CN107576624B - 一种唾液中皮质醇的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种唾液中皮质醇的检测方法，包括样品的处理、样品的准备、浓缩、稀释、显色和测定步骤，测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤。本发明通过使用纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜进行过滤处理，利用唾液中的唾液粘蛋白对羟基磷灰石具有高度的亲和力，使液粘蛋白充分粘附在复合微滤膜上，以充分去除唾液中的唾液粘蛋白，避免唾液粘蛋白对唾液皮质醇检测结果的影响，操作简单，检测结果精确，能够提高对人体疲劳状态把控，并根据疲劳状态及时做出应对措施。

Description

一种唾液中皮质醇的检测方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种唾液中皮质醇的检测方法。

背景技术

疲劳,是劳动过程中劳动者由于生理和心理状态的变化，产生某一个或某些器官乃至整个机体力量的自然衰竭状态。疲劳是一种生理现象，也是一种心理现象，从本质上讲是机体的一种正常生理保护机制。从生物医学理论上讲，劳动是能量消耗的过程，这个过程持续到一定程度，中枢神经系统将产生抑制作用，继中枢神经系统疲劳后，就是反射运动神经系统的疲劳，反映出动作的灵敏性降低，作业效率下降。疲劳发生的原因较多，由过多运动、长时间连续工作、精神紧张、睡眠剥夺、视觉疲劳及其它疾病因素导致。疲劳发生后，人体在生理、生化和代谢方面都存在一些共性改变，尤其是在部队军事训练中，疲劳不仅会影响到训练成绩的提高，过度的疲劳还会损害机体的肌肉系统、心血管系统、神经系统、内分泌系统等多种系统，导致食欲降低、体重下降、睡眠障碍等症状。在日常训练中，持续长时间大强度的训练使得机体难以承受，最终对机体造成严重损伤。

皮质醇作为应激激素，是疲劳反应的重要指标，血液里的皮质醇约80％与皮质类固醇结合蛋白结合，其余呈游离状态。只有游离的皮质醇才具有生物活性。由于唾液中不含结合蛋白，因此唾液皮质醇能很好地反映血中具有生物活性的游离皮质醇。唾液皮质醇和血液皮质醇具有良好的相关性，且唾液采样不像采血那样给人带来心理压力，因此已广泛应用于疲劳、精神、心理研究。

唾液中除了唾液皮质醇，还含有各种有机物与无机物，如唾液粘蛋白等物质，而目前在检测唾液皮质醇前没有对唾液粘蛋白进行处理，或者通过脱脂棉简单的吸附唾液粘蛋白，唾液粘蛋白的去除效果差，影响唾液皮质醇检测结果的准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种唾液中皮质醇的检测方法，使用纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜进行过滤处理，以充分去除唾液中的唾液粘蛋白，提高唾液皮质醇检测结果的准确性。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)样品的处理：测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；

2)样品的准备：取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；

3)浓缩：用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；

4)稀释：将3)中得到的浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；

5)显色：先用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和硫代硫酸钠的混合溶液；

6)测定：以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度。

进一步，步骤3)、步骤4)、步骤5)中所述的振荡均采用超声波振荡，超声波功率为80W，震荡频率为40KHz。

进一步，步骤1)中所述唾液离心的条件为：温度5℃～10℃,转速2200r/min～2500r/min,离心时间10min～15min。

进一步，步骤6)所述的测定过程中，每隔3min测试一次，连续测试三次，取平均值。

进一步，步骤6)中测定样品的检测波波长均为420nm。

进一步，1)中所述的经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜的制备方法如下：

步骤一，称取聚偏氟乙烯粉末，于60℃下搅拌溶解在N,N-二甲基乙酰胺溶液中，得到聚偏氟乙烯溶液，再取聚偏氟乙烯1％～2％重量的氧化石墨烯加入N,N-二甲基乙酰胺溶液中，超声波分散10h，得到氧化石墨烯溶液，然后将氧化石墨烯溶液加入聚偏氟乙烯溶液，超声波分散10h，得到铸膜液；

步骤二，取步骤一中得到的铸膜液于真空条件下脱气1h，然后使用刮膜器在无纺布上平铺200um厚的铸膜液，于空气中停留20s，再将无纺布浸入20℃的去离子水中凝固，然后用去离子水反复冲洗、干燥，得到氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜；

步骤三，取纳米羟基磷灰石加入容器中，加入30倍体积的二甲基甲酰胺分散均匀，再加入纳米羟基磷灰石1％重量的浓硫酸，充分搅拌，得到纳米羟基磷灰石分散液；

步骤四，取步骤二得到的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜浸入步骤三得到的纳米羟基磷灰石分散液中，加入纳米羟基磷灰石1％～2％重量的TPO-L 2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯，用紫外光辐照5min，同时用超声波充分振荡，得到经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜，然后用去离子水反复浸泡洗涤复合微滤膜，真空干燥即可。

进一步，步骤三中所述的纳米羟基磷灰石在加入二甲基甲酰胺前，先经过改性处理，改性方法如下：按8:2:0.15的重量比将丙烯酸、对甲苯磺酸和对苯二酚分门加入烧瓶中混合均匀，得到改性混合液，然后取纳米羟基磷灰石加入5倍体积的改性混合液，超声波分散15min，再加热冷凝回流1h后抽滤除去滤液，用去离子水反复冲洗滤渣，烘干即得到改性纳米羟基磷灰石。

进一步，步骤三中所述的分散温度为36℃，分散转速为1000r/min～1500r/min。

进一步，步骤四中所述真空干燥的条件为：温度35℃～40℃，真空度0.09MPa～0.1MPa。

本发明的有益效果：本发明通过使用纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜进行过滤处理，利用唾液中的唾液粘蛋白对羟基磷灰石具有高度的亲和力，使液粘蛋白充分粘附在复合微滤膜上，以充分去除唾液中的唾液粘蛋白，避免唾液粘蛋白对唾液皮质醇检测结果的影响，操作简单，检测结果精确，能够提高对人体疲劳状态把控，并根据疲劳状态及时做出应对措施。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明进行详细说明：

唾液中皮质醇的检测实施例一

随机选择年龄的30～35岁生活规律，身体健康的体力劳动者、办公室文员、驾驶员、教师和医生五个不同群体的自愿者，每个群体选择10人，分别于同一天的8:00、12:00、16:00、20:00、24:00五个时间段采集唾液样品，并将样品冷藏于3℃～5℃的环境中；测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后于5℃～10℃,2200r/min～2500r/min的转速下离心10min～15min，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，用功率80W，频率40KHz的超声波充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；将浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，用功率80W，频率40KHz的超声波充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；然后用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，用功率80W，频率40KHz的超声波充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和硫代硫酸钠的混合溶液；以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度，检测波波长均为420nm，每隔3min测试一次，连续测试三次，取平均值。

采用以上样品吸光度的测定方法，测定标准品不同浓度下吸光度，以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标作标准曲线图，然后根据唾液样品中唾液皮质醇的吸光度分别从标准曲线图上查对出该吸光度下唾液皮质醇的浓度，每个群体的皮质醇的浓度取平均值，测定结果如下表所示：

唾液中皮质醇的检测实施例二

随机选择年龄的5～10岁、15～20岁、25～30岁、35～40岁、45～50岁生活规律，身体健康五个不同年龄段的自愿者，每个群体选择10人，分别于同一天的8:00、12:00、16:00、20:00、24:00五个时间段采集唾液样品，并将样品冷藏于3℃～5℃的环境中；测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后于5℃～10℃,2200r/min～2500r/min的转速转速下离心10min～15min，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，用功率80W，频率40KHz的超声波充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；将浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，用功率80W，频率40KHz的超声波充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；然后用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，用功率80W，频率40KHz的超声波充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和硫代硫酸钠的混合溶液；以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度，检测波波长均为420nm，每隔3min测试一次，连续测试三次，取平均值。

采用以上样品吸光度的测定方法，测定标准品不同浓度下吸光度，以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标作标准曲线图，然后根据唾液样品中唾液皮质醇的吸光度分别从标准曲线图上查对出该吸光度下唾液皮质醇的浓度，每个群体的皮质醇的浓度取平均值，测定结果如下表所示：

由唾液中皮质醇的检测实施例一和实施例二中的数据分析可以得知，五个不同群体和5个不同年龄段的自愿者唾液中，唾液皮质醇均在清晨达到最高值，在中午和深夜达到最低值，因此，唾液中唾液皮质醇的浓度可以作为疲劳程度判断的指标。

纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜的制备实施例三

称取聚偏氟乙烯粉末，于60℃下搅拌溶解在N,N-二甲基乙酰胺溶液中，得到聚偏氟乙烯溶液，再取聚偏氟乙烯1％重量的氧化石墨烯加入N,N-二甲基乙酰胺溶液中，超声波分散10h，得到氧化石墨烯溶液，然后将氧化石墨烯溶液加入聚偏氟乙烯溶液，超声波分散10h，得到铸膜液；将铸膜液于真空条件下脱气1h，然后使用刮膜器在无纺布上平铺200um厚的铸膜液，于空气中停留20s，再将无纺布浸入20℃的去离子水中凝固，然后用去离子水反复冲洗、干燥，得到氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜；按8:2:0.15的重量比将丙烯酸、对甲苯磺酸和对苯二酚分门加入烧瓶中混合均匀，得到改性混合液，然后取纳米羟基磷灰石加入5倍体积的改性混合液，超声波分散15min，再加热冷凝回流1h后抽滤除去滤液，用去离子水反复冲洗滤渣，得到改性纳米羟基磷灰石，取改性纳米羟基磷灰石加入容器中，加入30倍体积的二甲基甲酰胺，于36℃，1000r/min～1500r/min的转速下分散均匀，再加入纳米羟基磷灰石1％重量的浓硫酸，充分搅拌，得到纳米羟基磷灰石分散液；将得到的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜浸入纳米羟基磷灰石分散液中，加入纳米羟基磷灰石1％重量的TPO-L 2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯，用紫外光辐照5min，同时用超声波充分振荡，得到经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜，然后用去离子水反复浸泡洗涤复合微滤膜，于35℃～40℃，0.09MPa～0.1MPa的条件下真空干燥即可。

纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜的制备实施例四

称取聚偏氟乙烯粉末，于60℃下搅拌溶解在N,N-二甲基乙酰胺溶液中，得到聚偏氟乙烯溶液，再取聚偏氟乙烯2％重量的氧化石墨烯加入N,N-二甲基乙酰胺溶液中，超声波分散10h，得到氧化石墨烯溶液，然后将氧化石墨烯溶液加入聚偏氟乙烯溶液，超声波分散10h，得到铸膜液；将铸膜液于真空条件下脱气1h，然后使用刮膜器在无纺布上平铺200um厚的铸膜液，于空气中停留20s，再将无纺布浸入20℃的去离子水中凝固，然后用去离子水反复冲洗、干燥，得到氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜；按8:2:0.15的重量比将丙烯酸、对甲苯磺酸和对苯二酚分门加入烧瓶中混合均匀，得到改性混合液，然后取纳米羟基磷灰石加入5倍体积的改性混合液，超声波分散15min，再加热冷凝回流1h后抽滤除去滤液，用去离子水反复冲洗滤渣，得到改性纳米羟基磷灰石，取改性纳米羟基磷灰石加入容器中，加入30倍体积的二甲基甲酰胺，于36℃，1000r/min～1500r/min的转速下分散均匀，再加入纳米羟基磷灰石1％重量的浓硫酸，充分搅拌，得到纳米羟基磷灰石分散液；将得到的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜浸入纳米羟基磷灰石分散液中，加入纳米羟基磷灰石2％重量的TPO-L 2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯，用紫外光辐照5min，同时用超声波充分振荡，得到经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜，然后用去离子水反复浸泡洗涤复合微滤膜，于35℃～40℃，0.09MPa～0.1MPa的条件下真空干燥即可。

纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜的制备实施例五

称取聚偏氟乙烯粉末，于60℃下搅拌溶解在N,N-二甲基乙酰胺溶液中，得到聚偏氟乙烯溶液，再取聚偏氟乙烯1.5％重量的氧化石墨烯加入N,N-二甲基乙酰胺溶液中，超声波分散10h，得到氧化石墨烯溶液，然后将氧化石墨烯溶液加入聚偏氟乙烯溶液，超声波分散10h，得到铸膜液；将铸膜液于真空条件下脱气1h，然后使用刮膜器在无纺布上平铺200um厚的铸膜液，于空气中停留20s，再将无纺布浸入20℃的去离子水中凝固，然后用去离子水反复冲洗、干燥，得到氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜；按8:2:0.15的重量比将丙烯酸、对甲苯磺酸和对苯二酚分门加入烧瓶中混合均匀，得到改性混合液，然后取纳米羟基磷灰石加入5倍体积的改性混合液，超声波分散15min，再加热冷凝回流1h后抽滤除去滤液，用去离子水反复冲洗滤渣，得到改性纳米羟基磷灰石，取改性纳米羟基磷灰石加入容器中，加入30倍体积的二甲基甲酰胺，于36℃，1000r/min～1500r/min的转速下分散均匀，再加入纳米羟基磷灰石1％重量的浓硫酸，充分搅拌，得到纳米羟基磷灰石分散液；将得到的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜浸入纳米羟基磷灰石分散液中，加入纳米羟基磷灰石1.5％重量的TPO-L 2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯，用紫外光辐照5min，同时用超声波充分振荡，得到经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜，然后用去离子水反复浸泡洗涤复合微滤膜，于35℃～40℃，0.09MPa～0.1MPa的条件下真空干燥即可。

取唾液粘蛋白标准品加入烧瓶中，用去离子水稀释成20ng/ml的唾液粘蛋白稀释液，于5℃～10℃,2200r/min～2500r/min的转速转速下离心10min～15min，取上清液，然后分别用用实施例三至实施例五制备得到的纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜进行过滤，得到的滤液即待测样品，将待测样品以生理盐水作参比通过分光光度计分别测定样品的吸光度。然后根据唾液粘蛋白标准品以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标作标准曲线图的标准曲线图查对出该吸光度下唾液粘蛋白的浓度，测定计算结果如下表：

由以上数据分析可以得知，经本发明制备的纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜过滤后的唾液中唾液粘蛋白的浓度均低于0.05ng/ml，过滤后的唾液粘蛋白含量基本不会影响唾液皮质醇的检测结果。

本发明通过使用纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜进行过滤处理，利用唾液中的唾液粘蛋白对羟基磷灰石具有高度的亲和力，使液粘蛋白充分粘附在复合微滤膜上，以充分去除唾液中的唾液粘蛋白，避免唾液粘蛋白对唾液皮质醇检测结果的影响，操作简单，检测结果精确，能够提高对人体疲劳状态把控，并根据疲劳状态及时做出应对措施。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (9)

1.一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)样品的处理：测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；

2)样品的准备：取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；

3)浓缩：用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；

4)稀释：将3)中得到的浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；

5)显色：先用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和硫代硫酸钠的混合溶液；

6)测定：以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度。

2.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤3)、步骤4)、步骤5)中所述的振荡均采用超声波振荡，超声波功率为80W，震荡频率为40KHz。

3.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述唾液离心的条件为：温度5℃～10℃,转速2200r/min～2500r/min,离心时间10min～15min。

4.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤6)所述的测定过程中，每隔3min测试一次，连续测试三次，取平均值。

5.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤6)中测定样品的检测波波长均为420nm。

6.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：1)中所述的经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜的制备方法如下：

步骤一，称取聚偏氟乙烯粉末，于60℃下搅拌溶解在N,N-二甲基乙酰胺溶液中，得到聚偏氟乙烯溶液，再取聚偏氟乙烯1％～2％重量的氧化石墨烯加入N,N-二甲基乙酰胺溶液中，超声波分散10h，得到氧化石墨烯溶液，然后将氧化石墨烯溶液加入聚偏氟乙烯溶液，超声波分散10h，得到铸膜液；

步骤二，取步骤一中得到的铸膜液于真空条件下脱气1h，然后使用刮膜器在无纺布上平铺200um厚的铸膜液，于空气中停留20s，再将无纺布浸入20℃的去离子水中凝固，然后用去离子水反复冲洗、干燥，得到氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜；

步骤三，取纳米羟基磷灰石加入容器中，加入30倍体积的二甲基甲酰胺分散均匀，再加入纳米羟基磷灰石1％重量的浓硫酸，充分搅拌，得到纳米羟基磷灰石分散液；

步骤四，取步骤二得到的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜浸入步骤三得到的纳米羟基磷灰石分散液中，加入纳米羟基磷灰石1％～2％重量的TPO-L 2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯，用紫外光辐照5min，同时用超声波充分振荡，得到经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜，然后用去离子水反复浸泡洗涤复合微滤膜，真空干燥即可。

7.根据权利要求6所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤三中所述的纳米羟基磷灰石在加入二甲基甲酰胺前，先经过改性处理，改性方法如下：按8:2:0.15的重量比将丙烯酸、对甲苯磺酸和对苯二酚分门加入烧瓶中混合均匀，得到改性混合液，然后取纳米羟基磷灰石加入5倍体积的改性混合液，超声波分散15min，再加热冷凝回流1h后抽滤除去滤液，用去离子水反复冲洗滤渣，烘干即得到改性纳米羟基磷灰石。

8.根据权利要求6所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤三中所述的分散温度为36℃，分散转速为1000r/min～1500r/min。

9.根据权利要求6所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤四中所述真空干燥的条件为：温度35℃～40℃，真空度0.09MPa～0.1MPa。