CN107569498A - 一种提高四环素药效的药物组合方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高四环素药效的药物组合方法，其特征在于包含以下步骤：配制四环素；配制N‑乙酰半胱氨酸；配制LB液体培养基；不含四环素的固体底层平板；培养大肠杆菌；大肠杆菌的稀释；不含四环素的半固体上层平板；培养计数。本发明一种提高四环素药效的药物组合方法优点：降低了四环素的使用量，降低量为5‑10mg/L四环素；消除了低剂量的四环素使用过程中产生耐药性的风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高四环素药效的药物组合方法。
背景技术
四环素是从放线菌的培养液中分离出来的抗菌活性物质，具有广谱的抗菌作用，如对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、立克次氏体、滤过性病毒、螺旋体属以及原虫类都有很好的抑制作用，但对结核杆菌、变形菌等无治疗效果。另外对很多青霉素敏感的人群，可以用四环素类抗生素作为替代品治疗某些疾病。由于其造价不高，广泛应用于对人类和动物感染的治疗。四环素的作用机理是与原核生物的核糖体的30S亚单位结合，阻止氨酰基-tRNA进入A位，从而抑制细菌肽链增长和蛋白质的合成。
在四环素药物实际治疗过程中由于给药途径、给药剂量以及个体的药物代谢情况不同常引起部分细菌耐药性的出现，导致四环素的治疗效果不佳。通常情况下终浓度为15-20mg/L四环素可抑制敏感性大肠杆菌的生长，10mg/L及更低浓度的四环素胁迫可导致部分大肠杆菌的对四环素耐药性的产生，从而导致四环素杀菌效果欠佳甚至无杀菌效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种提高四环素药效的药物组合方法。
本发明一种提高四环素药效的药物组合方法，其特征在于包含以下步骤：
配制四环素：用去离子水配制浓度为20mg/mL的四环素母液，并用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃的冰箱中备用；
配制N-乙酰半胱氨酸：用去离子水配制10mg/mL的N-乙酰半胱氨酸并用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃的冰箱中备用；
配制LB液体培养基：取氯化钠5g、蛋白胨10g、酵母粉5g，加水至1000mL，pH自然，分装后于1.034×105Pa灭菌20min；向固体培养基中添加w/v 1.2％的琼脂粉；半固体培养基中添加w/v 0.5％的琼脂粉；不含四环素的固体底层平板：灭菌后的LB固体培养基待其冷却至45-55℃后倒入无菌一次性平皿，冷却待用；含四环素的底层固体平板：灭菌后的LB固体培养基待其冷却至45-55℃后向其中加入四环素母液到需要的工作浓度，混匀后倒入无菌一次性平皿，冷却待用；
培养大肠杆菌：按照w/v 2％接种量接种大肠杆菌培养液至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、180rpm培养至对数期，待用；
大肠杆菌的稀释：取步骤d中培养的大肠杆菌稀释105倍待用；
不含四环素的半固体上层平板：取50μL稀释105倍的大肠杆菌加入到安培瓶中，再向安培瓶中加入5mL灭菌的温度在42-47℃的半固体，摇匀后倒入预先倒好的固体平板上；含四环素的半固体上层平板：取50μL稀释105倍的大肠杆菌加入到安培瓶中，再向安培瓶中加入5mL灭菌的温度在42-47℃的半固体，并在半固体中加入四环素至需要的浓度，摇匀后倒入预先倒好的含相同浓度四环素的固体平板上；
培养计数：将倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h，对菌落进行计数。
本发明一种提高四环素药效的药物组合方法目的：四环素是广谱抗生素，广泛应用于临床治疗；但是该抗生素在用于治疗时不仅剂量大而且会导致细菌耐药性的出现。体外实验实验表明：15-20mg/L四环素可抑制敏感性大肠杆菌的生长，但是低剂量的四环素如10mg/L及更低浓度的四环素胁迫可导致部分大肠杆菌的对四环素耐药性的产生，从而导致四环素杀菌效果欠佳甚至无杀菌效果。本发明目的就是提高在低剂量的四环素作用下，减少大肠杆菌耐药性的产生，提高治疗效果。
本发明一种提高四环素药效的药物组合方法效果：10mg/L N-乙酰半胱氨酸+10mg/L四环素的药物组合能完全抑制敏感性大肠杆菌的生长，且不产生耐药性。
本发明一种提高四环素药效的药物组合方法优点：降低了四环素的使用量，降低量为5-10mg/L四环素；消除了低剂量的四环素使用过程中产生耐药性的风险，含10mg/L四环素浓度的平板，大肠杆菌的菌落数为31±8，在10mg/L N-乙酰半胱氨酸+10mg/L四环素的药物组合的平板，菌落数为0。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种提高四环素药效的药物组合方法，其特征在于包含以下步骤：
配制四环素：用去离子水配制浓度为20mg/mL的四环素母液，并用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃的冰箱中备用；
配制N-乙酰半胱氨酸：用去离子水配制10mg/mL的N-乙酰半胱氨酸并用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃的冰箱中备用；
配制LB液体培养基：取氯化钠5g、蛋白胨10g、酵母粉5g，加水至1000mL，pH自然，分装后于1.034×105Pa灭菌20min；向固体培养基中添加w/v 1.2％的琼脂粉；半固体培养基中添加w/v 0.5％的琼脂粉；
不含四环素的固体底层平板：灭菌后的LB固体培养基待其冷却至45-55℃后倒入无菌一次性平皿，冷却待用；含四环素的底层固体平板：灭菌后的LB固体培养基待其冷却至45-55℃后向其中加入四环素母液到需要的工作浓度，混匀后倒入无菌一次性平皿，冷却待用；
培养大肠杆菌：按照2％(w/v)接种量接种大肠杆菌培养液至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、180rpm培养至对数期，待用；
大肠杆菌的稀释：取步骤d中培养的大肠杆菌稀释105倍待用；
不含四环素的半固体上层平板：取50μL稀释105倍的大肠杆菌加入到安培瓶中，再向安培瓶中加入5mL灭菌的温度在42-47℃的半固体，摇匀后倒入预先倒好的固体平板上；含四环素的半固体上层平板：取50μL稀释105倍的大肠杆菌加入到安培瓶中，再向安培瓶中加入5mL灭菌的温度在42-47℃的半固体，并在半固体中加入四环素至需要的浓度，摇匀后倒入预先倒好的含相同浓度四环素的固体平板上；
培养计数：将倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h，对菌落进行计数。
实施例2：一种提高四环素药效的药物组合方法，
(1)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板并置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h(双层平板不含四环素)，计数大肠杆菌菌落数，作为对照组。
(2)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板(双层平板中含四环素且上下层浓度一致)。分为4组，每一组双层平板含有的四环素浓度不同，分别为5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并分别计数。
(3)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板(双层平板中含N-乙酰半胱氨酸)，分为3组，每一组双层平板含有的四环素浓度不一致，分别为5mg/L、10mg/L、15mg/L，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并分别计数。
经过上述不同处理后，大肠杆菌的菌落数如下表所示：
表中数据表明10mg/L四环素对大肠杆菌有50％的致死作用，选择的N-乙酰半胱氨酸浓度(5、10、15mg/L)对大肠杆菌生长无明显影响。说明N-乙酰半胱氨酸在实验的浓度单独使用大肠杆菌无明显影响。
实施例3：一种提高四环素药效的药物组合方法，
(1)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板并置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h(双层平板不含四环素)，计数大肠杆菌菌落数，作为对照组。菌落计数结果为59±5。
(2)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板，双层平板中含四环素且上下层浓度一致且为10mg/L，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并计数。菌落计数结果为31±8。
(3)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板，双层平板的上下层都含有N-乙酰半胱氨酸和四环素的组合成分，其组合为5mg/L N-乙酰半胱氨酸+10mg/L四环素)，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并计数。菌落计数结果为8±2。
实施例4：一种提高四环素药效的药物组合方法，
(1)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板并置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h(双层平板不含四环素)，计数大肠杆菌菌落数，作为对照组。菌落计数结果为59±5。
(2)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板，双层平板中含四环素且上下层浓度一致且为10mg/L，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并计数。菌落计数结果为31±8。
(3)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板，双层平板的上下层都含有N-乙酰半胱氨酸和四环素的组合成分，其组合为10mg/L N-乙酰半胱氨酸+10mg/L四环素)，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并计数。菌落计数结果为0。
实施例5：一种提高四环素药效的药物组合方法，
(1)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板并置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h(双层平板不含四环素)，计数大肠杆菌菌落数，作为对照组。菌落计数结果为59±5。
(2)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板，双层平板中含四环素且上下层浓度一致且为10mg/L，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并计数。菌落计数结果为31±8。
(3)对数期的大肠杆菌稀释105倍，取50μL稀释后的大肠杆菌按上述方法倒双层平板，双层平板的上下层都含有N-乙酰半胱氨酸和四环素的组合成分，其组合为15mg/L N-乙酰半胱氨酸+10mg/L四环素)，倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h并计数。菌落计数结果为0。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种提高四环素药效的药物组合方法，其特征在于包含以下步骤：
a.配制四环素：用去离子水配制浓度为20mg/mL的四环素母液，并用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃的冰箱中备用；
b.配制N-乙酰半胱氨酸：用去离子水配制10mg/mL的N-乙酰半胱氨酸并用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃的冰箱中备用；
c.配制LB液体培养基：取氯化钠5g、蛋白胨10g、酵母粉5g，加水至1000mL，pH自然，分装后于1.034×105Pa灭菌20min；向固体培养基中添加w/v 1.2％的琼脂粉；半固体培养基中添加w/v 0.5％的琼脂粉；
d.不含四环素的固体底层平板：灭菌后的LB固体培养基待其冷却至45-55℃后倒入无菌一次性平皿，冷却待用；含四环素的底层固体平板：灭菌后的LB固体培养基待其冷却至45-55℃后向其中加入四环素母液到需要的工作浓度，混匀后倒入无菌一次性平皿，冷却待用；
e.培养大肠杆菌：按照w/v 2％接种量接种大肠杆菌培养液至新鲜的LB液体培养基中，于37℃、180rpm培养至对数期，待用；
f.大肠杆菌的稀释：取步骤d中培养的大肠杆菌稀释105倍待用；
g.不含四环素的半固体上层平板：取50μL稀释105倍的大肠杆菌加入到安培瓶中，再向安培瓶中加入5mL灭菌的温度在42-47℃的半固体，摇匀后倒入预先倒好的固体平板上；含四环素的半固体上层平板：取50μL稀释105倍的大肠杆菌加入到安培瓶中，再向安培瓶中加入5mL灭菌的温度在42-47℃的半固体，并在半固体中加入四环素至需要的浓度，摇匀后倒入预先倒好的含相同浓度四环素的固体平板上；
h.培养计数：将倒好的双层平板置于37℃的恒温培养箱中静置培养36h，对菌落进行计数。
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|---|---|---|---|---|
| WO2008060865A2 (en) * | 2006-11-14 | 2008-05-22 | Matthias Rath | Compositions and methods for reducing antimicrobial resistance of microbes |
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| WO2008060865A2 (en) * | 2006-11-14 | 2008-05-22 | Matthias Rath | Compositions and methods for reducing antimicrobial resistance of microbes |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张亚妮等: "N-乙酰半胱氨酸对铜绿假单胞菌的耐药性及绿脓菌素产量的影响", 《中国药理学通报》 * |
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