CN103232987A - 检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，该制备方法通过聚乙二醇或聚乙烯亚胺等聚合物作为手臂分子多位点共价结合乙醇氧化酶，进一步通过聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚组氨酸或壳聚糖等通过电荷间物理作用固定乙醇氧化酶的多个亚基，再吸附上靛蓝作为显色底物的原理而制备。检测时，样品中的乙醇被乙醇氧化酶氧化后产生过氧化氢，过氧化氢使靛蓝褪色，靛蓝的褪色程度与标准色卡对照可以方便计算出样品中的乙醇浓度。该制备方法灵敏度高、操作简便、价格低廉并且可以多次重复使用，可方便地用于执法部门查处酒后驾车，为执法过程提供可靠的证据。

Description

检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法
技术领域
本发明属于酒精浓度检测技术领域，特别涉及一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法。
背景技术
许多行业都需要对乙醇含量进行定性或定量检测分析，比如各国对机动车驾驶员血液酒精含量均有严格要求。在我国，驾驶员血液酒精浓度达到0.2mg/ml即为酒后驾车，当酒精浓度达到0.8mg/ml则视为醉酒驾车。近些年，酒后驾车酿惨祸的悲剧屡见不鲜。尽管交通执法部门已经加大了执法力度与惩处力度，但始终有驾驶员铤而走险；此外，也有部分驾驶员因其不能准确判断出自身的酒精含量而违法驾驶，这给其他道路交通参与者带来极大的安全隐患。因此，研制一种能便捷、准确检测体内酒精含量的手段极具现实意义。
通过直接对人体血液酒精浓度进行抽样分析检测能准确得到酒精浓度值，但该检测方法耗时长、费用高，且需在实验室用专业仪器进行分析测试，不具有便捷性、廉价性。目前，交警部门执法检查时常用呼气酒精检测仪来检测推算出血液酒精浓度值，因为人体内血液酒精浓度(mg/ml)＝呼出气体中酒精浓度(mg/ml)×2200。呼气式检测方法检测时间短，具有便携性，但由于呼出气体中酒精浓度远低于血液酒精浓度，导致其误差大，准确性不好。据实验及文献报道证明：唾液酒精浓度(mg/ml)＝血液酒精浓度(mg/ml)×1.07，且体重、性别和年龄等因素对唾液/血液中酒精浓度的对应关系无显著影响，这两种体液内酒精浓度值具有良好的一致性。因此，在人体酒精浓度检测时，除血检和呼气式检测以外，还可以考虑对唾液中酒精浓度进行检测，换算出血液酒精浓度值。
目前，已有几种酶膜可检测唾液中酒精浓度。如：申请号为200410041987的专利申请，用酚兰作为显色剂，将滤纸用乙醇脱氢酶与辅酶NAD+配制的混合酶液浸透后，使乙醇脱氢酶及辅酶NAD+物理吸附在滤纸上。检测时将滤纸与唾液接触，唾液中的乙醇与滤纸上吸附的乙醇脱氢酶及辅酶NAD+作用，生成乙醛和酶氧化底物，酶氧化底物与酚兰指示剂作用生成蓝色或红色的产物，根据颜色变化可推算酒精浓度；申请号为200510013235的专利申请，利用四甲基联苯胺作为显色剂，利用被滤纸吸附的乙醇氧化酶氧化乙醇生成过氧化氢使显色剂褪色，利用褪色程度判断样品酒精含量。
上述的便携式检测体系中使用了乙醇脱氢酶和乙醇氧化酶，制备原理均是利用物理吸附将酶固定在滤纸上。这种制备方法操作简单，但由于滤纸质密，酶只是物理吸附在滤纸表面，导致其热稳定性以及酸碱稳定性差，使得检测误差大，检测结果不准确。同时由于滤纸表面质密，比表面积较小，吸附的酶量少且易脱落，使其检测灵敏度低，也使其检测误差大。并且，乙醇氧化酶由八个亚基组成，在固定化和使用过程中酶的任一亚基脱落，均会造成酶活性不同程度的丧失，增大检测误差；而将八个亚基均固定在基底载体上将破坏酶的空间结构、增加酶对底物作用时的空间位阻，从而影响酶的活性，又降低其检测灵敏度和精确度。因此，目前的固定化乙醇氧化酶检测体系均未能实现准确、灵敏、多次重复使用等要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，该法制备出的固定化酶纳米纤维膜能简单、便捷的检测出唾液中的酒精浓度，其检测灵敏度高，检测结果准确，循环使用次数多。
本发明实现其发明目的所采用的第一种技术方案是，一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、用静电纺丝法制备出表面带氨基或羟基的纳米纤维膜；
B、将A步的纳米纤维膜接枝端羧基聚乙二醇，得到接枝有聚合物的纳米纤维膜；
C、将B步的接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中6-8小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入阳离子聚合物溶液中1-3小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中3-5分钟，取出、晾干，即得。
本发明实现其发明目的所采用的第二种技术方案是，2、一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、用静电纺丝法制备出表面带酸酐基或醛基的纳米纤维膜；
B、将A步的纳米纤维膜接枝聚乙烯亚胺、得到接枝有聚合物的纳米纤维膜；
C、将B步得到的接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入戊二醛溶液中1-2小时、取出，得到表面带有醛基的纳米纤维膜；再将表面带有醛基的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液6-8小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入阳离子聚合物溶液1-3小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中3-5分钟，取出、晾干，即得。
本发明与现有技术相比，本发明的有益效果是：
一、采用纳米纤维膜用作固定化酶的载体，相比于滤纸具有更高的孔隙率和更大的孔径，比表面积更高，能更高效、更大量的固定乙醇氧化酶，从而明显提高其检测灵敏度和精度。
二、通过纳米纤维膜上的氨基或羟基与端羧基聚乙二醇上的羧基，或者通过纳米纤维膜上的酸酐基、醛基与聚乙烯亚胺的氨基共价结合，将聚合物共价接枝在纳米纤维膜表面。再通过端羧基聚乙二醇上的端羧基或者聚乙烯亚胺上氨基转化成的醛基与乙醇氧化酶的氨基共价结合，将乙醇氧化酶通过聚合物共价接枝在纳米纤维膜上；较之物理吸附的乙醇氧化酶其结合强度高、固定量多，提高了其检测的灵敏度和准确度，也可有效增加其循环使用次数。
三、水溶性聚合物聚乙二醇和聚乙烯亚胺作为手臂通过功能基团与乙醇氧化酶共价结合，可减少乙醇氧化酶对底物乙醇分子作用时的空间位阻，也提高了其检测的灵敏度和准确度。
四、采用了多位点固定、化学键合和电荷间物理作用相结合的方法。乙醇氧化酶先通过聚合物共价接枝在纳米纤维膜上，再通过阳离子聚合物的静电作用，使乙醇氧化酶的八个亚基固定。从而使得本发明的乙醇氧化酶八个亚基多位点“悬空”固定，即能保持乙醇氧化酶的空间结构和活性，又能使得乙醇氧化酶的亚基不易脱落，增加其循环使用次数，各次检测的一致性和可靠性高。
五、使用时将其与唾液接触，唾液中的乙醇与乙醇氧化酶作用生成过氧化氢使显色剂(靛蓝)褪色，利用褪色程度即可得出唾液中的酒精含量，同时利用血液中的酒精含量与唾液中的酒精含量成一定比例，可较准确得到血液中的酒精含量。使用后，将其用水清洗后，再重新浸入靛蓝溶液3-5分钟即可再次使用。其检测简单、便捷、可多次使用，便于推广。
上述A步中的纳米纤维膜的纤维直径为300纳米到1.5微米，表面带的氨基或羟基的密度为2-3.5nmol/cm2。
上述A步中的纳米纤维膜的纤维直径为300纳米到1.5微米，表面带的酸酐基或醛基的密度为2-3.5nmol/cm2。
上述B步的接枝有聚合物的纳米纤维膜中聚合物的接枝密度为0.2-0.7nmol/cm2。
上述C步的多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为70-180mg/g。
上述D步中的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚组氨酸或壳聚糖。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例一的方法制得的固定化酶纳米纤维膜对应的标准色卡，色卡下方是相应的乙醇浓度(mg/ml)。
图2是本发明实施例一的方法制得的固定化酶纳米纤维膜重复使用性结果。图中横坐标为使用次数，纵坐标为纳米纤维膜检测乙醇后的褪色程度。
具体实施方式
实施例一
一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、利用静电纺丝装置制备出表面带有氨基的聚苯乙烯纳米纤维膜，氨基密度为2.0nmol/cm2(即每平方厘米的纳米纤维膜含有氨基的量为2.0纳摩尔)。
B、将A步的纳米纤维膜浸入端羧基聚乙二醇溶液中1小时后取出晾干，得到接枝有端羧基聚乙二醇聚合物的纳米纤维膜，接枝密度为0.4nmol/cm2(即每平方厘米的纳米纤维膜上接枝0.4纳摩尔的端羧基聚乙二醇聚合物)；
C、将B步的接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中6小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜，纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为70mg/g(即每克纳米纤维膜上接枝70毫克乙醇氧化酶)；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入聚乙烯亚胺溶液中2小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中4分钟，取出、晾干，即得。
图1是本例方法的纳米纤维膜对应的标准色卡，色卡下方是相应的乙醇浓度(mg/ml)。其做法是将固定化纤维膜浸入靛蓝溶液中4分钟后，再放入含已知乙醇浓度的人工唾液中，1分钟后取出，纤维膜颜色即为该酒精浓度的标准色，一系列酒精浓度的标准色构成标准色卡。
从图1可以看出，实施例1的纤维膜能方便、快捷的检测出浓度范围为0-1.0mg/ml的乙醇浓度。
图2是本例方法制得的固定化酶纳米纤维膜重复使用结果。图中横坐标为使用次数，纵坐标为纳米纤维膜检测乙醇后的褪色程度，其含义是每次测试前后纤维膜颜色基数之差与测试前颜色基数的比值(以百分比表示)，其中颜色基数通过Image-Pro Plus软件处理纤维膜照片获得。
图中左边的一组为用纳米纤维膜对0.2mg/ml乙醇进行检测清洗后、浸入靛蓝溶液4分钟、再进行下次检测；一共重复9次检测得到的褪色程度；最左边的直方图为标准色卡中0.2mg/ml乙醇的褪色程度。从该组直方图可以看出，用本例的纳米纤维膜循环使用，前8次检测得到的褪色程度差别很小、一致性好，仅是第9次检测得到的颜色基数略为偏大(检出乙醇浓度略为偏低)。
图中右边的一组为用纳米纤维膜对0.8mg/ml乙醇进行检测清洗后、浸入靛蓝溶液4分钟、再进行下次检测；一共重复9次检测得到的褪色程度；该组最左边的直方图为标准色卡中0.8mg/ml乙醇的褪色程度。从该组直方图可以看出，用本例的纳米纤维膜循环使用，前8次检测得到的褪色程度差别很小、一致性好，仅是第9次检测得到的颜色基数略为偏大(检出乙醇浓度略为偏低)。
图2说明，本例的纳米纤维膜至少可以重复使用8次。
实施例二
一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、利用静电纺丝装置制备出表面带有氨基的聚苯乙烯纳米纤维膜，氨基密度为3.0nmol/cm2；
B、将A步的纳米纤维膜浸入端羧基聚乙二醇溶液中3小时后取出晾干，得到接枝有端羧基聚乙二醇聚合物的纳米纤维膜，接枝密度为0.2nmol/cm2；
C、将B步的接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中7小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜，纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为100mg/g；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入聚赖氨酸溶液中3小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中3分钟，取出、晾干，即得。
实施例三
一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、利用静电纺丝装置制备出表面带有羟基的聚苯乙烯纳米纤维膜，羟基密度为3.5nmol/cm2；
B、将A步的纳米纤维膜浸入端羧基聚乙二醇溶液中3小时后取出晾干，得到接枝有端羧基聚乙二醇聚合物的纳米纤维膜，接枝密度为0.7nmol/cm2；
C、将B步的接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中8小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜；纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为180mg/g；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入聚组氨酸溶液中1小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中5分钟，取出、晾干，即得。
实施例四
本例与实施例三基本相同，不同的是所述D步中的阳离子聚合物为壳聚糖。
实施例五
一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、利用静电纺丝装置制备出表面带有酸酐基的聚苯乙烯-马来酸酐共聚物纳米纤维膜，酸酐基密度为2.0nmol/cm2；
B、将A步的纳米纤维膜浸入聚乙烯亚胺溶液中2小时得到接枝有聚合物的纳米纤维膜，接枝密度为0.2nmol/cm2。
C、将接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入戊二醛溶液中2小时、取出，得到表面带有醛基的纳米纤维膜，再将表面带有醛基的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中8小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜，纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为70mg/g；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入聚乙烯亚胺溶液中2小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中5分钟，取出、晾干，即得。
实施例六
一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、利用静电纺丝装置制备出表面带有酸酐基的聚苯乙烯-马来酸酐共聚物纳米纤维膜，酸酐基密度为2.5nmol/cm2；
B、将A步的纳米纤维膜浸入聚乙烯亚胺溶液中2小时得到接枝有聚合物的纳米纤维膜，接枝密度为0.25nmol/cm2；
C、将接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入戊二醛溶液中1小时、取出，得到表面带有醛基的纳米纤维膜，再将表面带有醛基的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中6小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜。纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为125mg/g。
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入壳聚糖溶液1小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液4分钟，取出、晾干，即得。
实施例七
一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、利用静电纺丝装置制备出表面带有醛基的聚苯乙烯纳米纤维膜，醛基密度为3.5nmol/cm2；
B、将A步的纳米纤维膜浸入聚乙烯亚胺溶液中1小时，得到接枝有聚合物的纳米纤维膜，接枝密度为0.7nmol/cm2；
C、将接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入戊二醛溶液中1.5小时、取出，得到表面带有醛基的纳米纤维膜，再将表面带有醛基的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中7小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜。纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为180mg/g；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入聚赖氨酸溶液中3小时、固定乙醇氧化酶的多个亚甲基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中3分钟，取出、晾干，即得。
实施例八
本例与实施例七基本相同，不同的是所述D步中的阳离子聚合物为聚组氨酸。

Claims (7)

1.一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、用静电纺丝法制备出表面带氨基或羟基的纳米纤维膜；
B、将A步的纳米纤维膜接枝端羧基聚乙二醇，得到接枝有聚合物的纳米纤维膜；
C、将B步的接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中6-8小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入阳离子聚合物溶液1-3小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液中3-5分钟，取出、晾干，即得。
2.一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其步骤是：
A、用静电纺丝法制备出表面带酸酐基或醛基的纳米纤维膜；
B、将A步的纳米纤维膜接枝聚乙烯亚胺、得到接枝有聚合物的纳米纤维膜；
C、将B步得到的接枝有聚合物的纳米纤维膜浸入戊二醛溶液中1-2小时、取出，得到表面带有醛基的纳米纤维膜；再将表面带有醛基的纳米纤维膜浸入乙醇氧化酶溶液中6-8小时、取出，得到多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜；
D、将接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜浸入阳离子聚合物溶液1-3小时、固定乙醇氧化酶的多个亚基，取出得到乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜；
E、将乙醇氧化酶亚基固定的纳米纤维膜浸入靛蓝溶液3-5分钟，取出、晾干，即得。
3.如权利要求1所述的一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述A步中的纳米纤维膜的纤维直径为300纳米到1.5微米，表面带的氨基或羟基的密度为2-3.5nmol/cm2。
4.如权利要求2所述的一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，所述A步中的纳米纤维膜的纤维直径为300纳米到1.5微米，表面带的酸酐基或醛基的密度为2-3.5nmol/cm2。
5.如权利要求1或2所述的一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：所述B步的接枝有聚合物的纳米纤维膜中聚合物的接枝密度为0.2-0.7nmol/cm2。
6.如权利要求1或2所述的一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：所述C步的多位点共价接枝乙醇氧化酶的纳米纤维膜上乙醇氧化酶的接枝量为70-180mg/g。
7.如权利要求1或2所述的一种检测唾液中酒精含量的固定化酶纳米纤维膜的制备方法，其特征在于：所述D步中的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚组氨酸或壳聚糖。
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