CN107646678B - 一种石斛育苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织培养技术领域领域，尤其涉及一种石斛育苗方法，包括以下步骤：增殖培养、丛生苗培养、生根壮苗培养；本发明，由于使用了特制复合基质和灭菌液于培养基中，对石斛生长过程中易感染的染黑斑病、疫病、茎基腐病具有很好抑制效果，并提供了石斛生长所需的营养物质，使得石斛根长势较好，根多而长、粗壮，长势良好，全株深绿色，茎质地变硬，健壮度高，平均生根数高达24.9条/株，平均根长7.6cm，株平均增高量5.6cm，茎平均增粗4.5mm，移栽后存活率高达91.5％。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域领域，尤其涉及一种石斛育苗方法。
背景技术
石斛是兰科石斛属多年生草本植物，由于其对生长环境要求苛刻，多生长于多湿高温的热带、亚热带林内树干、悬崖峭壁及岩石缝隙之间，生长十分缓慢、自身繁殖能力也极低。加上长期人为无节制的采挖和破坏，致使铁皮石斛濒临灭绝。而传统的分株、扦插等方式繁殖率很低，远远不能满足医疗和保健用药的需求。为了满足市场的需求，国内许多科研人员进行了铁皮石斛组织培养技术的研究，在种子培养、茎尖培养和茎段培养等方面取得了一定的成果，但铁皮石斛试管苗脱瓶移栽成活率低和生长缓慢的问题仍然有待解决，此外，育苗及移栽阶段，石斛苗易感染黑斑病、疫病、茎基腐病、其都是制约铁皮石斛大规模繁育和种植的主要问题。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种石斛育苗方法，具体是通过以下技术方案来实现的：
一种石斛育苗方法，包括以下步骤：
1)增殖培养：将带节的石斛茎段接种到增殖培养基中，诱导腋芽，腋芽高度超过1cm，切除芽点，诱导丛生芽，待丛生芽长达1-2cm时，丛生芽进行增殖培养，并将切割完丛生芽的原茎段接种到增殖培养基中培养2-3天，诱导愈伤组织；
2)丛生苗培养：将愈伤组织切割并转入丛生培养基中培养，得丛生苗，其中丛生苗高4-6cm，有2-5条根；
3)生根壮苗培养：丛生苗自然温度光照下先将培养瓶放置1d，然后拧松瓶盖放置1-2d，最后揭开瓶盖放置1-2d后进行炼苗，取出苗并洗净琼脂，移栽于生根壮苗基质中，采用单栽进行定植后浇透水，室内培养10-15天，每天浇水一次，15天以后，室外培养，每天施用营养液1次，培养60d，既得。
进一步，所述的增殖培养基，是将1/3MS基本培养基、复合基质15-20份、灭菌液15-17份、蔗糖14-15份、琼脂粉3-4.3份、活性炭1-2份混合，得混合料1，加入0.0005-0.002倍混合料1的生长素后，混合而成。
进一步，所述的丛生培养基，是将1/2MS基本培养基、复合基质18-21份、灭菌液17-20份、蔗糖17-19份、琼脂粉5-6份、活性炭2-3份混合，得混合料2，加入0.0004-0.003倍混合料2的生长素后，混合既得。
进一步，所述的室内培养，环境温度为25-27℃，空气相对湿度为80-90％，光照强度为1700-2000lux。
所述的生根培养基质，包括以下质量份原料：泥炭40-50份、松树皮40-50份、兰石40-50份、灭菌液20-30份、复合基质20-30份。
进一步，所述的复合基质，包括以下质量份的原料：叶象花20-23份、喜树果15-17份、土豆12-14份、香蕉7-10份、百香果5-6份、玉米粉5-6份、槐花2-3份。
进一步，所述的复合基质，包括以下制备步骤：
1)叶象花、喜树果、土豆、玉米粉混合，粉碎，过80-100目筛，加水制成含水量为50-60％的料1，30-35℃封闭发酵3-5天，得发酵料，加入3-5倍发酵料质量的溶液1，40-45KHz的超声频率下提取50-70min，过滤，得滤液1；其中所述的溶液1为0.1-0.3mol/L的磷酸二氢钠、0.05-0.07mol/L的氯化钾、0.2-0.3mol/L的氯化钠、体积分数为7-10％的甘油、pH＝7.5-8.3；
2)香蕉、百香果混合匀浆，过滤，得滤液2，加入滤液1混合，5-8℃混合2-3h，30-35℃静置3-4h，70-80℃煎煮20-30min，既得。
进一步，所述的灭菌液，包括以下质量份的原料：商陆40-50份、泽兰30-35份、续断20-23份、薤白15-17份、三七14-16份、EDTA四钠5-7份、苯氧乙醇3-5份。
其中，所述的灭菌液，包括以下步骤：
商陆、泽兰、续断、薤白、三七混合粉碎，220-240℃、3.0-3.5MPa下处理3-5min，加入3-5倍溶液2，80-90℃回流提取5-7h，得提取液，提取液中加入EDTA四钠、苯氧乙醇，70-75r/min、55-70℃搅拌30-60min，得反应液，加入1/5-1/7反应液体积的乙醇，8-12℃静置12-14h，过滤，滤液减压蒸馏回收乙醇，得残余液，浓缩残余液至原体积的1/2-1/3，既得；
其中所述的溶液2，是红茶、柚子皮、白芨、水按质量比20-23:5-8:3-6:1000-1700混合，50-60℃煎煮2-3h，过滤，既得。
进一步，所述的生长素，是将萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸按照质量比0.2-0.5:0.5-2.0:0.5-1.0混合而成。
进一步，所述的营养液，为6-苄氨基腺嘌呤、灭菌液、复合基质、水按照质量比0.0003-0.005:30-33:25-28:50-60混合而成。
本发明的有益效果：本发明，由于使用了特制复合基质和灭菌液于培养基中，对石斛生长过程中易感染的染黑斑病、疫病、茎基腐病具有很好抑制效果，并提供了石斛生长所需的营养物质，使得石斛根长势较好，根多而长、粗壮，长势良好，全株深绿色，茎质地变硬，健壮度高，平均生根数高达24.9条/株，平均根长7.6cm，株平均增高量5.6cm，茎平均增粗4.5mm，移栽后存活率高达91.5％。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种石斛育苗方法，包括以下步骤：
1)增殖培养：将带节的石斛茎段接种到增殖培养基中，诱导腋芽，腋芽高度超过1cm，切除芽点，诱导丛生芽，待丛生芽长达1-2cm时，丛生芽进行增殖培养，并将切割完丛生芽的原茎段接种到增殖培养基中培养2-3天，诱导愈伤组织；
2)丛生苗培养：将愈伤组织切割并转入丛生培养基中培养，得丛生苗，其中丛生苗高4-6cm，有2-5条根；
3)生根壮苗培养：丛生苗自然温度光照下先将培养瓶放置1d，然后拧松瓶盖放置1d，最后揭开瓶盖放置1d后进行炼苗，取出苗并洗净琼脂，移栽于生根壮苗基质中，采用单栽进行定植后浇透水，室内培养10天，每天浇水一次，15天以后，室外培养，每天施用营养液1次，培养60d，既得。
所述的增殖培养基，是将1/3MS基本培养基、复合基质15g、灭菌液15g、蔗糖14g、琼脂粉3g、活性炭1g混合，得混合料1，加入0.0005倍混合料1的生长素后，混合而成。
所述的丛生培养基，是将1/2MS基本培养基、复合基质18g、灭菌液17g、蔗糖17g、琼脂粉5g、活性炭2g混合，得混合料2，加入0.0004倍混合料2的生长素后，混合既得。
所述的室内培养，环境温度为25℃，空气相对湿度为80％，光照强度为1700lux。
所述的生根培养基质，包括以下质量份原料：泥炭40g、松树皮40g、兰石40g、灭菌液20g、复合基质20g。。
所述的复合基质，包括以下质量份的原料：叶象花20g、喜树果15g、土豆12g、香蕉7g、百香果5g、玉米粉5g、槐花2g。
所述的复合基质，包括以下制备步骤：
1)叶象花、喜树果、土豆、玉米粉混合，粉碎，过80目筛，加水制成含水量为50％的料1，30℃封闭发酵3天，得发酵料，加入3倍发酵料质量的溶液1，40KHz的超声频率下提取50min，过滤，得滤液1；其中所述的溶液1为0.1mol/L的磷酸二氢钠、0.05mol/L的氯化钾、0.2mol/L的氯化钠、体积分数为7％的甘油、pH＝7.5；
2)香蕉、百香果混合匀浆，过滤，得滤液2，加入滤液1混合，5℃混合2h，30℃静置3h，70℃煎煮20min，既得。
所述的灭菌液，包括以下质量份的原料：商陆40g、泽兰30g、续断20g、薤白15g、三七14g、EDTA四钠5g、苯氧乙醇3g。
所述的灭菌液，包括以下步骤：
商陆、泽兰、续断、薤白、三七混合粉碎，220℃、3.0MPa下处理3min，加入3倍溶液2，80℃回流提取5h，得提取液，提取液中加入EDTA四钠、苯氧乙醇，70r/min、55℃搅拌30min，得反应液，加入1/5反应液体积的乙醇，8℃静置12h，过滤，滤液减压蒸馏回收乙醇，得残余液，浓缩残余液至原体积的1/2，既得；
其中所述的溶液2，是红茶、柚子皮、白芨、水按质量比20:5:3:1000混合，50℃煎煮2h，过滤，既得。
所述的生长素，是将萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸按照质量比0.2:0.5:0.5混合而成。
所述的营养液，为6-苄氨基腺嘌呤、灭菌液、复合基质、水按照质量比0.0003:30:25:50混合而成。
实施例2
一种石斛育苗方法，包括以下步骤：
1)增殖培养：将带节的石斛茎段接种到增殖培养基中，诱导腋芽，腋芽高度超过1cm，切除芽点，诱导丛生芽，待丛生芽长达1-2cm时，丛生芽进行增殖培养，并将切割完丛生芽的原茎段接种到增殖培养基中培养2-3天，诱导愈伤组织；
2)丛生苗培养：将愈伤组织切割并转入丛生培养基中培养，得丛生苗，其中丛生苗高4-6cm，有2-5条根；
3)生根壮苗培养：丛生苗自然温度光照下先将培养瓶放置1d，然后拧松瓶盖放置2d，最后揭开瓶盖放置2d后进行炼苗，取出苗并洗净琼脂，移栽于生根壮苗基质中，采用单栽进行定植后浇透水，室内培养13，每天浇水一次，15天以后，室外培养，每天施用营养液1次，培养60d，既得。
所述的增殖培养基，是将1/3MS基本培养基、复合基质17g、灭菌液16g、蔗糖15g、琼脂粉3.5g、活性炭1.6g混合，得混合料1，加入0.001倍混合料1的生长素后，混合而成。
所述的丛生培养基，是将1/2MS基本培养基、复合基质20g、灭菌液18g、蔗糖18g、琼脂粉5.6g、活性炭2.3g混合，得混合料2，加入0.0015倍混合料2的生长素后，混合既得。
所述的室内培养，环境温度为26℃，空气相对湿度为85％，光照强度为1800lux。
所述的生根培养基质，包括以下质量份原料：泥炭45g、松树皮45g、兰石45g、灭菌液25g、复合基质25g。
所述的复合基质，包括以下质量份的原料：叶象花22g、喜树果16g、土豆13g、香蕉9g、百香果5.6g、玉米粉5.6g、槐花2.3g。
所述的复合基质，包括以下制备步骤：
1)叶象花、喜树果、土豆、玉米粉混合，粉碎，过100目筛，加水制成含水量为55％的料1，33℃封闭发酵4天，得发酵料，加入4倍发酵料质量的溶液1，43KHz的超声频率下提取60min，过滤，得滤液1；其中所述的溶液1为0.2mol/L的磷酸二氢钠、0.06mol/L的氯化钾、0.25mol/L的氯化钠、体积分数为8％的甘油、pH＝8.0；
2)香蕉、百香果混合匀浆，过滤，得滤液2，加入滤液1混合，7℃混合2.3h，33℃静置3.4h，75℃煎煮25min，既得。
所述的灭菌液，包括以下质量份的原料：商陆45g、泽兰33g、续断22g、薤白16g、三七15g、EDTA四钠6g、苯氧乙醇4g。
其中，所述的灭菌液，包括以下步骤：
商陆、泽兰、续断、薤白、三七混合粉碎，230℃、3.3MPa下处理4min，加入4倍溶液2，85℃回流提取6h，得提取液，提取液中加入EDTA四钠、苯氧乙醇，73r/min、65℃搅拌40min，得反应液，加入1/6反应液体积的乙醇，10℃静置13h，过滤，滤液减压蒸馏回收乙醇，得残余液，浓缩残余液至原体积的1/2，既得；
其中所述的溶液2，是红茶、柚子皮、白芨、水按质量比22:6:5:1500混合，55℃煎煮2.3h，过滤，既得。
进一步，所述的生长素，是将萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸按照质量比0.3:1.0:0.7混合而成。
所述的营养液，为6-苄氨基腺嘌呤、灭菌液、复合基质、水按照质量比0.003:31:26:55混合而成。
实施例3
一种石斛育苗方法，包括以下步骤：
1)增殖培养：将带节的石斛茎段接种到增殖培养基中，诱导腋芽，腋芽高度超过1cm，切除芽点，诱导丛生芽，待丛生芽长达1-2cm时，丛生芽进行增殖培养，并将切割完丛生芽的原茎段接种到增殖培养基中培养2-3天，诱导愈伤组织；
2)丛生苗培养：将愈伤组织切割并转入丛生培养基中培养，得丛生苗，其中丛生苗高4-6cm，有2-5条根；
3)生根壮苗培养：丛生苗自然温度光照下先将培养瓶放置1d，然后拧松瓶盖放置2d，最后揭开瓶盖放置2d后进行炼苗，取出苗并洗净琼脂，移栽于生根壮苗基质中，采用单栽进行定植后浇透水，室内培养15天，每天浇水一次，15天以后，室外培养，每天施用营养液1次，培养60d，既得。
所述的增殖培养基，是将1/3MS基本培养基、复合基质20g、灭菌液17g、蔗糖15g、琼脂粉4.3g、活性炭2g混合，得混合料1，加入0.002倍混合料1的生长素后，混合而成。
所述的丛生培养基，是将1/2MS基本培养基、复合基质21g、灭菌液20g、蔗糖19g、琼脂粉6g、活性炭3g混合，得混合料2，加入0.003倍混合料2的生长素后，混合既得。
所述的室内培养，环境温度为27℃，空气相对湿度为90％，光照强度为2000lux。
所述的生根培养基质，包括以下质量份原料：泥炭50g、松树皮50g、兰石50g、灭菌液30g、复合基质30g。
所述的复合基质，包括以下质量份的原料：叶象花23g、喜树果17g、土豆14g、香蕉10g、百香果6g、玉米粉6g、槐花3g。
所述的复合基质，包括以下制备步骤：
1)叶象花、喜树果、土豆、玉米粉混合，粉碎，过100目筛，加水制成含水量为60％的料1，35℃封闭发酵5天，得发酵料，加入5倍发酵料质量的溶液1，45KHz的超声频率下提取70min，过滤，得滤液1；其中所述的溶液1为0.3mol/L的磷酸二氢钠、0.07mol/L的氯化钾、0.3mol/L的氯化钠、体积分数为10％的甘油、pH＝8.3；
2)香蕉、百香果混合匀浆，过滤，得滤液2，加入滤液1混合，8℃混合3h，35℃静置4h，80℃煎煮30min，既得。
所述的灭菌液，包括以下质量份的原料：商陆50g、泽兰35g、续断23g、薤白17g、三七16g、EDTA四钠7g、苯氧乙醇5g。
其中，所述的灭菌液，包括以下步骤：
商陆、泽兰、续断、薤白、三七混合粉碎，240℃、3.5MPa下处理5min，加入5倍溶液2，90℃回流提取7h，得提取液，提取液中加入EDTA四钠、苯氧乙醇，75r/min、70℃搅拌60min，得反应液，加入1/7反应液体积的乙醇，12℃静置14h，过滤，滤液减压蒸馏回收乙醇，得残余液，浓缩残余液至原体积的1/3，既得；
其中所述的溶液2，是红茶、柚子皮、白芨、水按质量比23:8:6:1700混合，60℃煎煮3h，过滤，既得。
进一步，所述的生长素，是将萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸按照质量比0.5:2.0:1.0混合而成。
所述的营养液，为6-苄氨基腺嘌呤、灭菌液、复合基质、水按照质量比0.005:33:28:60混合而成。
实施例4
实施例4与实施例3的区别在于，实施例4所有的培养基中不含灭菌液。
实施例5
实施例5与实施例3的区别在于，实施例5所有的培养基中不含复合基质。
实施例6
实施例6与实施例3的区别在于，实施例6所有的培养基中不含灭菌液和复合基质。
实施例7
实施例6与实施例3的区别在于，实施例7中灭菌液的制备较简单，只是将商陆、泽兰、续断、薤白、三七加水煎煮、过滤，与EDTA四钠7g、苯氧乙醇混合既得；
对于复合基质，是将叶象花、喜树果、土豆、玉米粉混合，粉碎，过100目筛，加入5倍发酵料质量的水，45KHz的超声频率下提取70min，过滤，得滤液1；
香蕉、百香果混合匀浆，过滤，得滤液2，加入滤液1混合，8℃混合3h，35℃静置4h，80℃煎煮30min，既得。
实验例
1、石斛苗生长状况研究
按照实施例1-7的方法对石斛进行育苗作为实验组1-7，同时参照申请号CN201510230160.X《一种铁皮石斛根尖组培快速繁育方法》进行育苗作为对照组，每个实验组育苗200株，统计每个实验组石斛苗生长情况。结果如表1所示。
表1石斛根生长情况
表2石斛壮苗生长情况
表3移栽后石斛生长情况
通过以上统计分析发现，本法明由于使用了特制复合基质和灭菌液于培养基中，使得石斛根长势较好，根多而长、粗壮，长势良好，全株深绿色，茎质地变硬，健壮度高，平均生根数高达24.9条/株，平均根长7.6cm，株平均增高量5.6cm，茎平均增粗4.5mm，移栽后存活率高达91.5％。
Claims (4)
1.一种石斛育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)增殖培养：将带节的石斛茎段接种到增殖培养基中，诱导腋芽，腋芽高度超过1cm，切除芽点，诱导丛生芽，待丛生芽长达1-2cm时，丛生芽进行增殖培养，并将切割完丛生芽的原茎段接种到增殖培养基中培养2-3天，诱导愈伤组织；
2)丛生苗培养：将愈伤组织切割并转入丛生培养基中培养，得丛生苗，其中丛生苗高4-6cm，有2-5条根；
3)生根壮苗培养：丛生苗自然温度光照下先将培养瓶放置1d，然后拧松瓶盖放置1-2d，最后揭开瓶盖放置1-2d后进行炼苗，取出苗并洗净琼脂，移栽于生根壮苗基质中，采用单栽进行定植后浇透水，室内培养10-15天，每天浇水一次，15天以后，室外培养，每天施用营养液1次，培养60d，即得；
其中，所述的增殖培养基，是将1/3MS基本培养基、复合基质15-20份、灭菌液15-17份、蔗糖14-15份、琼脂粉3-4.3份、活性炭1-2份混合，得混合料1，加入0.0005-0.002倍混合料1的生长素后，混合而成；所述份数是指质量份；
其中，所述的丛生培养基，是将1/2MS基本培养基、复合基质18-21份、灭菌液17-20份、蔗糖17-19份、琼脂粉5-6份、活性炭2-3份混合，得混合料2，加入0.0004-0.003倍混合料2的生长素后，混合即得；所述份数是指质量份；
其中，所述的生根壮苗基质，由以下质量份原料制成：泥炭40-50份、松树皮40-50份、兰石40-50份、灭菌液20-30份、复合基质20-30份；
其中，所述的复合基质，由以下质量份的原料制成：叶象花20-23份、喜树果15-17份、土豆12-14份、香蕉7-10份、百香果5-6份、玉米粉5-6份、槐花2-3份；制备步骤如下：
1)叶象花、喜树果、土豆、玉米粉、槐花混合，粉碎，过80-100目筛，加水制成含水量为50-60％的料1，30-35℃封闭发酵3-5天，得发酵料，加入3-5倍发酵料质量的溶液1，40-45KHz的超声频率下提取50-70min，过滤，得滤液1；其中所述的溶液1为0.1-0.3mol/L的磷酸二氢钠、0.05-0.07mol/L的氯化钾、0.2-0.3mol/L的氯化钠、体积分数为7-10％的甘油、pH＝7.5-8.3；
2)香蕉、百香果混合匀浆，过滤，得滤液2，加入滤液1混合，5-8℃混合2-3h，30-35℃静置3-4h，70-80℃煎煮20-30min，即得；
其中，所述的灭菌液，由以下质量份的原料制成：商陆40-50份、泽兰30-35份、续断20-23份、薤白15-17份、三七14-16份、EDTA四钠5-7份、苯氧乙醇3-5份；制备步骤如下：
商陆、泽兰、续断、薤白、三七混合粉碎，220-240℃、3.0-3.5MPa下处理3-5min，加入3-5倍溶液2，80-90℃回流提取5-7h，得提取液，提取液中加入EDTA四钠、苯氧乙醇，70-75r/min、55-70℃搅拌30-60min，得反应液，加入1/5-1/7反应液体积的乙醇，8-12℃静置12-14h，过滤，滤液减压蒸馏回收乙醇，得残余液，浓缩残余液至原体积的1/2-1/3，即得；
其中所述的溶液2，是红茶、柚子皮、白芨、水按质量比20-23:5-8:3-6:1000-1700混合，50-60℃煎煮2-3h，过滤，即得。
2.如权利要求1所述的石斛育苗方法，其特征在于，所述的室内培养，环境温度为25-27℃，空气相对湿度为80-90％，光照强度为1700-2000lux。
3.如权利要求1所述的石斛育苗方法，其特征在于，所述的生长素，是将萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤、吲哚丁酸按照质量比0.2-0.5:0.5-2.0:0.5-1.0混合而成。
4.如权利要求1所述的石斛育苗方法，其特征在于，所述的营养液，为6-苄氨基腺嘌呤、灭菌液、复合基质、水按照质量比0.0003-0.005:30-33:25-28:50-60混合而成。
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