CN107619797A

CN107619797A - 一种基于固体废弃物混合发酵复合菌剂及其生产工艺

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Publication number: CN107619797A
Application number: CN201610573849.7A
Authority: CN
Inventors: 李昆仑; 赵林; 李宝君
Original assignee: Hang Chen Bio Tech Ltd Jinan
Current assignee: Hang Chen Bio Tech Ltd Jinan
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明涉及一种基于固体废弃物的混合发酵工艺，是基于木薯渣、蘑菇渣、糠醛渣、秸秆等低值农业废弃物通过三次固体复合发酵生产高附加值产品的一种发酵方式。包括：摇瓶种子培养、原料配混、灭菌、第一次接种、第一次发酵、第二次补料、第二次接种、第二次发酵、第三次补料、第三次接种和第三次发酵，本发明包括三次接种、一次配料、二次补料、三次烘干等步骤，充分腐熟废弃物中的有机物质，得到充分腐熟、高密度、高肥效、抗病害的高附加值的混合菌剂。

Description

一种基于固体废弃物混合发酵复合菌剂及其生产工艺

技术领域

本发明涉及生物有机肥固体发酵技术领域，特别是基于蘑菇渣、木薯渣、糠醛渣、秸秆、糖蜜、等农业废弃物的益生菌生产的混合发酵工艺。

背景技术

固体发酵是指在没有或几乎没有自由水存在的情况下，在有一定湿度的水下溶性固态基质中，一种或多种微生物的一个生物反应过程。与液体发酵相比，固体发酵所需的培养基简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或工农业生产的下脚料，投资少，能耗低，技术较简单，产物的产率较高。固体发酵的基质含水量低，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便，且发酵过程一般不需要严格的无菌操作。

目前我国益生菌固体发酵菌群结构单一，产量普遍较低，高附加值产品较少，产品功能单一，且由于物料的腐熟程度较低，使用后容易造成二次污染。

发明内容

本发明针对上述不足，公开了一种基于固体废弃物的益生菌复合发酵工艺。

1）摇瓶种子制备

芽孢杆菌摇瓶种子制备：

将芽孢杆菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液80-220ml，培养基配比为：豆粕1.00%-5.00%，玉米粉0.80%-3.50%，葡萄糖0.30%-1.00%，硫酸锰0.01%-0.05%，磷酸镁0.05%-0.15%，磷酸氢二钾0.10%-0.50%，灭菌前pH调至7.5-9.5，摇床培养条件：温度35℃-40℃，转速150-250rpm。培养时间8-20小时，得到活菌含量达到2×10^8-10×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

放线菌摇瓶种子制备：

将放线菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液80-220ml，培养基配比为：大豆粉0.1%-0.9％，葡萄糖2.0%-2.5%，硫酸铵1.0%-1.9％，氯化钠0.2%-0.8%，pH 6.0-8.0，摇床培养条件：培养温度26℃-32℃，转速150-200 rpm。培养时间65-80小时，得到活菌含量达到5×10^8-5×15^8cfu/ml的摇瓶种子。

真菌摇瓶种子液制备：

将真菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液80-220ml，使用液体PDA培养基培养。摇床培养条件：温度26℃-32℃，转速150-250rpm。培养时间48-96小时，得到孢子含量达到5×10^8-15×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

2）原料配混及灭菌：

固体培养基配比：按重量百分比计，木薯渣/蘑菇渣/糠醛渣/玉米秸秆60.0%-95.0%，糖蜜3.0%-25.0%，大米粉2.0%-15.0%，氨基酸液1.0%-5.0%。充分搅拌混匀后压力蒸汽灭菌。灭菌温度115℃-125℃，灭菌时间30-180分钟。

3）第一次接种及发酵

按照3.0%-15.0%的接种量接入摇瓶发酵的芽孢杆菌，补入自来水至培养基含水量达25%-65%，培养基pH值调至5.5-8.0，物料堆积高度为2-18厘米，培养温度33℃-42℃。发酵过程中每两个小时取样测含水量、镜检翻堆，每一个小时通风3-20分钟，根据所测含水量进行补水操作，将物料含水量控制在25%-65%之间，培养至16-28小时镜检发现芽孢率达60%以上结束发酵，放入35℃-45℃烘箱中烘干。得到活菌含量达到50×10^8-250×10^8cfu/g的发酵产物。

4）第二次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，一次发酵物料70.0%-96.0%，马铃薯淀粉3.0%-25.0%，豆粕粉1.0%-13.8%，磷酸二氢钾1.0%，七水硫酸镁0.2%，充分搅拌混匀。

5）第二次接种及发酵：

按照3.0%-15.0%的接种量接入摇瓶发酵的放线菌，补入自来水至培养基含水量达30%-65%，培养基pH值调至6.4-7.8，物料堆积高度为2-18厘米。置于泡沫盒中发酵，发酵温度25℃-35℃，每天取样测含水量、翻堆、镜检，根据所测含水量进行补水操作，将物料含水量控制在30%-65%之间，培养4-6天结束发酵，放入25℃-35℃烘箱中烘干，得到放线菌含量为40×10^8-120×10^8cfu/g的发酵产物。

6)第三次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，二次发酵物料70.0%-90.0%，豆粕粉15.0%-25.0%，玉米浆2.9%-12.9%，糖蜜1.0%，硝酸钾0.1%，充分搅拌混匀。

7）第三次接种及发酵：

按照3.0%-15.0%的接种量接入摇瓶发酵的木霉，补入自来水至培养基含水量达25%-55%，培养基pH值调至5.5-7.0，物料堆积高度为2-8厘米。置于泡沫盒中发酵，发酵温度25℃-35℃，每天取样测含水量、翻堆、镜检，根据所测含水量进行补水操作，将物料含水量控制在25%-55%之间，培养4-8天结束发酵，放入25℃-35℃烘箱中烘干，得到孢子产量为6×10^8-15×10^8cfu/g发酵产物。

8）本发明所具有的优点：本发明独创细菌→放线菌→真菌三段式发酵，充分利用并腐熟了农业固体废弃物中的有机体，通过两次补料，得到了高菌活的复合益生菌产物，为进一步生产低成本、高附加值、高肥效、抗病害的有机肥提供原料基础与技术支撑。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的描述：

实施例一

1）摇瓶种子制备

枯草芽孢杆菌摇瓶种子液制备：

将枯草芽孢杆菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液120ml，培养基配比为：豆粕4.00%，玉米粉2.50%，葡萄糖0.6%，硫酸锰0.02%，磷酸镁0.10%，磷酸氢二钾0.20%，灭菌前pH调至9.0，摇床培养条件：温度37℃，转速200rpm。培养时间14小时，得到活菌含量达到6.3×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

放线菌5406摇瓶种子液制备：

将放线菌5406接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液120ml，培养基配比为：大豆粉0.6％，葡萄糖2.0%，硫酸铵1.5％，氯化钠0.5%，pH 7.0，摇床培养条件：培养温度30℃，转速200 rpm。培养时间75小时，得到活菌含量达到12.1×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

绿色木霉摇瓶种子液制备：

将绿色木霉接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液150ml，使用液体PDA培养基培养。摇床培养条件：温度30℃，转速200rpm。培养时间72小时，得到孢子含量达到8.7×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

2）原料配混及灭菌：

固体培养基配比：按重量百分比计，木薯渣85.0%，糖蜜10.0%，大米粉5.0%。充分搅拌混匀后压力蒸汽灭菌锅灭菌。灭菌温度121℃，灭菌时间150分钟。

3）第一次接种及发酵

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的枯草芽孢杆菌，补入自来水至培养基含水量达40%，培养基pH值调至7.5，物料堆积高度为5厘米，培养温度37℃，将物料含水量控制在40%-50%之间，培养至24小时镜检发现芽孢率达85%以上结束发酵，放入40℃烘箱中烘干。得到活菌含量达到153×10^8cfu/g的发酵产物。

4）第二次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，一次发酵物料74.0%，马铃薯淀粉20.0%，豆粕粉4.8%，磷酸二氢钾1.0%，七水硫酸镁0.2%，充分搅拌混匀。

5）第二次接种及发酵：

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的放线菌5406，补入自来水至培养基含水量达45%，培养基pH值调至7.0，物料堆积高度为10厘米。发酵温度30℃，每天取样测含水量、翻堆、镜检，根据所测含水量进行补水操作，将物料含水量控制在40%-50%之间，培养5天结束发酵，放入30℃烘箱中烘干，得到放线菌含量为105×10^8cfu/g的发酵产物。

6)第三次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，二次发酵物料73.0%，豆粕粉20.0%，玉米浆4.9%，糖蜜1.0%，硝酸钾0.1%，充分搅拌混匀。

7）第三次接种及发酵：

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的哈茨木霉，补入自来水至培养基含水量达40%，培养基pH值调至6.0，物料堆积高度为15厘米，发酵温度30℃，每天取样测含水量、翻堆、镜检，根据所测含水量进行补水操作，将物料含水量控制在30%-40%之间，培养7天结束发酵，放入30℃烘箱中烘干，得到孢子产量为13×10^8cfu/g发酵产物。

实施例二

1）摇瓶种子制备

地衣芽孢杆菌摇瓶种子液制备：

将地衣芽孢杆菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液100ml，培养基配比为：豆粕4.00%，玉米粉2.50%，葡萄糖0.60%，硫酸锰0.02%，磷酸镁0.10%，磷酸氢二钾0.20%，灭菌前pH调至9.0，摇床培养条件：温度37℃，转速200rpm。培养时间14小时，得到活菌含量达到7.3×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

细黄链霉菌摇瓶种子液制备：

将细黄链霉菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液120ml，培养基配比为：大豆粉0.6％，葡萄糖2.2%，硫酸铵1.5％，氯化钠0.5%，pH 7.0，摇床培养条件：培养温度30℃，转速200 rpm。培养时间75小时，得到活菌含量达到8.9×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

哈茨木霉摇瓶种子液制备：

将哈茨木霉接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液150ml，使用液体PDA培养基培养。摇床培养条件：温度30℃，搅拌转速200rpm。培养时间72小时，得到孢子含量达到11.2×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

2）原料配混及灭菌：

固体培养基配比：按重量百分比计，蘑菇渣90.0%，糖蜜7.0%，大米粉3.0%。充分搅拌混匀后压力蒸汽灭菌锅灭菌。灭菌温度121℃，灭菌时间150分钟。

3）第一次接种及发酵

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的地衣芽孢杆菌，补入自来水至培养基含水量达40%，培养基pH值调至6.5，置于通风的塑料大盒子中培养，物料堆积高度为8厘米，培养温度33℃，将物料含水量控制在40%-50%之间，培养至24小时镜检发现芽孢率为85%以上结束发酵，放入40℃烘箱中烘干。得到活菌含量达到124×10^8cfu/g的发酵产物。

4）第二次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，一次发酵物料79.0%，马铃薯淀粉15.0%，豆粕粉4.8%，磷酸二氢钾1.0%，七水硫酸镁0.2%，充分搅拌混匀。

5）第二次接种及发酵：

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的细黄链霉菌，补入自来水至培养基含水量达50%，培养基pH值调至6.5，物料堆积高度为7厘米，发酵温度28℃，将物料含水量控制在40%-50%之间，培养5天结束发酵，放入30℃烘箱中烘干，得到放线菌含量为104×10^8cfu/g的发酵产物。

6)第三次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，二次发酵物料68.0%，豆粕粉25.0%，玉米浆4.9%，糖蜜1.0%，硝酸钾0.1%，充分搅拌混匀。

7）第三次接种及发酵：

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的绿色木霉，补入自来水至培养基含水量达40%，培养基pH值调至6.0，物料堆积高度为4厘米，发酵温度30℃，将物料含水量控制在30%-40%之间，培养7天结束发酵，放入30℃烘箱中烘干，得到孢子产量为12.6×10^8cfu/g发酵产物。

实施例三

1）摇瓶种子制备

巨大芽孢杆菌摇瓶种子液制备：

将巨大芽孢杆菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液100ml，培养基配比为：葡萄糖2.0%，豆粕1.50%，磷酸氢二钾0.20%，氯化钠0.20%，硫酸镁0.05%，氯化铁0.0005%，灭菌前pH调至9.0，摇床培养条件：温度37℃，转速200rpm。培养时间14小时，得到活菌含量达到2.4×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

细黄链霉菌摇瓶种子液制备：

将细黄链霉菌接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液120ml，培养基配比为：大豆粉0.6％，葡萄糖2.2%，硫酸铵1.5％，氯化钠0.5%，pH 7.0，摇床培养条件：培养温度30℃，转速200 rpm。培养时间75小时，得到活菌含量达到9.6×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

黑曲霉摇瓶种子液制备：

将黑曲霉接种到液体摇瓶中，装液量为每1L摇瓶装液150ml，使用液体PDA培养基培养。摇床培养条件：温度30℃，转速200rpm。培养时间72小时，得到孢子含量达到9.5×10^8cfu/ml的摇瓶种子。

2）原料配混及灭菌：

固体培养基配比：按重量百分比计，糠醛渣75.0%，糖蜜15.0%，大米粉10.0%。充分搅拌混匀后压力蒸汽灭菌锅灭菌。灭菌温度121℃，灭菌时间150分钟。

3）第一次接种及发酵

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的巨大芽孢杆菌，补入自来水至培养基含水量达50%，培养基pH值调至7.0，物料堆积高度为15厘米，培养温度37℃，将物料含水量控制在40%-50%之间，培养至24小时镜检发现芽孢率为85%以上结束发酵，放入40℃烘箱中烘干。得到活菌含量达到60×10^8cfu/g的发酵产物。

4）第二次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，一次发酵物料84.0%，马铃薯淀粉10.0%，豆粕粉4.8%，磷酸二氢钾1.0%，七水硫酸镁0.2%，充分搅拌混匀。

5）第二次接种及发酵：

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的放线菌5406，补入自来水至培养基含水量达50%，培养基pH值调至7.2，物料堆积高度为5厘米，发酵温度30℃，将物料含水量控制在40%-50%之间，培养5天结束发酵，放入30℃烘箱中烘干，得到放线菌含量为72×10^8cfu/g的发酵产物。

6)第三次配料：

固体培养基配比：按重量百分比计，二次发酵物料78.0%，豆粕粉15.0%，玉米浆4.9%，糖蜜1.0%，硝酸钾0.1%，充分搅拌混匀。

7）第三次接种及发酵：

按照5.0%的接种量接入摇瓶发酵的绿色木霉，补入自来水至培养基含水量达40%，培养基pH值调至5.5，物料堆积高度为14厘米，发酵温度30℃，将物料含水量控制在30%-40%之间，培养7天结束发酵，放入30℃烘箱中烘干，得到孢子产量为8.7×10^8cfu/g发酵产物。

Claims

1.基于固体废弃物的益生菌复合发酵工艺，其特征在于，所述菌种包括芽孢杆菌、放线菌、真菌中的两种或两种以上；

如权利要求1所述，芽孢杆菌包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌；

如权利要求1所述，放线菌包括细黄链霉菌、阿维链霉菌；

如权利要求1所述，真菌包括绿色木霉、哈茨木霉；

如权利要求1所述，发酵工艺包括如下步骤：

各菌种摇瓶种子制备、原料配混及灭菌、第一次接种及发酵、第二次配料、第二次接种及发酵、第三次配料、第三次接种及发酵、后处理等步骤；

如权利要求5所述，原料配混及灭菌条件如下：按重量百分比计，木薯渣/蘑菇渣/糠醛渣/玉米秸秆60.0%-95.0%，糖蜜3.0%-25.0%，大米粉2.0%-15.0%，氨基酸液1.0%-5.0%。

2.充分搅拌混匀后压力蒸汽灭菌。

3.灭菌温度115℃-125℃，灭菌时间30-180分钟。

4.如权利要求5所述，各环节接种量均在1-5%之间；

如权利要求5所述，各环节发酵条件如下：发酵温度25℃-35℃，将物料含水量控制在30%-65%之间；

如权利要求5所述，第二次配料，按重量百分比计，一次发酵物料70.0%-96.0%，马铃薯淀粉3.0%-25.0%，豆粕粉1.0%-13.8%，磷酸二氢钾1.0%，七水硫酸镁0.2%，充分搅拌混匀。

5.如权利要求5所述，第三次配料，按重量百分比计，二次发酵物料70.0%-90.0%，豆粕粉15.0%-25.0%，玉米浆2.9%-12.9%，糖蜜1.0%，硝酸钾0.1%，充分搅拌混匀。