CN107568165A - 一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，该方法是将转基因植物经过超低温冷冻研磨后的转基因植物组织粉末加入人工饲料中喂饲蜗牛。本发明还公开了一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法。本发明以经超低温研磨的转基因棉花等转基因植物组织配制成人工饲料在实验室中喂饲蜗牛，并对其各种生理生化指标进行测定，评价转基因植物对蜗牛的影响，与常规饲养方法相比，饲料来源、成分更稳定均一，所获得的实验数据更为准确可靠。

Description

一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法

技术领域

本发明涉及蜗牛养殖领域，具体涉及一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法。

背景技术

蜗牛是一种陆生贝壳类软体动物，生活于灌木丛、矮草丛、农田及住宅附近阴暗潮湿地区，世界各地均有分布。一方面，蜗牛是农业上的一种害虫，觅食范围非常广泛，可危害豆科、十字花科和茄科蔬菜，以及棉、麻、甘薯、禾谷类作物，桑树、果树等树木；农地中的蜗牛食用农作物的叶、茎、芽、花和多汁的果实，可造成叶片穿透状孔洞、断苗、伤残果等，并传播作物病害，危害于蔬菜、花卉、中药材、果树等多种农作物。另一方面，部分蜗牛品种因为营养丰富，味道鲜美，或者外型适合观赏而被大量人工养殖并带来可观的经济效益。

近年来，转基因植物在全球范围内种植规模不断扩大，但是关于其生态环境安全性争议一直存在，多种生物被用来对转基因植物的环境生态安全性进行评价。蜗牛作为一种食谱广泛的植食性生物，很容易在自然条件下直接或间接食用或接触转基因植物。目前不论野生状态下的蜗牛还是人工饲养条件下的蜗牛，其食物来源大多都是植物，所以，评价转基因植物对蜗牛的影响，对于研究转基因植物对非靶标生物影响以及对自然生态环境影响是十分必要的。

目前，尚没有在实验室用转基因植物喂饲蜗牛评价其安全性的报道，且现有的普通饲养方法易受季节影响，秋冬季缺少植物鲜活组织会影响实验尤其是长期实验的进行。

发明内容

技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供了一种采用转基因植物喂饲蜗牛的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明公开了一种采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，该方法是将转基因植物经过超低温冷冻研磨后的转基因植物组织粉末加入人工饲料中喂饲蜗牛。

其中，上述转基因植物为转Bt基因棉花中30或转基因水稻华恢1号，但不局限于以上两种转基因植物，其他转基因植物也适用。

其中，上述超低温冷冻温度为-273℃。

其中，上述转基因植物组织粉末的添加量为饲料总重量的10％-50％。

上述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，具体包括以下步骤：

1)将蜗牛饲养垫料混匀并采用湿热灭菌法灭菌，冷却后调节pH值为5～7，湿度为30～50％，平铺于饲养盒底部，厚度7～10厘米，每盒根据实验需要投放2～10头健康小蜗牛，投放时根据螺层数选择年龄相近的投放，饲养盒以纱布封住，防止蜗牛爬出；

2)将饲养盒置于恒温恒湿箱中进行饲养，在人工饲料中添加不同剂量的经超低温冷冻研磨粉碎后的转基因植物组织粉末饲喂蜗牛，温度20～30℃，空气湿度60％～90％，光照为8～10 小时.

其中，上述步骤1)的蜗牛饲养垫料为人工配制土壤，所述人工配制土壤按质量百分比包括40％黄沙，20％泥炭土和40％高岭土。

其中，上述步骤2)的人工饲料包括玉米粉100g、大豆粉100g、小麦粉100g，酵母粉50g，磷酸氢钙30g，蔗糖20g，复合维生素(烟酰胺1.0g，硫胺素0.25g，核黄素0.50g，吡哆素0.25g，钴胺素0.02g，叶酸0.25g，泛酸钙1.0g，生物素0.02g)，40％浓度的甲醛1ml，加水600ml。

其中，上述步骤2)的饲喂时间为24～72小时。

一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法，该实验方法包括所述的步骤1)和步骤2)，还包括：

步骤3)设置对照组，添加亲本植物组织粉末，喂饲前后分别称重饲料，计算出蜗牛实际摄入的转基因植物重量；

步骤4)以蜗牛的致死率，体重变化，以及体内过氧化物酶和超氧化物歧化酶酶活作为指标，比较处理组与对照组的差异，通过方差分析比较其差异显著性，评价转基因棉花对蜗牛的影响：如果差异显著，表明存在影响；反之，不存在影响。

其中，上述亲本植物组织粉末为亲本中棉所中16或亲本水稻明恢63经超低温冷冻研磨后的植物组织粉末。

有益效果：本发明采用转基因植物喂养蜗牛，该蜗牛的存活率并不受影响，存活率达到 100％。本发明以经超低温研磨的转基因棉花或转基因水稻等转基因植物组织配制成人工饲料在实验室中喂饲蜗牛，并对其各种生理生化指标进行测定，评价转基因植物对蜗牛的影响，与常规饲养方法相比，饲料来源、成分更稳定均一，所获得的实验数据更为准确可靠。

具体实施方式

为进一步说明本发明的详细情况，下面列举若干实施例，但本发明不应受此限制。

实施例1转基因棉花喂饲蜗牛的方法

采用转基因棉花喂饲蜗牛的方法，具体包括以下步骤：

1)将蜗牛饲养垫料混匀并采用湿热灭菌法灭菌，冷却后调节pH值为5，湿度为40％，平铺于饲养盒底部，厚度7～10厘米，每盒根据实验需要投放2～10头健康小蜗牛，投放时根据螺层数选择年龄相近的投放，饲养盒以纱布封住，防止蜗牛爬出；该蜗牛饲养垫料为人工配制土壤，所述人工配制土壤为40％黄沙，20％泥炭土，40％高岭土。

2)将饲养盒置于恒温恒湿箱中进行饲养，在人工饲料中添加不同剂量的经超低温冷冻研磨粉碎后的转Bt基因棉花中棉所30的组织粉末饲喂蜗牛，温度20℃，空气湿度60％，光照为8小时；该人工饲料包括玉米粉100g、大豆粉100g、小麦粉100g，酵母粉50g，磷酸氢钙30g，蔗糖20g，复合维生素(烟酰胺1.0g，硫胺素0.25g，核黄素0.50g，吡哆素0.25g，钴胺素0.02g，叶酸0.25g，泛酸钙1.0g，生物素0.02g)，40％浓度的甲醛1ml，加水600ml。

实施例2转基因水稻喂饲蜗牛的方法

采用转基因水稻喂饲蜗牛的方法，具体包括以下步骤：

1)将蜗牛饲养垫料混匀并采用湿热灭菌法灭菌，冷却后调节pH值为7，湿度为30％，平铺于饲养盒底部，厚度7～10厘米，每盒根据实验需要投放2～10头健康小蜗牛，投放时根据螺层数选择年龄相近的投放，饲养盒以纱布封住，防止蜗牛爬出；该蜗牛饲养垫料为人工配制土壤，所述人工配制土壤为40％黄沙，20％泥炭土，40％高岭土。

2)将饲养盒置于恒温恒湿箱中进行饲养，在人工饲料中添加不同剂量的经超低温冷冻研磨粉碎后的转Bt基因水稻华恢1号的组织粉末饲喂蜗牛，温度30℃，空气湿度90％，光照为 10小时；该人工饲料包括玉米粉100g、大豆粉100g、小麦粉100g，酵母粉50g，磷酸氢钙 30g，蔗糖20g，复合维生素(烟酰胺1.0g，硫胺素0.25g，核黄素0.50g，吡哆素0.25g，钴胺素0.02g，叶酸0.25g，泛酸钙1.0g，生物素0.02g)，40％浓度的甲醛1ml，加水600ml。

实施例3转基因棉花对蜗牛的安全性影响评价

1.1蜗牛品种：野生灰巴蜗牛，采集地：南京；棉花品种：转Bt基因棉花中棉所30(简称中 30)及其亲本中棉所16(中16)。

1.2转基因棉花对蜗牛的安全性影响评价实验：

1.2.1蜗牛短期喂饲实验：(具体的喂饲方法参见实施例1)

以转Bt基因棉花中30及其亲本棉花茎叶经超低温冷冻(-273℃)研磨后加入饲料喂饲蜗牛，每千克饲料中混入棉花茎叶组织细粉100克和200克，阳性对照组喂饲加入蜗克星的饲料。每组设3只螺层数一致，大小重量接近的蜗牛，持续喂饲72小时，分别在24小时、48 小时和72小时监测蜗牛的死亡率。

1.2.2蜗牛长期喂饲实验：(具体的喂饲方法参见实施例1)

以转Bt基因棉花中30及其亲本棉花喂饲蜗牛，每千克饲料中混入棉花茎叶组织细粉200 克，每组设3只重量接近幼贝(3螺层)，分别称量其体重并记录持续喂饲70天，期间每14 天监测一次体重。

1.2.3成年蜗牛取食量实验：

以转Bt基因棉花中30及其亲本棉花喂饲蜗牛，每千克饲料中混入棉花茎叶组织细粉200 克，每组设3只螺层、重量接近成贝(5螺层以上)作为重复，每次喂饲前后对饲料进行称量，计算24小时内蜗牛的取食量。

1.2.4蜗牛SOD酶活测定：

短期喂饲实验结束后，取蜗牛去壳匀浆，检测其体内SOD酶活性。

1.3实验结果

1.3.1添加棉花茎叶组的蜗牛在72小时内，均未出现死亡情况，喂饲加入蜗克星组的蜗牛则全部死亡。

表1蜗牛急性死亡率

1.3.2蜗牛长期喂饲实验：

表2蜗牛长期喂饲体重

注：同一列相同字母表示没有显著性差异

1.3.3蜗牛取食量测定：

结果见下表3，在喂饲转基因棉花及其亲本棉花叶片的蜗牛之间，取食量并没有显著性差异。

表3蜗牛取食量

处理组	单贝平均取食重量(mg)/24h
		中16	626.35±72.93a
中30	657.14±60.15a

注：同一列相同字母表示没有显著性差异

1.3.4蜗牛SOD酶活测定：

结果见下表，在喂饲转基因棉花及其亲本棉花叶片的蜗牛之间，其体内SOD酶活没有显著性差异。

表4蜗牛SOD酶活

处理组	SOD酶活(U/mg)
		中16	2.32±0.47a
中30	2.16±0.51a

注：同一列相同字母表示没有显著性差异

实施例4转基因水稻喂饲蜗牛的安全评价方法

2.1蜗牛品种：野生灰巴蜗牛，采集地：南京；棉花品种：转Bt基因水稻华恢1号(简称华恢1号)及其亲本水稻明恢63(明恢63)。

2.2转基因水稻对蜗牛的安全性影响评价实验：

2.2.1蜗牛短期喂饲实验：(具体的喂饲方法参见实施例2)

以转Bt基因水稻华恢1号及其亲本水稻茎叶经超低温冷冻(-273℃)研磨后加入饲料喂饲蜗牛，每千克饲料中混入水稻茎叶组织细粉100克和200克，阳性对照组喂饲加入蜗克星的饲料。每组设3只螺层数一致，大小重量接近的蜗牛，持续喂饲72小时，分别在24小时、 48小时和72小时监测蜗牛的死亡率。

2.2.2蜗牛长期喂饲实验：(具体的喂饲方法参见实施例2)

以转Bt基因水稻华恢1号及其亲本水稻喂饲蜗牛，每千克饲料中混入水稻茎叶组织细粉 200克，每组设3只重量接近幼贝(3螺层)，分别称量其体重并记录持续喂饲70天，期间每 14天监测一次体重。

2.2.3成年蜗牛取食量实验：

以转Bt基因水稻华恢1号及其亲本水稻喂饲蜗牛，每千克饲料中混入水稻茎叶组织细粉200克，每组设3只螺层、重量接近成贝(5螺层以上)作为重复，每次喂饲前后对饲料进行称量，计算24小时内蜗牛的取食量。

2.2.4蜗牛SOD酶活测定：

短期喂饲实验结束后，取蜗牛去壳匀浆，检测其体内SOD酶活性。

2.3实验结果

2.3.1添加水稻茎叶组的蜗牛在72小时内，均未出现死亡情况，喂饲加入蜗克星组的蜗牛则全部死亡。

表1蜗牛急性死亡率

2.3.2蜗牛长期喂饲实验：

表2蜗牛长期喂饲体重

注：同一列相同字母表示没有显著性差异

2.3.3蜗牛取食量测定：

结果见下表3，在喂饲转Bt基因水稻华恢1号及其亲本水稻叶片的蜗牛之间，取食量并没有显著性差异。

表3蜗牛取食量

注：同一列相同字母表示没有显著性差异

2.3.4蜗牛SOD酶活测定：

结果见下表，在喂饲转Bt基因水稻华恢1号及其亲本水稻叶片的蜗牛之间，其体内SOD 酶活没有显著性差异。

表4蜗牛SOD酶活

处理组	SOD酶活(U/mg)
		明恢63	1.98±0.26a
华恢1号	2.05±0.39a

注：同一列相同字母表示没有显著性差异。

Claims (10)

1.一种采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，该方法是将转基因植物经过超低温冷冻研磨后的转基因植物组织粉末加入人工饲料中喂饲蜗牛。

2.根据权利要求1所述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，所述转基因植物为转Bt基因棉花中30或转基因水稻华恢1号。

3.根据权利要求1所述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，所述超低温冷冻温度为-273℃。

4.根据权利要求1所述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，所述转基因植物组织粉末的添加量为饲料总重量的10%-50%。

5.根据权利要求1所述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将蜗牛饲养垫料混匀并采用湿热灭菌法灭菌，冷却后调节pH值为5~7，湿度为30~50%，平铺于饲养盒底部，厚度7~10厘米，每盒根据实验需要投放2~10头健康小蜗牛，投放时根据螺层数选择年龄相近的投放，饲养盒以纱布封住，防止蜗牛爬出；

2）将饲养盒置于恒温恒湿箱中进行饲养，在人工饲料中添加不同剂量的经超低温冷冻研磨粉碎后的转基因植物组织粉末饲喂蜗牛，温度20～30℃，空气湿度60%～90%，光照为8-10小时。

6.根据权利要求5所述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，所述步骤1）的蜗牛饲养垫料为人工配制土壤，所述人工配制土壤按质量百分比包括40%黄沙，20%泥炭土和40%高岭土。

7.根据权利要求5所述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，所述步骤2）的人工饲料包括玉米粉100g、大豆粉100g、小麦粉100g，酵母粉50g，磷酸氢钙30g，蔗糖20g，复合维生素（烟酰胺1.0g，硫胺素 0. 25g，核黄素 0.50g，吡哆素 0.25g，钴胺素 0.02g，叶酸0.25g，泛酸钙 1.0g，生物素0.02g），40％浓度的甲醛1ml，加水600ml。

8.根据权利要求5所述的采用转基因植物喂饲蜗牛的方法，其特征在于，所述步骤2）的饲喂时间为24~72小时。

9.一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法，其特征在于，该实验方法包括权利要求5~8任一项所述的步骤1）和步骤2），还包括：

步骤3）设置对照组，添加亲本植物组织粉末，喂饲前后分别称重饲料，计算出蜗牛实际摄入的转基因植物重量；

步骤4）以蜗牛的致死率，体重变化以及体内超氧化物歧化酶酶活作为指标，比较处理组与对照组的差异，通过方差分析比较其差异显著性，评价转基因棉花对蜗牛的影响：如果差异显著，表明存在影响；反之，不存在影响。

10.根据权利要求9所述的一种评价转基因植物对蜗牛影响的实验方法，其特征在于，所述亲本植物组织粉末为亲本中棉所中16或亲本水稻明恢63经超低温冷冻研磨后的植物组织粉末。