CN107595875A - 含有丁苯酞的组合物及其在治疗脑血管病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种药物组合物，包括丁苯酞和甲钴胺。在治疗脑血管病及痴呆病时具有协同作用，其中甲钴胺可以显著增加丁苯酞的治疗效果，从而降低丁苯酞起效剂量，减少用药量，长期应用降低不良反应的发生。故本发明药物组合物可以更有效的治疗脑血管病及痴呆病，可以在较小的剂量达到治疗效果，适合临床使用。

Description

含有丁苯酞的组合物及其在治疗脑血管病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药组合物技术领域，具体涉及一种含有丁苯酞的药物组合物及其应用。

背景技术

随着经济的快速发展，人们生活条件和生活方式的明显改变，加之迅速到来的人口老龄化，导致国民的疾病谱、死亡谱发生了很大的变化。目前脑血管病已成为危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病。脑血管病（cerebrovascular disease，简称CVD）为脑血管异常导致的脑部病变，脑卒中（stroke）一般指急性脑血管疾病，据卫生部统计中心发布的人群监测资料显示，无论是城市或农村，脑血管病近年在全死因顺位中都呈现明显前移的趋势。城市居民脑血管病死亡已上升至第一、二位，农村地区在20世纪90年代初脑血管病死亡列第三位，90年代后期升至第二位。国内完成的城市和省农村神经疾病流行病学调查结果显示，我国城市脑血管病的年发病率、死亡率和时点患病率分别为219/10万、16/10万和719/10万；农村地区分别为185/10万、142/10万和394/10万。据此估算，全国每年新发脑卒中约200万人；每年死于脑血管病约150万人；通过合理治疗获得痊愈和不同程度后遗症的人数为600～700万。我国属于脑卒中高发性国家，疾病死亡人数居世界首位。中国卫生部公布的第三次全国死因调查结果显示，脑血管病已占死亡总数的22.45%。

脑血管病是致残率很高的疾病。据统计，在存活的脑血管病患者中，约有四分之三不同程度地丧失劳动能力，其中重度致残者约占40%。目前，全国每年用于治疗脑血管病的费用估计要在100亿元以上，加上各种间接经济损失，每年因本病支出接近200亿元人民币，给国家和众多家庭造成沉重的经济负担。

脑血管病可简单分为两类，一类是由于血液流动减少或断流造成的缺血性脑血管病，另一类是由于血管破裂造成出血性脑血管病。缺血性脑血管病（ischemiccerebrovascular disease，简称ICVD），是指由于各种原因引起脑血管壁增厚、管腔狭窄闭塞和血栓形成，使受累脑血管的血供区域缺血缺氧，导致病变组织的缺氧性坏死、脑软化，并出现与之相应的神经功能障碍。缺血性脑血管病主要是脑梗塞（包括脑血栓形成和脑栓塞）；除了脑梗塞以外，还有一种在24 小时内可以完全恢复，不留任何后遗症的缺血性脑血管病，被称为短暂性脑缺血发作或一过性脑缺血发作，医生习惯简称为TIA，也叫作小中风。出血性脑血管病也分为两类，一类是血管破裂，血液流入脑实质内，成为脑出血或脑溢血；另一类是血管破裂，血液流入包绕脑周围的蛛网膜下腔，成为蛛网膜下腔出血，医生简称为SAH。

缺血性脑血管病由于脑的供血动脉发生供血障碍，导致血管供应区的脑功能损害和神经功能缺损。脑组织对能量、氧的需求量很大，但无储备功能。因此，一旦发生缺血缺氧，很快出现代谢障碍，引起细胞损害。供血区脑组织血供障碍超过一定时间会导致脑梗死。目前研究认为，在脑梗死灶周围一般会形成一个缺血半暗带（ischemic penumbra），其中存在大量仅能维持自身形态的完整处于休眠状态或半休眠状态的脑细胞。由于脑血流受阻，缺少能量的供应，无法行驶原有的正常功能。半暗带的存在一般为6-24 小时左右。在这段时间内，如果及时解除血供障碍，恢复缺血区域血流，才能避免缺血组织坏死，挽救病变组织。如果缺血程度进一步加重，细胞膜的完整性就会受到损害，神经细胞会出现坏死，此阶段将变为不可逆损伤。近年来，随着介入技术及溶栓等方法在临床的推广和应用，尽管解除局部狭窄，使缺血病变的组织和器官重新得到血液供应，但在临床和动物实验中也发现，血供障碍的组织器官在一定的时间后，虽然采取措施恢复血供，组织损伤、器官功能障碍并没有减轻，临床症状反而进一步加重的现象称为脑缺血- 再灌注损伤（cerebralischemia-reperfusion injury，CIRI），严重者甚至引起脑水肿和出血。脑缺血再灌注损伤的发病机制十分复杂，并且各种因素之间彼此交织，互为因果，相互影响。以往研究表明：自由基损伤、缺氧和能量代谢衰竭、炎症损伤、钙离子超载及兴奋性氨基酸毒性作用等诸多因素相关共同参与，最终造成神经细胞坏死和功能症状的缺失。

3-丁基-l(3H)-异苯并呋喃酮，通用名为丁苯酞，又名芹菜甲素，分子式C₁₂H₁₄O₂，是从芹菜籽中分离出来的一种有效成分，临床应用有消旋丁苯酞和左旋丁苯酞，结构式分别如下：

。

丁苯酞为一种多靶点缺血性脑血管病药物，通过提高脑血管内皮NO（一氧化氮）和PGI2（前列环素）的水平、降低细胞内钙浓度、抑制谷氨酸释放、降低花生四烯酸含量、抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等机制作用于脑缺血所致的多个病理环节。动物药效学研究表明，丁苯酞具有较强的抗脑缺血作用；明显改善缺血脑区的微循环和血流量，增加缺血区毛细血管数量；减轻脑水肿，缩小大鼠局部脑缺血的梗死面积；改善脑能量代谢，抑制神经细胞凋亡；抑制血栓形成等。临床研究结果表明，丁苯酞对缺血性神经功能损伤有显著改善作用，可促进患者功能恢复。临床应用丁苯酞药物，偶见转氨酶轻度升高、恶心、腹痛等胃肠道不良反应。

甲钴胺是一种内源性的辅酶B12，参与一碳单位循环，在由同型半胱氨酸合成蛋氨酸的转甲基反应过程中起重要作用。化学名为：Coα-[α-(5,6-二甲基苯并咪唑基)]-Coβ-甲基钴酰胺。分子式: C₆₃H₉₁CoN₁₃O₁₄P，分子量: 1344.38，结构式如下：

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甲钴胺比氰钴胺易于进入神经元细胞器，参与脑细胞和脊髓神经元胸腺嘧啶核苷的合成，促进叶酸的利用和核酸代谢，且促进核酸和蛋白质合成作用较氰钴胺强，能促进轴突运输功能和轴突再生，使链脲霉素诱导的糖尿病大鼠坐骨神经轴突骨架蛋白的运输正常化，对药物引起的神经退变具有抑制作用，如阿霉素、丙烯酰胺、长春新碱引起的神经退变及自发高血压大鼠神经疾病等。甲钴胺可以促进卵磷脂合成和神经元髓鞘形成，延迟的神经突触传递和神经递质减少恢复正常，通过提高神经纤维兴奋性恢复终板电位诱导，能使饲以胆碱缺乏饲料的大鼠脑内乙酰胆碱恢复到正常水平。

药典规定甲钴胺的日服剂量为每天0.5-1.5mg，临床使用时偶见食欲不振、恶心、呕吐、腹泻等胃肠道不良反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物组合物，包括丁苯酞和甲钴胺，该药物组合物联合使用时具有协同作用，可以显著提高治疗效果和安全性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种药物组合物，包括丁苯酞和甲钴胺。

所述的药物组合物中，丁苯酞选自其左旋丁苯酞、右旋丁苯酞、消旋丁苯酞及左旋丁苯酞与右旋丁苯酞的任意比例的混合物，优选为消旋丁苯酞和左旋丁苯酞。

所述药物组合物中，丁苯酞和甲钴胺可以以任何合适的比例存在。从治疗有效性、安全性和用药成本等方面综合考虑，丁苯酞和甲钴胺的重量比为1000:1～1:1000；优选重量比为200:1～1:200；再优选重量比为10～200:1；更优选重量比为25～125:1；进一步优选的重量比为25～100:1；更优选25:1、40:1、50:1、80:1、100:1。

所述的药物组合物中，丁苯酞的重量以C₁₂H₁₄O₂计；甲钴胺的重量以C₆₃H₉₁CoN₁₃O₁₄P计。

本发明的另一目的是提供一种将上述药物组合物用于制备治疗脑血管病药物中的应用。

进一步的，将上述药物组合物用于制备治疗缺血性脑血管病或者脑梗塞药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供上述药物组合物的应用，即所述药物组合物在制备用于治疗痴呆症药物中的应用。

进一步的，上述药物组合物的应用中所述的痴呆症为血管性痴呆和阿尔茨海默症。

本发明所提供的药物组合物，包括丁苯酞和甲钴胺，在治疗脑血管病及痴呆病、尤其是缺血性脑血管病及血管性痴呆病时具有协同作用，可以显著增加丁苯酞治疗效果，降低丁苯酞的起效剂量，减少其用药量，长期应用降低其不良反应的发生。

本发明所提供的药物组合物，可以采用各种给药方式（给药途径）进行疾病的治疗，例如注射、胃肠道、直肠、局部给药等，优选注射给药、胃肠道给药；更优选注射给药；更优选静脉注射给药。

本发明所提供的丁苯酞和甲钴胺药物组合物，在治疗脑血管病，尤其是缺血性脑血管病及脑梗塞时具有协同作用，其中甲钴胺可以显著增加丁苯酞的治疗效果，从而降低丁苯酞起效剂量，减少用药量，长期应用降低不良反应的发生。故本发明药物组合物可以更有效的治疗缺血性脑血管病及痴呆病，可以在较小的剂量达到治疗效果，适合临床使用。

本发明所提供的丁苯酞和甲钴胺药物组合物，在治疗痴呆，尤其血管性痴呆和阿尔茨海默症引起的神经运动功能障碍和受损记忆功能障碍时具有协同作用，其中甲钴胺可以显著增加丁苯酞的治疗效果，从而降低丁苯酞起效剂量，减少用药量，长期应用降低不良反应的发生。故本发明药物组合物可以更有效的治疗缺血性脑血管病及痴呆病，可以在较小的剂量达到治疗效果，适合临床使用。

具体实施方式

下面通过实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步说明，以使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1：注射用药物溶液的制备。

（1）HP-β-CD（羟丙基-β- 环糊精）溶液的制备

取HP-β-CD 900g，加入注射用水2000mL，最终以注射用水定容至3000mL，即为30% HP-β-CD溶液。

（2）注射用丁苯酞溶液的制备

称取消旋丁苯酞25g，加入1500ml HP-β-CD溶液中，搅拌至溶液澄清，用30% HP-β-CD溶液定容至2000ml；即得。

（3）注射用甲钴胺溶液的制备

取甲钴胺1g，加入300 mL 30% HP-β-CD，搅拌至溶液澄清，用30% HP-β-CD溶液定容至400 ml；即得。

（4）注射用丁苯酞+ 甲钴胺溶液的制备

取给定比例的注射用丁苯酞注射液和注射用甲钴胺液，混匀，即得，混合比例如下：

。

上述溶液可以进一步加入常规的渗透压调节剂、pH调节剂等，采用常规方法如经过无菌处理或者冻干技术、分装制备成注射液、水针、冻干粉针等。

实施例2：注射用药物溶液的制备。

（1）HP-β-CD（羟丙基-β- 环糊精）溶液的制备

取HP-β-CD 900g，加入注射用水2000mL，最终以注射用水定容至3000mL，即为30% HP-β-CD 。

（2）注射用左旋丁苯酞溶液的制备

称取消旋左旋丁苯酞25g，加入1500ml HP-β-CD溶液中，搅拌至溶液澄清，用30% HP-β-CD溶液定容至2000ml；即得。

（3）注射用甲钴胺溶液的制备

取甲钴胺1g，加入300 mL 30% HP-β-CD，搅拌至溶液澄清，用30% HP-β-CD溶液定容至400ml；即得。

（4）注射用左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液的制备

取给定比例的注射用左旋丁苯酞注射液和注射用甲钴胺液，混匀，即得，混合比例如下：

。

上述溶液可以进一步加入常规的渗透压调节剂、pH调节剂等，采用常规方法如经过无菌处理或者冻干技术、分装制备成注射液、水针、冻干粉针等。

实施例3 ：小鼠全缺血试验。

1 动物实验材料。

1.1 药品：受试药物为：实施例1所制备注射用丁苯酞（ 消旋丁苯酞 ）溶液，注射用甲钴胺溶液，注射丁苯酞+ 甲钴胺溶液，实施例2所制备注射用左旋丁苯酞溶液，注射左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液，模型对照为30% HP-β-CD溶液。

1.2 动物：SPF 级KM小鼠，雄性，18-22克，由河北医科大学实验动物中心提供；实验动物生产许可证号为SCXK（冀）2013-1-003。实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2011-0059。

1.3 数据处理：数据由SPSS11.5统计软件进行方差分析及组间检验。

2 小鼠全脑缺血试验。

2.1 动物分组及给药：昆明种小鼠150 只，随机分为15 组，即模型对照组（30%HP-β-CD）、丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、左旋丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、甲钴胺组（0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1）、丁苯酞 +甲钴胺组（ 丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1），左旋丁苯酞 +甲钴胺组（ 左旋丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1），每组10 只。

2.2 试验操作及指标观察：小鼠静脉注射给药后30 min，从动物双耳后颈部断头，观察小鼠断头喘气时间及喘气次数。

3、试验结果。

小鼠断头后缺血缺氧导致脑死亡，试验通过药物对缺血缺氧耐受程度的改善作用来考察药物的抗脑缺血作用。如表1所示。

。

丁苯酞、左旋丁苯酞静脉注射单独给药10 mg·kg^-1 能显著延长小鼠断头后的喘气次数和喘气时间，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05）。

甲钴胺静脉注射单独给药0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1对小鼠全脑缺血无作用。

0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1的甲钴胺联合丁苯酞10 mg·kg^-1、左旋丁苯酞10mg·kg^-1给药均具有延长小鼠断头后的喘气次数和喘气时间，与模型组比较具有非常显著性差异（p<0.01、p<0.05），提示甲钴胺与 丁苯酞、左旋丁苯酞联合给药具有协同作用，可以增强丁苯酞 对缺血缺氧小鼠的保护作用，即可以用于治疗脑血管病，尤其是缺血性脑血管病。

实施例4：小鼠全缺血试验。

1 动物实验材料。

1.1 药品：受试药物为：实施例1所制备注射用丁苯酞（ 消旋丁苯酞 ）溶液，注射用甲钴胺溶液，注射丁苯酞+ 甲钴胺溶液，实施例2所制备注射用左旋丁苯酞溶液，注射左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液，模型对照为30% HP-β-CD溶液。

1.2 动物：SPF 级KM小鼠，雄性，18-22克，由河北医科大学实验动物中心提供；实验动物生产许可证号为SCXK（冀）2013-1-003。实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2011-0059。

1.3 数据处理：数据由SPSS11.5统计软件进行方差分析及组间检验。

2 小鼠全脑缺血试验。

2.1 动物分组及给药：昆明种小鼠100 只，随机分为10组，即模型对照组（30% HP-β-CD）、 丁苯酞 组（10 和5 mg·kg^-1）、左旋丁苯酞组（10 和5 mg·kg^-1）、丁苯酞 +甲钴胺组（ 丁苯酞10 和5 mg·kg^-1， 甲钴胺 0.2mg·kg^-1）。左旋丁苯酞 +甲钴胺组（ 左旋丁苯酞 10和5 mg·kg^-1， 甲钴胺 0.2mg·kg^-1）、甲钴胺组（0.2mg·kg^-1）、每组10只。

2.2 试验操作及指标观察：小鼠静脉注射给药后30 min，从动物双耳后颈部断头，观察小鼠断头喘气时间及喘气次数。

3、试验结果

小鼠断头后缺血缺氧导致脑死亡，试验通过药物对缺血缺氧耐受程度的改善作用来考察药物的抗脑缺血作用。如表2 所示。

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甲钴胺 0.2mg·kg^-1 静脉注射单独给药对小鼠全脑缺血无作用。

丁苯酞、左旋丁苯酞静脉注射单独给药10 mg·kg^-1 能显著延长小鼠断头后的喘气次数和喘气时间，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05）；丁苯酞、左旋丁苯酞10mg·kg^-1和甲钴胺0.2mg·kg^-1联合使用，采用注射给药的方式均可延长小鼠断头后的喘气时间，与模型组比较，具有非常显著性差异（p<0.01）。

丁苯酞静脉注射单独给药5mg·kg^-1对小鼠全脑缺血无作用，甲钴胺 0.2mg·kg^-1静脉注射单独给药对小鼠全脑缺血无作用。丁苯酞 5mg·kg^-1和甲钴胺0.2mg·kg^-1联合用药，采用注射给药的方式能延长小鼠断头后的喘气次数和喘气时间，模型组比较，具有显著性差异（p<0.05）。

左旋丁苯酞静脉注射单独给药5mg·kg^-1对小鼠全脑缺血无作用，甲钴胺 0.2mg·kg^-1 静脉注射单独给药对小鼠全脑缺血无作用。左旋丁苯酞 5mg·kg^-1和甲钴胺0.2mg·kg^-1联合用药，采用注射给药的方式能延长小鼠断头后的喘气次数和喘气时间，模型组比较，具有显著性差异（p<0.05）。

实施例3机实施例4的结果提示：丁苯酞或左旋丁苯酞与甲钴胺合用，当丁苯酞（左旋丁苯酞）与甲钴胺二者重量比为25~100:1，采用注射给药，具有协同作用，可以显著的增强 丁苯酞、左旋丁苯酞 对缺血缺氧小鼠的保护作用，使 丁苯酞、左旋丁苯酞 在更低剂量即可改善小鼠缺血缺氧作用，从而减少 丁苯酞、左旋丁苯酞 的用药量，降低其不良反应。

实施例5 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型试验

1 动物实验材料

1.1 药品 受试药物：实施例1所制备注射用丁苯酞（ 消旋丁苯酞 ）溶液，注射用甲钴胺溶液，注射丁苯酞+ 甲钴胺溶液，实施例2所制备注射用左旋丁苯酞溶液，注射左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液，模型对照为30% HP-β-CD溶液。

1.2 动物 SPF 级Wistar 大鼠160 只，雄性，270-300g，由河北医科大学实验动物中心提供；实验动物生产许可证号为SCXK（冀）2013-1-003。实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2011-0059。

1.3 数据处理 数据由SPSS11.5 统计软件进行方差分析及组间检验。

2 对大鼠局灶性脑缺血再灌注的保护作用

2.1 局灶性脑缺血再灌注模型制备：270～300 g 雄性Wistar 大鼠，禁食不禁水12 h，腹腔注射10％水合氯醛（350 mg·kg^-1）麻醉，背位固定，颈正中切口，分离颈总动脉，于颈总动脉近心端结扎，远心端夹动脉夹，在二者之间做一直径约2 mm 的“V”形切口，将尼龙线自切口处轻轻插入颈总动脉，松开动脉夹，经颈内动脉与颈外动脉分叉部进入颈内动脉，将尼龙线缓慢地向颈内动脉入颅内的方向推进，插入深度约18.5±0.5 mm 至微感阻力，使尼龙线头端通过大脑中动脉起始处，阻断中动脉入口造成缺血，缺血2 h 后拨出拴线进行24 h再灌。假手术组拴线插入深度约12.0±0.5 mm，余相同。

2.2 动物分组给药：Wistar 大鼠随机分为16组，每组10只，即假手术组（30% HP-β-CD）、模型对照组（30% HP-β-CD）、丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、左旋丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、甲钴胺组（0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1）、丁苯酞 +甲钴胺组（ 丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1），左旋丁苯酞 +甲钴胺组（ 左旋丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1），动物麻醉后进行手术，手术后15 min 单次静脉注射给药。

2.3 神经缺陷评分：按照Longa5 分制评分标准于再灌注后24 h 对大鼠进行行为学评分。

2.4 脑梗塞范围的测定：评分后大鼠断头处死，迅速将取出的脑组织置于-20℃冰箱，10 min 后置室温环境，切除嗅球、小脑和低位脑干后按间隔2 mm 冠状切四刀，切成5个大脑连续冠状粗切片。然后迅速将脑片置于3 ml 含1%TTC（2,3,5-一氯化三苯基四氮唑）的0.2 M 的K2HPO4 /K2HPO4（溶液比例为74:26）溶液中，37℃恒温、避光孵育30 min，期间每隔5 min 将脑片翻动一次。经TTC 染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。然后将脑片置10% 的甲醛中固定，将白色组织仔细挖下称重，梗塞组织重量以所占大脑半球的百分率来表示，以消除脑水肿的影响。

脑梗塞范围（%）＝手术侧半球梗塞部分的重量/（脑总重- 手术对侧半球的重量）×100%。

3 实验结果

3.1 神经缺陷评分：结果见表3。

。

模型组大鼠神经功能评分与假手术组有非常显著性差异(P<0.01)，说明此模型成功。

与模型组比较，丁苯酞、左旋丁苯酞 静脉注射单独给药10 mg·kg^-1 组、甲钴胺组（0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1） 静脉注射单独给药组对大鼠缺血再灌后的神经缺陷无明显改善影响。

丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺联合用药，在丁苯酞、左旋丁苯酞给药量10 mg·kg^-1剂量下，甲钴胺给药剂量分别为0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1，神经功能评分与模型组比较，具有非常显著性差异（p<0.01、p<0.05）。且与丁苯酞、左旋丁苯酞单独给药相比，在相同给药量下，丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺联合给药可以显著的增强丁苯酞 对大鼠缺血再灌后神经缺陷的改善，使丁苯酞 、左旋丁苯酞在更低剂量即可达到治疗作用，从而减少其临床用药量。

实施例5结果显示：丁苯酞或左旋丁苯酞与甲钴胺合用，丁苯酞（左旋丁苯酞）与甲钴胺二者重量比为25~100:1，采用注射给药，具有协同作用，可以显著的增强 丁苯酞、左旋丁苯酞 对大鼠缺血再灌后神经缺陷的改善作用 丁苯酞、左旋丁苯酞 在更低剂量即可改善小鼠缺血缺氧作用，从而减少 丁苯酞、左旋丁苯酞 的用药量。

3.2 脑梗塞范围的测定：结果见表5。

模型组大鼠脑梗死范围与假手术组有非常显著性差异(P<0.01)，说明此模型成功。

与模型组比较，丁苯酞、左旋丁苯酞 静脉注射单独给药10 mg·kg^-1 组均可改善大鼠缺血再灌后的脑梗死范围，与模型组比较，具有显著性差异（p<0.05）。

与模型组比较，甲钴胺组（0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1） 静脉注射单独给药组对大鼠缺血再灌后的脑梗死范围无明显改善影响。

丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺合用，在丁苯酞、左旋丁苯酞给药量10 mg·kg^-1 剂量下，甲钴胺给药剂量分别为0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1，脑梗死范围与模型组比较，具有非常显著性差异（p<0.01、p<0.05）。且与丁苯酞、左旋丁苯酞单独给药相比，在相同给药量下，丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺合用可以显著的增强丁苯酞 对大鼠缺血再灌后脑梗死范围的改善，使丁苯酞 、左旋丁苯酞在更低剂量即可达到治疗作用，从而减少其临床用药量。

实施例5结果显示：丁苯酞或左旋丁苯酞与甲钴胺合用，丁苯酞（左旋丁苯酞）与甲钴胺二者重量比为25~100:1，采用注射给药，具有协同作用，可以显著的增强 丁苯酞、左旋丁苯酞 对大鼠缺血再灌后脑梗死范围的改善，从而使丁苯酞、左旋丁苯酞 在更低剂量即可改善大鼠缺血再灌后脑梗死范围，从而减少 丁苯酞、左旋丁苯酞 的用药量。

实施例5结果显示：丁苯酞或左旋丁苯酞与甲钴胺的组合物，采用注射给药方式，可以用于治疗脑梗塞。

试验例6：脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能试验

1 动物实验材料

1.1 药品：受试药物为：实施例1所制备注射用丁苯酞（ 消旋丁苯酞 ）溶液，注射用甲钴胺溶液，注射丁苯酞+ 甲钴胺溶液，实施例2所制备注射用左旋丁苯酞溶液，注射左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液，模型对照为30% HP-β-CD溶液。

1.2 动物：SPF 级KM小鼠，雄性，18-22克，由河北医科大学实验动物中心提供；实验动物生产许可证号为SCXK（冀）2013-1-003。实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2011-0059。

1.3 实验器材：ZB-200疲劳转棒仪

1.4 数据处理：数据由SPSS11.5统计软件进行方差分析及组间检验。

2 脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能试验

2.1小鼠脑缺血再灌注损伤模型的制作：小鼠ip（腹腔注射）4％水合氯醛0.4 g·kg^-1麻醉，颈正中切开皮肤，钝性分离双侧颈总动脉，双侧颈总动脉下穿“4-0”手术丝线，悬吊至双侧颈总动脉血流完全阻断，1 h后抽出丝线使其血流再灌注。假手术组亦下穿丝线但不悬吊阻断血流，1 h后也抽出丝线。而后所有小鼠缝合皮肤，回笼饲养。

2.2动物分组及给药：上述模型小鼠160只，随机分为16组，即假手术组（30% HP-β-CD）、模型对照组（30% HP-β-CD）、丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、左旋丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、甲钴胺组（0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1）、丁苯酞 +甲钴胺组（ 丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1），左旋丁苯酞 +甲钴胺组（ 左旋丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1），每组10只。静脉注射给药3天。 假手术组同等条件下给予30%HP-β-CD溶液。

2.2 试验操作及指标观察：给药第1-2天，每天将小鼠置于疲劳转棒仪上适应5min（转速10 rpm）。小鼠末次给药后1 h（小时），再次将小鼠置于疲劳转棒仪上，测定小鼠5min内在棒上时间。

3 试验结果 。

本试验通过观察药物对小鼠肌肉协调性的影响，考察药物对脑缺血再灌注损伤小鼠的神经功能的保护作用。结果如表4所示：

。

与假手术组比较，模型组小鼠在棒上时间显著缩短（p<0.01），说明模型成功。

丁苯酞、左旋丁苯酞静脉注射单独给药10 mg·kg^-1能显著延长小鼠棒上时间，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05）。

与模型组比较，甲钴胺组（0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1） 静脉注射单独给药对小鼠肌肉协调性无增强作用。

丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺合用，在丁苯酞、左旋丁苯酞给药量10 mg·kg^-1 剂量下，甲钴胺给药剂量分别为0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1，脑梗死范围与模型组比较，具有非常显著性差异（p<0.01、p<0.05）。且与丁苯酞、左旋丁苯酞单独给药相比，在相同给药量下，丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺合用可以显著的增强增强丁苯酞对脑缺血再灌注损伤缺血小鼠的神经保护功能，使丁苯酞 、左旋丁苯酞在更低剂量即可达到治疗作用，从而减少其临床用药量。

实施例6结果显示：丁苯酞或左旋丁苯酞与甲钴胺合用，丁苯酞（左旋丁苯酞）与甲钴胺二者重量比为25~100:1，采用注射给药，具有协同作用，可以显著的增强 丁苯酞、左旋丁苯酞 对大脑缺血再灌注损伤缺血小鼠的神经保护功能，从而使丁苯酞、左旋丁苯酞 在更低剂量即可改善大鼠缺血再灌后脑梗死范围，从而减少 丁苯酞、左旋丁苯酞 的用药量。

实施例6结果显示：丁苯酞或左旋丁苯酞与甲钴胺的组合物，采用注射给药，可以用于治疗脑缺血引发的神经损伤。

试验例7 对小鼠脑缺血再灌注后学习和记忆行为的影响

1 动物实验材料

1.1 药品 受试药物：实施例1所制备注射用丁苯酞（ 消旋丁苯酞 ）溶液，注射用甲钴胺溶液，注射丁苯酞+ 甲钴胺溶液，实施例2所制备注射用左旋丁苯酞溶液，注射左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液，模型对照为30% HP-β-CD溶液。

1.2 动物 SPF 级KM小鼠，雄性，18-22克，由河北医科大学实验动物中心提供；实验动物生产许可证号为SCXK（冀）2013-1-003。实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2011-0059。

1.3 数据处理 数据由SPSS11.5统计软件进行方差分析及组间检验。

2 对小鼠脑缺血再灌注后学习和记忆行为的影响

2.1 小鼠脑缺血再灌注损伤模型的制作：小鼠ip（腹腔注射）4％水合氯醛0.4 g·kg^-1麻醉，颈正中切开皮肤，钝性分离双侧颈总动脉，双侧颈总动脉下穿“4-0”手术丝线，悬吊至双侧颈总动脉血流完全阻断，1 h后抽出丝线使其血流再灌注。假手术组亦下穿丝线但不悬吊阻断血流，1 h后也抽出丝线。而后所有小鼠缝合皮肤，回笼饲养。

2.2 分组及给药：上述脑缺血再灌注损伤小鼠120只，随机分为12组，即假手术组（30% HP-β-CD）、模型对照组（30% HP-β-CD）、丁苯酞组（5 mg·kg^-1、10 mg·kg^-1）、左旋丁苯酞组（5 mg·kg^-1）、甲钴胺组（0.2 mg·kg^-1）、丁苯酞 +甲钴胺组（ 丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1；丁苯酞5mg·kg^-1+甲钴胺0.2 mg·kg^-1），左旋丁苯酞 +甲钴胺组（ 左旋丁苯酞 5mg·kg^-1，甲钴胺0.2mg·kg^-1），每组10只。静脉注射给药3天。 假手术组同等条件下给予30% HP-β-CD溶液。

2.3 对小鼠跳台反应的影响： 小鼠给药后前2天，于给药后30 min进行跳台反应训练。训练时，将待测小鼠放入跳台仪中，适应环境5 min。然后向底部栅板通电，记录小鼠跳下高台的时间（潜伏时间）和5 min内小鼠由高台跳下受到电击的次数（重测期错误次数）。以小鼠学会遇电刺激时可以正确逃避至平台上为指标。末次给药1 h后进行正式测验，记录小鼠潜伏时间和5 min内重测期错误次数。

3 实验结果：结果如表5所示

。

模型组小鼠的各项指标均与假手术组有极显著性差异(P<0.01)，说明此模型成功。

与模型组比较，丁苯酞、左旋丁苯酞 静脉注射单独给药5 mg·kg^-1 对小鼠缺血再灌后的跳台错误次数、潜伏期等无明显改善影响。

甲钴胺0.2mg·kg^-1静脉注射单独给药组对小鼠缺血再灌后的跳台错误次数、潜伏期无明显改善影响。

在丁苯酞、左旋丁苯酞给药量5 mg·kg^-1 剂量下，甲钴胺给药剂量为0.20 mg·kg^-1，小鼠缺血再灌后的跳台错误次数明显减少、潜伏期显著延长，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05），与丁苯酞、左旋丁苯酞单独给药相比，在相同给药量下，丁苯酞、左旋丁苯酞和甲钴胺合用，可以显著的增强丁苯酞、左旋丁苯酞 对小鼠缺血再灌后学习和记忆行为的改善，使丁苯酞 、左旋丁苯酞在更低剂量即可达到治疗作用，从而减少其临床用药量，降低其不良反应。提示甲钴胺与 丁苯酞、左旋丁苯酞合用，采用注射给药方式，具有协同作用，可以显著增强丁苯酞 、左旋丁苯酞对小鼠缺血再灌后学习和记忆行为的改善，从而降低丁苯酞、左旋丁苯酞 的起效剂量，减少其临床用药量。

丁苯酞、左旋丁苯酞静脉注射单独给药10 mg·kg^-1组小鼠缺血再灌后的跳台错误次数明显减少、潜伏期显著延长，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05），在丁苯酞给药量10 mg·kg^-1 剂量下，甲钴胺给药剂量分别为（0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1），联合使用，小鼠缺血再灌后的跳台错误次数明显减少、潜伏期显著延长，与模型组比较具有非常显著性差异（p<0.01），提示甲钴胺与丁苯酞合用，采用注射给药方式，具有协同作用，可以改善丁苯酞对脑缺血再灌注损伤缺血小鼠的学习行为及记忆行为，从而降低丁苯酞的起效剂量，减少其临床用药量。

实施例7结果显示：丁苯酞、左旋丁苯酞与甲钴胺合用，采用注射给药方式，在治疗痴呆，尤其血管性痴呆和阿尔茨海默症引起的神经运动功能障碍和受损记忆功能障碍时具有协同作用，可以改善丁苯酞对脑缺血再灌注损伤缺血小鼠的学习行为及记忆行为，从而降低丁苯酞的起效剂量，减少其临床用药量。

试验例8 对东莨菪碱致痴呆小鼠学习和记忆行为的影响

1 动物实验材料

1.1 药品 受试药物：实施例1所制备注射用丁苯酞（ 消旋丁苯酞 ）溶液，注射用甲钴胺溶液，注射丁苯酞+ 甲钴胺溶液，实施例2所制备注射用左旋丁苯酞溶液，注射左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液，模型对照为30% HP-β-CD溶液。

1.2 动物 SPF 级KM小鼠，雄性，18-22克，由河北医科大学实验动物中心提供；实验动物生产许可证号为SCXK（冀）2013-1-003。实验动物使用许可证号：SYXK（冀）2011-0059。

1.3 数据处理 数据由SPSS11.5统计软件进行方差分析及组间检验。

2 对东莨菪碱致痴呆小鼠学习和记忆行为的影响

2.1 分组及给药：小鼠120只，随机分为12组，即假手术组（30% HP-β-CD）、模型对照组（30% HP-β-CD）、丁苯酞组（5 mg·kg^-1、10 mg·kg^-1）、左旋丁苯酞组（5 mg·kg^-1）、甲钴胺组（0.2 mg·kg^-1）、丁苯酞 +甲钴胺组（ 丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.125、0.2和0.25mg·kg^-1；丁苯酞5mg·kg^-1+甲钴胺0.2 mg·kg^-1），左旋丁苯酞 +甲钴胺组（ 左旋丁苯酞 5mg·kg^-1，甲钴胺0.2mg·kg^-1），每组10只。静脉注射给药3天。 假手术组同等条件下给予30% HP-β-CD溶液。，每组10只。小鼠分别静脉给予上述药物，连续给药3天。

2.2 对小鼠跳台反应的影响： 小鼠给药后前2天每天1次进行跳台反应训练。训练时，将待测小鼠放入跳台仪中，适应环境5 min。然后向底部栅板通电，记录小鼠跳下高台的时间（潜伏时间）和5 min内小鼠由高台跳下受到电击的次数（重测期错误次数）。以小鼠学会遇电刺激时可以正确逃避至平台上为指标。末次给药30 min后除空白对照组腹腔注射0.9%生理盐水注射液外，其余各组分别注射5 mg·kg^-1的东莨菪碱注射液，30 min后进行正式测验，记录小鼠潜伏时间和5 min内重测期错误次数。

2.3 对东莨菪碱致痴呆小鼠脑匀浆SOD活力、MDA含量的影响： 上述小鼠完成跳台反应试验后处死，取脑，以10倍体积生理盐水制成匀浆，硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA的含量，黄嘌呤氧化法测定脑组织中SOD酶活力单位，考马斯亮蓝测定蛋白质含量。

3 实验结果

3.1对东莨菪碱致痴呆小鼠学习和记忆行为的影响：结果如表6所示：

。

东莨菪碱模型组与空白对照组相比，小鼠逃避潜伏期明显缩短，错误次数明显增加(P<0.01)，说明小鼠记忆障碍模型成功建立。

与模型组比较，甲钴胺0.2 mg·kg^-1单独给药对东莨菪碱致痴呆小鼠学习和记忆行为无明显影响。

与模型组比较，丁苯酞、左旋丁苯酞 静脉注射单独给药5 mg·kg^-1 对东莨菪碱致痴呆小鼠的错误次数明显减少，潜伏时间无明显影响。

在丁苯酞、左旋丁苯酞给药量5 mg·kg^-1 剂量下，甲钴胺给药剂量为0.20 mg·kg^-1，合用，对东莨菪碱致痴呆小鼠的跳台错误次数明显减少、潜伏期显著延长，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05），与丁苯酞、左旋丁苯酞单独给药相比，在相同给药量下，丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺合用，采用静脉注射给药方式，可以显著的增强丁苯酞、左旋丁苯酞对东莨菪碱致痴呆小鼠学习和记忆行为的改善，从而降低丁苯酞、左旋丁苯酞 的起效剂量，减少其临床用药量。

丁苯酞、左旋丁苯酞静脉注射单独给药10 mg·kg^-1组东莨菪碱致痴呆小鼠的跳台错误次数明显减少、潜伏期显著延长，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05），在丁苯酞给药量10 mg·kg^-1 剂量下，甲钴胺给药剂量分别为（0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg^-1），联合使用，东莨菪碱致痴呆小鼠的跳台错误次数明显减少、潜伏期显著延长，与模型组比较具有非常显著性差异（p<0.01），提示甲钴胺与丁苯酞合用，采用注射给药方式，具有协同作用，可以改善丁苯酞对东莨菪碱致痴呆小鼠的学习行为及记忆行为，从而降低丁苯酞的起效剂量，减少其临床用药量。

3.2 对东莨菪碱致痴呆小鼠脑匀浆SOD活力、MDA含量的影响：结果如表7所示：

。

东莨菪碱模型组与空白对照组相比，脑内MDA含量明显升高及SOD活力明显降低(P<0.01)，说明小鼠记忆障碍模型成功建立。

与模型组比较，丁苯酞5 mg·kg-1、左旋丁苯酞5 mg·kg-1、甲钴胺0.2mg·kg-1单独给药对对东莨菪碱致痴呆小鼠脑内MDA含量及SOD活力无明显影响。

在丁苯酞、左旋丁苯酞给药量5 mg·kg-1 剂量下，甲钴胺给药剂量为0.2mg·kg-1，联合用药，对东莨菪碱致痴呆小鼠脑组织MDA含量及SOD活力具有显著改善作用，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05），与丁苯酞、左旋丁苯酞单独给药相比，在相同给药量下，丁苯酞、左旋丁苯酞 和甲钴胺联合给药可以显著的增强丁苯酞、左旋丁苯酞对东莨菪碱致痴呆小鼠学习和记忆行为的改善，从而降低丁苯酞、左旋丁苯酞 的起效剂量，减少其临床用药量

丁苯酞、左旋丁苯酞静脉注射单独给药10 mg·kg-1组东莨菪碱致痴呆小鼠脑组织MDA含量及SOD活力具有显著改善作用，与模型组比较具有显著性差异（p<0.05），在丁苯酞给药量10 mg·kg-1 剂量下，甲钴胺给药剂量分别为（0.1、0.125、0.2、0.25 mg·kg-1），联合使用，东莨菪碱致痴呆小鼠脑组织MDA含量及SOD活力具有显著改善作用，与模型组比较具有非常显著性差异（p<0.01），提示甲钴胺与丁苯酞联合给药具有协同作用，可以改善丁苯酞对东莨菪碱致痴呆小鼠的学习行为及记忆行为，从而降低丁苯酞的起效剂量，减少其临床用药量。

实施例8结果显示：丁苯酞、左旋丁苯酞与甲钴胺合用，采用注射给药方式，在治疗痴呆，尤其血管性痴呆和阿尔茨海默症引起的神经运动功能障碍和受损记忆功能障碍时具有协同作用，可以改善丁苯酞对脑缺血再灌注损伤缺血小鼠的学习行为及记忆行为，从而降低丁苯酞的起效剂量，减少其临床用药量。

试验例9 新西兰兔血管刺激性试验

1动物实验材料

1.1 药品 受试药物：实施例1所制备注射用丁苯酞（ 消旋丁苯酞 ）溶液，注射用甲钴胺溶液，注射丁苯酞+ 甲钴胺溶液，实施例2所制备注射用左旋丁苯酞溶液，注射左旋丁苯酞+ 甲钴胺溶液，模型对照为30% HP-β-CD溶液。上述实施例需按使用剂量进行稀释，制备成适合的浓度。

1.2动物 新西兰兔，普通级，体重2.0～3.0kg。

1.3分组及给药：上述新西兰兔135只，随机分为9组，即溶剂组（0.9%生理盐水）、对照组（30% HP-β-CD溶液）、丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、左旋丁苯酞组（10 mg·kg^-1）、甲钴胺组（0.2 mg·kg^-1）、丁苯酞 +甲钴胺组（ 丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.4和2.0mg·kg^-1），左旋丁苯酞 +甲钴胺组（左旋丁苯酞 10mg·kg^-1，甲钴胺0.1、0.4和2.0mg·kg^-1）每组15只。

2方法：

各组新西兰兔分别耳缘静脉注射给予上述药物，5ml/kg，连续给药7天。观察注射过程中动物反应情况、 注射部位的刺激程度、进行注射部位病理组织学检查，综合比较丁苯酞、左旋丁苯酞及各种丁苯酞甲钴胺复方对兔子的毒性情况。

3试验结果

3.1动物反应及注射部位的刺激程度：

。

3.2病理组织学检查情况：丁苯酞、左旋丁苯酞单独用药、甲钴胺单独用药、丁苯酞、左旋丁苯酞与甲钴胺复方组注射部位近端和远端组织表皮完整，未见皮下及皮内出血，无组织水肿；取材组织内的血管，内皮完整，无管壁增厚，血管内未见血栓形成。

以上试验结果表明：本发明提供的组合物未见任何血管刺激性反应。

以上实施例是本发明的优选实施方式，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种药物组合物，包括丁苯酞和甲钴胺。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中，丁苯酞选自其左旋丁苯酞、右旋丁苯酞、消旋丁苯酞及左旋丁苯酞与右旋丁苯酞的任意比例的混合物，优选为消旋丁苯酞和左旋丁苯酞。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，丁苯酞和甲钴胺的重量比为1000:1～1:1000；优选重量比为200:1～1:200；再优选重量比为10～200:1；更优选重量比为25～125:1；进一步优选的重量比为25～100:1。

4.如权利要求1所属的药物组合物，其特征在于，丁苯酞和甲钴胺的重量比25:1、40:1、50:1、80:1、100:1。

5.如权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述的丁苯酞的重量以C₁₂H₁₄O₂计，所述的甲钴胺的重量以C₆₃H₉₁CoN₁₃O₁₄P计。

6.权利要求1所述的药物组合物在制备治疗缺血性脑血管病或者脑梗塞药物中的应用。

7.权利要求1所述的药物组合物在制备用于治疗痴呆症药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述痴呆症为血管性痴呆和阿尔茨海默症。