CN107574185A - 一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于培养基技术领域，尤其涉及一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法，方法步骤包括：发酵培养基制备，种子液制备，摇瓶发酵培养发酵液，测定干重和角鲨烯含量。此培养基与原始培养基相比，培养基成分有所减少，且NaCl浓度减少了76％，进行大规模发酵培养时，可降低对发酵罐设备的腐蚀，节约成本；破囊壶菌生产角鲨烯产量低限制了其工业化生产，优化其发酵生产培养基是提高产量的重要手段，本发明是提出一种利用破囊壶菌高产角鲨烯的培养基成分及配比，提高角鲨烯的发酵产量，为大规模发酵生产提供依据。
Description
技术领域
本发明属于培养基技术领域，尤其涉及一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法。
背景技术
角鲨烯是一种开链三萜类化合物，因其特殊的生物功能和药理作用而在药物和功能食品等相关领域中有着重要应用。角鲨烯具有独特的提高细胞含氧量及人体血红蛋白的携氧能力，能增强细胞活力，促进新陈代谢，提高机体免疫力功能，并能促进胆汁分泌，降低血清总胆固醇，调整脂蛋白比例，保护细胞免受自由基的影响，因而广泛应用于药物、功能食品、化妆品等相关领域。
目前，角鲨烯主要来源是深海鲨鱼，而深海鲨鱼是珍贵的保护动物，生态环境破坏限制了角鲨烯的生产和使用。随着角鲨烯使用的日益广泛，天然来源角鲨烯因其有限的资源限制，化学合成角鲨烯的技术的复杂性和不稳定性，都无法满足庞大的市场需求。近几年来，关于利用微藻生产角鲨烯的研究逐渐增多，在所有的微藻种群中，异养型的破囊壶菌(Thraustochytrids)具有高产角鲨烯的潜力。利用破囊壶菌生产角鲨烯，具有生产周期短、所需空间小，不受地域和季节限制等独特优势。破囊壶菌作为一种极具工业化生产潜力的替代资源，已成为当前研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基及其培养方法。
本发明的第一个技术方案是一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基，成分及比例如下：
葡萄糖20～40g，yeast extract 15～25g，谷氨酸钠3～8g，KH2PO4 0.2～0.5g，NaCl 3～10g，KCl 1～3g，MgSO4·7H2O 2～7g，NaHCO3 0.1～0.5g，CaCl20.1～0.5g，FeCl3·6H2O 1.5～3.5mg，CuSO4·5H2O 0.01～0.05mg，CoCl·6H2O0.15～0.35mg，ZnSO4·7H2O 0.5～1mg，MnSO4·H2O 5～10mg，超纯H2O 1000ml.
本发明的第二个技术方案是一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基的培养方法，该方法包括如下步骤：
(1)、破囊壶菌高产角鲨烯发酵培养基SQUP制备：115～120℃，灭菌15～20分钟；
(2)、种子液制备：250ml锥形瓶装入100ml原始培养基SQU，种龄为48h，接种量为10％，培养条件为25～30℃，150～200r/min；
(3)、摇瓶发酵培养发酵液：使用培养基SQUP进行摇瓶发酵生产，100ml锥形瓶中装入30～50ml高产培养基(SQUP)，培养条件为25～30℃，150～200r/min；发酵培养5～6天；
(4)、测定干重：测定每天的角鲨烯产量和干重，选取产量最高的时间作为最终发酵时间；发酵液取样时每个样品取三个平行，每个平行取15ml菌液；将菌液10000r/min离心，除去上清，然后用灭菌水水洗两遍，冻干机-50℃冻干24～48h，称重得到细胞干重DW；
(5)、测定角鲨烯含量：
a)、角鲨烯提取方法：冻干的菌体中加入1.5ml，体积比2:1的CH3Cl3/CH3OH，匀质机破碎时间大于120s，全部取出至10ml玻璃管中；
b)、氮吹仪吹干，加入4ml NaOH-CH3OH-H2O混合溶液，NaOH在CH3OH-H2O溶液中质量体积浓度为15％，CH3OH与H2O的体积比为4:1，涡旋30s，60～70℃水浴1～2h；取出，冷却至室温；
c)、加入2ml正己烷萃取，GC测定角鲨烯含量。
所述步骤(3)每24小时取一次样。
有益效果：
1、破囊壶菌生产角鲨烯产量低限制了其工业化生产，优化其发酵生产培养基是提高产量的重要手段，本发明是提出一种利用破囊壶菌高产角鲨烯的培养基成分及配比，提高角鲨烯的发酵产量，为大规模发酵生产提供依据。
2、选取破囊壶菌使用高产角鲨烯培养基和原始培养基进行发酵培养的最高角鲨烯产量，进行比较，3株破囊壶菌使用两种培养基发酵培养时的最高角鲨烯产量比较结果如图4所示，使用高产角鲨烯培养基(SQUP)进行发酵生产时，角鲨烯产量有了显著提高，进行了多次反复试验，均得出了类似结果，说明SQUP培养基提高角鲨烯效果显著。
3、此培养基与原始培养基相比，培养基成分有所减少，且NaCl浓度减少了76％，进行大规模发酵培养时，可降低对发酵罐设备的腐蚀，节约成本。
附图说明
图1为Thraustochytriumsp.ATCC26185使用两种培养基发酵生产结果(角鲨烯产量；细胞干重)：a：原始培养基(SQU)b：高产培养基(SQUP)。
图2为Schizochytriumsp.PKU#Mn4使用两种培养基发酵生产结果(角鲨烯产量；细胞干重)a：原始培养基(SQU)b：高产培养基(SQUP)。
图3为Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16使用两种培养基发酵生产结果(角鲨烯产量；细胞干重)a：原始培养基(SQU)b：高产培养基(SQUP)。
图4为三株破囊壶菌使用两种培养基发酵生产结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
本发明一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基，其成分及比例如下：葡萄糖20～40g，yeast extract 15～25g，谷氨酸钠3～8g，KH2PO4 0.2～0.5g，NaCl3～10g，KCl 1～3g，MgSO4·7H2O 2～7g，NaHCO3 0.1～0.5g，CaCl2 0.1～0.5g，FeCl3·6H2O 1.5～3.5mg，CuSO4·5H2O 0.01～0.05mg，CoCl·6H2O 0.15～0.35mg，ZnSO4·7H2O 0.5～1mg，MnSO4·H2O 5～10mg，超纯H2O 1000ml。
采用上述破囊壶菌发酵培养基的培养方法，具体步骤如下：
(1)、破囊壶菌高产角鲨烯发酵培养基SQUP制备：按照上述成分和比例制备，115～120℃，灭菌15～20分钟；
(2)、原始培养基SQU制备：成分及配比为葡萄糖30g，酵母提取物2g，谷氨酸钠2g，(NH4)2SO4 0.2g，KH2PO4 0.3g，NaCl 25g，KCl 1g，MgSO4·7H2O 5g，NaHCO3 0.1g，CaCl20.3g，FeCl3·6H2O 2.9mg，CuSO4·5H2O 0.02mg，CoCl·6H2O0.26mg，ZnSO4·7H2O 0.6mg，MnSO4·H2O 8.6mg，H2O 1000ml；115℃，灭菌21分钟；
(3)、种子液制备：250ml锥形瓶装入100ml原始培养基SQU，种龄为48h，接种量为10％，培养条件为25～30℃，150～200/min；
(4)、摇瓶发酵培养发酵液：使用培养基SQUP进行摇瓶发酵生产，100ml锥形瓶中装入30～50ml高产培养基(SQUP)，培养条件为25～30℃，150～200r/min；发酵培养5～6天；
(5)、测定干重：测定每天的角鲨烯产量和干重，选取产量最高的时间作为最终发酵时间；发酵液取样时每个样品取三个平行，每个平行取15ml菌液；将菌液10000r/min离心，除去上清，然后用灭菌水水洗两遍，冻干机-50℃冻干24～48h，称重得到细胞干重DW；
(6)、测定角鲨烯含量：
a)、角鲨烯提取方法：冻干的菌体中加入1.5ml，体积比2:1的CH3Cl3/CH3OH，匀质机破碎时间大于120s，全部取出至10ml玻璃管中；
b)、氮吹仪吹干，加入4ml NaOH-CH3OH-H2O混合溶液，NaOH在CH3OH-H2O溶液中质量体积浓度为15％，CH3OH与H2O的体积比为4:1，涡旋30s，60～70℃水浴1～2h；取出，冷却至室温；
c)、加入2ml正己烷萃取，GC测定角鲨烯含量。
实施例1
实例中所涉及的菌株：Thraustochytrium sp.ATCC26185，拉丁文：Thraustochytriumsp.ATCC26185；保藏单位：ATCC；保藏日期：1961；菌株编号ATCC26185。
一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基，成分及比例如下：葡萄糖20g，yeastextract 15g，谷氨酸钠3g，KH2PO4 0.2g，NaCl 3g，KCl 1g，MgSO4·7H2O2g，NaHCO3 0.1g，CaCl2 0.1g，FeCl3·6H2O 1.5mg，CuSO4·5H2O 0.01mg，CoCl·6H2O0.15mg，ZnSO4·7H2O0.5mg，MnSO4·H2O 5mg，超纯H2O 1000ml。
培养方法，包括如下步骤：
(1)、破囊壶菌高产角鲨烯发酵培养基SQUP和原始培养基SQU制备：115℃，灭菌20分钟；
(2)、种子液制备：250ml锥形瓶装入100ml原始培养基SQU，种龄为48h，接种量为10％，培养条件为25℃，150r/min；
(3)、摇瓶发酵培养发酵液：使用培养基SQUP进行摇瓶发酵生产，100ml锥形瓶中装入30ml高产培养基(SQUP)，培养条件为25℃，150r/min；发酵培养6天，每24小时取一次样；
(4)、测定干重：测定每天的角鲨烯产量和干重，选取产量最高的时间作为最终发酵时间；发酵液取样时每个样品取三个平行，每个平行取15ml菌液；将菌液10000r/min离心，除去上清，然后用灭菌水水洗两遍，冻干机-50℃冻干24h，称重得到细胞干重DW；
(5)、测定角鲨烯含量：
a)、角鲨烯提取方法：冻干的菌体中加入1.5ml，体积比2:1的CH3Cl3/CH3OH，匀质机破碎时间大于120s，全部取出至10ml玻璃管中；
b)、氮吹仪吹干，加入4ml NaOH-CH3OH-H2O混合溶液，NaOH在CH3OH-H2O溶液中质量体积浓度为15％，CH3OH与H2O的体积比为4:1，涡旋30s，60℃水浴1h；取出，冷却至室温；
c)、加入2ml正己烷萃取，GC测定角鲨烯含量。
Thraustochytriumsp.ATCC26185按照上述步骤1～5分别使用高产角鲨烯培养基(SQUP)和原始培养基(SQU)进行培养，步骤3中的发酵培养时间为6天，每24小时取样一次。水洗冻干后的菌体用上述方法提取角鲨烯。结果表明，使用原始培养基(SQU)进行发酵培养时，第4天角鲨烯产量最高，为47.62mg/L，细胞干重为9.70g/L。使用高产角鲨烯培养基(SQUP)进行培养时，第5天角鲨烯产量最高,为98.02mg/L，细胞干重为15.04g/L。高产角鲨烯培养基与原始培养基最高角鲨烯产量进行比较，提高了105.86％，角鲨烯产量和细胞干重结果如图1所示。
实施例2
实例中所涉及的菌株：Schizochytriumsp.PKU#Mn4，拉丁文：Schizochytriumsp.PKU#Mn4；保藏单位：CGMCC；保藏日期：2014-4-9；菌株编号：CGMCC8091。
一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基，成分及比例如下：葡萄糖40g，yeastextract 25g，谷氨酸钠8g，KH2PO4 0.5g，NaCl 10g，KCl 3g，MgSO4·7H2O7g，NaHCO3 0.5g，CaCl2 0.5g，FeCl3·6H2O 3.5mg，CuSO4·5H2O 0.05mg，CoCl·6H2O0.35mg，ZnSO4·7H2O1mg，MnSO4·H2O 10mg，超纯H2O 1000ml。
培养方法，包括如下步骤：
(1)、破囊壶菌高产角鲨烯发酵培养基SQUP和原始培养基SQU制备：120℃，灭菌15分钟；
(2)、种子液制备：250ml锥形瓶装入100ml原始培养基SQU，种龄为48h，接种量为10％，培养条件为30℃，200r/min；
(3)、摇瓶发酵培养发酵液：使用培养基SQUP进行摇瓶发酵生产，100ml锥形瓶中装入50ml高产培养基(SQUP)，培养条件为30℃，200r/min；发酵培养5天，每24小时取一次样；
(4)、测定干重：测定每天的角鲨烯产量和干重，选取产量最高的时间作为最终发酵时间；发酵液取样时每个样品取三个平行，每个平行取15ml菌液；将菌液10000r/min离心，除去上清，然后用灭菌水水洗两遍，冻干机-50℃冻干48h，称重得到细胞干重DW；
(5)、测定角鲨烯含量：
a)、角鲨烯提取方法：冻干的菌体中加入1.5ml，体积比2:1的CH3Cl3/CH3OH，匀质机破碎时间大于120s，全部取出至10ml玻璃管中；
b)、氮吹仪吹干，加入4ml NaOH-CH3OH-H2O混合溶液，NaOH在CH3OH-H2O溶液中质量体积浓度为15％，CH3OH与H2O的体积比为4:1，涡旋30s，70℃水浴2h；取出，冷却至室温；
c)、加入2ml正己烷萃取，GC测定角鲨烯含量。
Schizochytrium sp.PKU#Mn4按照上述步骤1～5分别使用高产角鲨烯培养基(SQUP)和原始培养基(SQU)进行培养，步骤3中的发酵培养时间为5天，每24小时取样一次。水洗冻干后的菌体用上述方法提取角鲨烯。使用原始培养基(SQU)进行发酵培养时，第3天角鲨烯产量最高为16.75mg/L，细胞干重为12.11g/L。使用高产角鲨烯培养基进行培养时，第3天角鲨烯产量最高为26.48mg/L，细胞干重为12.14g/L。比较两种培养基最高角鲨烯产量，使用高产角鲨烯培养基进行发酵培养，其产量提高了58.08％，角鲨烯产量和细胞干重结果如图2所示。
实施例3
实例中所涉及的菌株：Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16，拉丁文：Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16；保藏单位：CGMCC；保藏日期：2014-4-9；菌株编号：CGMCC8095。
一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基，成分及比例如下：葡萄糖30g，yeastextract 20g，谷氨酸钠5g，KH2PO4 0.3g，NaCl 7g，KCl2g，MgSO4·7H2O 5g，NaHCO3 0.3g，CaCl2 0.3g，FeCl3·6H2O 2.0mg，CuSO4·5H2O 0.03mg，CoCl·6H2O0.20mg，ZnSO4·7H2O0.7mg，MnSO4·H2O 7mg，超纯H2O 1000ml。
培养方法，包括如下步骤：
(1)、破囊壶菌高产角鲨烯发酵培养基SQUP和原始培养基SQU制备：117℃，灭菌20分钟；
(2)、种子液制备：250ml锥形瓶装入100ml原始培养基SQU，种龄为48h，接种量为10％，培养条件为27℃，170r/min；
(3)、摇瓶发酵培养发酵液：使用培养基SQUP进行摇瓶发酵生产，100ml锥形瓶中装入40ml高产培养基(SQUP)，培养条件为28℃，170r/min；发酵培养5天，每24小时取一次样；
(4)、测定干重：测定每天的角鲨烯产量和干重，选取产量最高的时间作为最终发酵时间；发酵液取样时每个样品取三个平行，每个平行取15ml菌液；将菌液10000r/min离心，除去上清，然后用灭菌水水洗两遍，冻干机-50℃冻干36h，称重得到细胞干重DW；
(5)、测定角鲨烯含量：
a)、角鲨烯提取方法：冻干的菌体中加入1.5ml，体积比2:1的CH3Cl3/CH3OH，匀质机破碎时间大于120s，全部取出至10ml玻璃管中；
b)、氮吹仪吹干，加入4ml NaOH-CH3OH-H2O混合溶液，NaOH在CH3OH-H2O溶液中质量体积浓度为15％，CH3OH与H2O的体积比为4:1，涡旋30s，65℃水浴1h；取出，冷却至室温；
c)、加入2ml正己烷萃取，GC测定角鲨烯含量。
Thraustochytriidae sp.PKU#Mn16按照上述步骤1～5分别使用高产角鲨烯培养基(SQUP)和原始培养基(SQU)进行培养，步骤3中的发酵培养时间为5天，每24小时取样一次。水洗冻干后的菌体用上述方法提取角鲨烯。使用原始培养基(SQU)进行发酵培养时，第2天角鲨烯产量最高，为14.73mg/L，细胞干重为7.79g/L。使用高产角鲨烯培养基进行培养时，第3天角鲨烯产量最高，为32.16mg/L，细胞干重为7.25g/L。比较两种培养基最高角鲨烯产量，使用高产培养基进行发酵生产，与原始培养基性比较，角鲨烯产量提高了118.29％，角鲨烯产量和细胞干重结果如图3所示。
3株破囊壶菌分别使用原始培养基(SQU)和高产角鲨烯培养基(SQUP)发酵生产，角鲨烯的最优产量如图4所示。由图4可看出，使用高产角鲨烯培养基(SQUP)进行发酵生产时，角鲨烯产量得到了显著性的升高，结果表明，此高产培养基用于破囊壶菌发酵生产角鲨烯时，其产量提高效果显著。
应当理解的是，这里所讨论的实施方案及实例只是为了说明，对本领域技术人员来说，可以加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种高产角鲨烯的破囊壶菌发酵培养基，其特征在于，成分及比例如下：
葡萄糖20～40g，yeast extract 15～25g，谷氨酸钠3～8g，KH2PO4 0.2～0.5g，NaCl 3～10g，KCl 1～3g，MgSO4·7H2O 2～7g，NaHCO3 0.1～0.5g，CaCl2 0.1～0.5g，FeCl3·6H2O1.5～3.5mg，CuSO4·5H2O 0.01～0.05mg，CoCl·6H2O 0.15～0.35mg，ZnSO4·7H2O 0.5～1mg，MnSO4·H2O 5～10mg，超纯H2O 1000ml。
2.一种采用权利要求1所述的破囊壶菌发酵培养基的培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)、破囊壶菌高产角鲨烯发酵培养基SQUP制备：115～120℃，灭菌15～20分钟；
(2)、种子液制备：250ml锥形瓶装入100ml原始培养基SQU，种龄为48h，接种量为10％，培养条件为25～30℃，150～200r/min；
(3)、摇瓶发酵培养发酵液：使用培养基SQUP进行摇瓶发酵生产，100ml锥形瓶中装入30～50ml高产培养基(SQUP)，培养条件为25～30℃，150～200r/min；发酵培养5～6天；
(4)、测定干重：测定每天的角鲨烯产量和干重，选取产量最高的时间作为最终发酵时间；发酵液取样时每个样品取三个平行，每个平行取15ml菌液；将菌液10000r/min离心，除去上清，然后用灭菌水水洗两遍，冻干机-50℃冻干24～48h，称重得到细胞干重DW；
(5)、测定角鲨烯含量：
a)、角鲨烯提取方法：冻干的菌体中加入1.5ml，体积比2:1的CH3Cl3/CH3OH，匀质机破碎时间大于120s，全部取出至10ml玻璃管中；
b)、氮吹仪吹干，加入4ml NaOH-CH3OH-H2O混合溶液，NaOH在CH3OH-H2O溶液中质量体积浓度为15％，CH3OH与H2O的体积比为4:1，涡旋30s，60～70℃水浴1～2h；取出，冷却至室温；
c)、加入2ml正己烷萃取，GC测定角鲨烯含量。
3.根据权利要求2所述的破囊壶菌发酵培养基的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)每24小时取一次样。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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