CN102517350A - 角鲨烯合成酶抑制剂cj-13982的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种角鲨烯合成酶抑制剂CJ-13982的制备方法。化合物CJ-13982是从稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的发酵培养物中分离制备得到的，所述的稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011412。本发明提供的从植物内生真菌稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的发酵培养物中制备得到具有抑制角鲨烯合成酶作用的化合物CJ-13982的方法，该方法具有培养条件温和、培养基配制简单易行、分离纯化步骤简单、产量大、可以在人工控制条件下实现大规模生产等优点，能够比较方便解决研究或应用化合物CJ-13982所需的原料问题，为制备化合物CJ-13982提供了一条新的途径。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及利用植物内生真菌稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8发酵制备具有抑制角鲨烯合成酶作用的化合物CJ-13982的方法。
背景技术：
随着我国人口的老龄化，心血管病发病率和病死率逐年上升，冠心病是其中的主要杀手。我们常说的冠心病多由动脉器质性狭窄或阻塞引起，又称冠状动脉粥样硬化性心脏病，其冠状动脉狭窄多系脂肪物质沿血管内壁堆积所致，这一过程称之为动脉硬化。动脉硬化发展到一定程度，冠状动脉狭窄逐渐加重，限制流入心肌的血流。心脏得不到足够的氧气供给，就会发生胸部不适，即心绞痛。冠心病是指冠状动脉粥样硬化导致心肌缺血、缺氧而引发的心脏病，常伴发心绞痛。目前该病严重威胁中老年人的健康，是造成中老年人死亡的主要原因，如何降低其发病率及减少死亡率已成为世界各国关注的研究课题。
引起动脉硬化的脂肪物质的主要成分是胆固醇，许多研究表明，胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平与冠心病的发病率密切相关。由于人体内大约有70％胆固醇源于体内合成，所以抑制其体内合成是一种有效降低胆固醇的方法。羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(如洛伐他汀)是目前最有效的降胆固醇药。据报道，冠心病病人使用HMG-CoA还原酶抑制剂降低血浆高胆固醇后，死亡率可降低约1/3。但是，当体内甲羟戊酸合成途径中的关键酶——HMG-CoA还原酶被抑制后，不仅胆固醇的合成减少，由甲羟戊酸进一步合成的非甾醇类异戊二烯(如多萜醇)等物质也相应减少，而这些物质是细胞正常生长、分化和发育所需要的。因此HMG-CoA还原酶抑制剂会对细胞的生长、增殖和分化产生影响，并由此引起多种不良反应。另外，有证据表明：血中甘油三酯过多是引起冠状动脉心脏病的又一原因，而HMG-CoA还原酶抑制剂几乎没有降低血浆甘油三酯的作用。所以，需要有比HMG-CoA还原酶抑制剂更安全有效的降血脂药。
角鲨烯合成酶(squalene synthase，SQS)是体内胆固醇合成、代谢途径中的一种重要酶，它能催化两分子法呢基二磷酸(FPP)经还原性二聚作用，产生中间体前角鲨烯二磷酸，在NADPH的还原作用下，前角鲨烯二磷酸生成角鲨烯，后者再经进一步合成生成胆固醇。抑制SQS的活性，就能减少角鲨烯的生成量，从而降低胆固醇的水平，而且因为SQS的催化反应在合成类异戊二烯的分支途径之后，所以SQS抑制剂对类异戊二烯的合成没有影响。而且，还有报道指出，SQS抑制剂不仅能降低血浆胆固醇水平，还降低血浆甘油三酯水平。所以，SQS成为了治疗高脂血症和冠状动脉心脏病的极具吸引力的作用靶点，其抑制剂的研究也已成为降血脂药物研制的一个重要方向。
在文献“CJ-13981 and CJ-13982，new squalene synthase inhibitors，J.Antibiot.，2001，54(12)，1025-1030”中，作者从一株未鉴定的真菌CL15036中分离得到了本发明专利中的活性化合物CJ-13982及一个结构类似物CJ-13981，通过质谱和核磁共振技术鉴定了其平面结构，并测试了两个化合物对大鼠和人体肝脏微粒体中SQS的抑制活性，结果表明，CJ-13982对大鼠和人体肝脏微粒体中SQS的IC50分别为2.2和1.1μM。在文献“Total synthesis and determinationof the absolute stereochemistry of the squalene synthase inhibitors CJ-13981and CJ-13982，Tetrahedron Lett.，2009，50(26)，3388-3390”中，作者通过全合成的方法确定了本发明专利中的活性化合物CJ-13982及其结构类似物CJ-13981的绝对构型。
化合物CJ-13982的结构如式(I)所示：
式(I)
但到目前为止，在国内外文献报道中，均未有从别的途径得到化合物CJ-13982的报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种从稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的发酵培养物中制备化合物CJ-13982的方法。
本发明的化合物CJ-13982的制备方法，其特征在于，所述的CJ-13982是从稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的发酵培养物中分离制备得到的，所述的稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011412。
优选，所述的化合物CJ-13982的制备方法，具体步骤如下：
(d)制备稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵培养物；
(e)将固体发酵培养物用乙酸乙酯冷浸提取，浓缩乙酸乙酯提取液，得到总浸膏，将总浸膏用甲醇溶解悬浮，悬浮液用环己烷萃取，萃取后的甲醇溶液经浓缩得到甲醇相浸膏；
(f)甲醇相浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为10∶1～5∶1梯度下洗脱下来的馏分，将该馏分用凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为洗脱剂洗脱，收集在TLC上能用体积比为5∶1的氯仿-甲醇作为展开剂展开，且用碘显色成黄色长条的馏分，将该馏分用反相硅胶柱层析，先以体积比为4∶1的甲醇-水作为洗脱剂洗脱至柱子上黄色部分洗出以后，再换纯甲醇洗脱，收集该馏分，浓缩得到白色固体，即为目标化合物CJ-13982。
所述的制备稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵培养物是通过以下方法制备的：将稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8接种到CPDA培养基中，在28℃培养3天，获得种子平板，然后将种子平板培养物切成约20×20mm的小块，接种于固体发酵培养基中，28℃培养30天，获得稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵培养物；所述的固体发酵培养基每升含有：1000g大米，6g蛋白胨，1000mL水。
所述的CPDA培养基属于现有技术中的培养基，其配方：马铃薯200克、葡萄糖20克、磷酸二氢钾3克、硫酸镁1.5克、维生素B110毫克、琼脂18-20克、自来水1000毫升，pH5-6。
本发明提供的从植物内生真菌稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的发酵培养物中制备得到具有抑制角鲨烯合成酶作用的化合物CJ-13982的方法，该方法具有培养条件温和、培养基配制简单易行、分离纯化步骤简单、产量大、可以在人工控制条件下实现大规模生产等优点，能够比较方便解决研究或应用化合物CJ-13982所需的原料问题，为制备化合物CJ-13982提供了一条新的途径。
本发明的稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011412。
具体实施方式：
下面通过具体实施例来对本发明做进一步的阐述，但是本发明并不受限于下面的实施例。
实施例1：
一、植物内生真菌稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的分离纯化和鉴定。
本发明的稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8是从采自广东信宜的药用植物白木香的5年龄根部和30年龄结香部位分离到的内生真菌，经ITS序列分析鉴定，其ITS区的片段的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，GenBank基因登录号为：EU781665[白木香内生真菌的分离及分子鉴定，菌物研究，2009，7(1)，37-42]。经blast比对，同源分析，本发明的菌株属于稻黑孢(Nigrospora oryzae)种，命名为稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8。该菌于2011年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011412。
二、稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵。
固体平板培养基(CPDA培养基)是通过以下方法配制：用500mL的蒸馏水煮200g的马铃薯，煮沸半小时，过滤得汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO43g、MgSO41.5g、维生素B110mg、琼脂18g，用水补足至1000mL，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右，无菌条件下倒平板，冷却待用。
固体发酵培养基是通过以下方法配制的：100g大米，0.6g蛋白胨，100mL蒸馏水，加入500mL的三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用。
从斜面保藏管将稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的菌丝接到固体平板培养基中，在28℃培养3天，获得种子平板，然后将种子平板培养物切成约20×20mm的小块，接种于固体发酵培养基中，共50瓶，28℃培养30天，获得稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵培养物。
三、化合物CJ-13982的制备。
将固体发酵培养物用不锈钢棒搅碎，加入乙酸乙酯没过固体发酵培养物，冷浸提取多次，合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩得到总浸膏(289.6g)；
将总浸膏用甲醇溶解悬浮，悬浮液用等体积环己烷萃取多次，萃取后的甲醇溶液经减压浓缩得到甲醇相浸膏(66.3g)；
甲醇相浸膏经硅胶柱层析(200-300目)，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为10∶1～5∶1梯度下洗脱下来的馏分，将该馏分用凝胶柱层析(Sephadex LH-20)，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为洗脱剂洗脱，收集能在TLC(silica gel 60F254)上用体积比为5∶1的氯仿-甲醇作为展开剂展开，用碘显色成黄色长条的馏分，将该馏分用反相硅胶柱层析(Chromatorex ODS，40-75μm)，先以体积比为4∶1的甲醇-水作为洗脱剂洗脱，至柱子上黄色部分洗出以后，再换纯甲醇洗脱，收集甲醇洗脱的馏分，浓缩得到白色固体化合物，该白色固体化合物经结构鉴定即为目标化合物CJ-13982(24.5g)，其结构如式(I)所示。
白色固体化合物经高分辨质谱和核磁共振波谱分析，其结构鉴定如下：
该白色固体化合物具有以下理化和波谱特性：
白色固体，比旋光度
(c 0.38，MeOH)；正离子ESI-MS m/z：383[M+Na]+，743[2M+Na]+，高分辨正离子ESI-MS m/z：383.2016[M+Na]+(Calcd.for C18H32O7Na383.2046)；1H-NMR(500MHz，Acetone-d6)δ：0.87(3H，t，J＝6.9Hz)，1.27(20H，m)，1.54(1H，m)，1.81(1H，m)，2.70(1H，dd，J＝11.7，3.0Hz)，2.75(1H，d，J＝16.5Hz)，3.11(1H，d，J＝16.5Hz)；13C-NMR(125MHz，，Acetone-d6)δ：15.6，24.6，29.1，29.8，31.5(3C)，31.6(2C)，31.7(2C)，33.9，42.8，55.4，77.4，173.4，174.0，175.0。以上数据与文献报道[CJ-13981 and CJ-13982，newsqualene synthase inhibitors，J.Antibiot.，2001，54(12)，1025-1030]中CJ-13982的记载值一致。
因此经过上述方法分离的白色固体化合物为CJ-13982，其结构如下式(I)所示：
式(I)
Claims (3)
1.一种化合物CJ-13982的制备方法，其特征在于，所述的CJ-13982是从稻黑孢(Nigrosporaoryzae)A8的发酵培养物中分离制备得到的，所述的稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011412。
2.根据权利要求1所述的化合物CJ-13982的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(a)制备稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵培养物；
(b)将固体发酵培养物用乙酸乙酯冷浸提取，浓缩乙酸乙酯提取液，得到总浸膏，将总浸膏用甲醇溶解悬浮，悬浮液用环己烷萃取，萃取后的甲醇溶液经浓缩得到甲醇相浸膏；
(c)甲醇相浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为10∶1～5∶1梯度下洗脱下来的馏分，将该馏分用凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为洗脱剂洗脱，收集在TLC上能用体积比为5∶1的氯仿-甲醇作为展开剂展开，且用碘显色成黄色长条的馏分，将该馏分用反相硅胶柱层析，先以体积比为4∶1的甲醇-水作为洗脱剂洗脱至柱子上黄色部分洗出以后，再换纯甲醇洗脱，收集该馏分，浓缩得到白色固体，即为目标化合物CJ-13982。
3.根据权利要求2所述的化合物CJ-13982的制备方法，其特征在于，所述的制备稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵培养物是通过以下方法制备的：将稻黑孢(Nigrosporaoryzae)A8接种到CPDA培养基中，在28℃培养3天，获得种子平板，然后将种子平板培养物切成20×20mm的小块，接种于固体发酵培养基中，28℃培养30天，获得稻黑孢(Nigrospora oryzae)A8的固体发酵培养物；所述的固体发酵培养基的配方为每升含有：1000g大米，6g蛋白胨，1000mL水。
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