管生成相关疾病的方法，所述疾病任选选自新生血管性青光眼、角膜新血管形成、翼状胬肉、视网膜静脉阻塞、由于近视的视网膜和黄斑新血管形成、炎性病症、遗传性视网膜营养不良和镰状细胞视网膜病变，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求22所述的药物组合物。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物以有效减少视网膜血管渗漏的量施用。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物以有效减少视网膜或脉络膜新血管形成的量施用。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物经玻璃体内施用。
32.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求22所述的药物组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者患有选自膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脑癌、甲状腺癌、肝癌、口腔癌、口咽癌、食道癌或胃癌的癌症。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者患有选自视网膜母细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤和眼内淋巴瘤的眼癌。
35.根据权利要求24-34中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段或药物组合物以有效抑制细胞增殖的量施用。
36.一种治疗有此需要的受试者的血管生成相关疾病的方法，所述疾病任选选自关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成、多发性硬化、血管畸形、自身免疫病、动脉粥样硬化、移植性动脉病、肥胖症、银屑病、疣、变应性皮炎、瘢痕疙瘩、化脓性肉芽肿、水疱病、艾滋病患者的卡波西肉瘤、原发性肺动脉高压、哮喘、鼻息肉、炎性肠病、牙周病、肝硬化、腹水、腹膜粘连、子宫内膜异位症、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢过度刺激、再狭窄和囊性纤维化，所述方法包括施用治疗有效量的根据权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求22所述的药物组合物。
37.根据权利要求24-36中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以约5μg/kg至约400mg/kg受试者体重的量施用。
38.根据权利要求24-36中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段以约0.05mg至约10mg的量施用于所述受试者的眼睛。
39.根据权利要求书1-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在下列各项中的应用：治疗有此需要的受试者的新生血管性年龄相关性黄斑变性；治疗有此需要的受试者的糖尿病性视网膜病变；或治疗有需要的受试者的早产儿视网膜病变；治疗有此需要的受试者的眼睛中血管生成相关疾病，所述疾病任选选自新生血管性青光眼、角膜新血管形成、翼状胬肉、视网膜静脉阻塞、由于近视的视网膜和黄斑新血管形成、炎性病症、遗传性视网膜营养不良和镰状细胞视网膜病变。
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