CN112655655B - 一种评价转基因植物秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和新生蚯蚓发育影响的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评价转基因植物秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和新生蚯蚓发育影响的方法，该方法是将经预处理转基因植物秸秆混合土壤添加到透明培养皿中，将蚓茧放入，可实时观察蚓茧孵化情况，确定新生蚯蚓日龄。在此基础上可获得蚓茧孵化率、每茧孵化新生蚯蚓数量、体重和体内酶学准确数据，避免现有方法只能够获得最终新生蚯蚓数量而无蚓茧孵化率、幼蚓存活率和生长发育数据的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及蚯蚓蚓茧孵化观察和监测领域，具体涉及一种评价转基因植物秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和新生蚯蚓发育影响的方法。
背景技术
蚯蚓是土壤生物中生物量最大的动物类群之一，占土壤无脊椎动物生物量的90％，占土壤动物总量的60％。蚯蚓与耕地中作物秸秆的分解关系更为紧密，蚯蚓通过取食、消化、排泄(蚯蚓粪便)、分泌(粘液)和掘穴等活动促进有机质的分解，促进土壤养分的循环和改善土壤结构和理化性状。在耕地中蚯蚓以作物残留物为食，通过掘穴和取食活动改善土壤和土壤有机质的结构，并且为其他土壤生物改善生物资源，是反映土壤质量的良好指标，相对于其他土壤动物，蚯蚓对有些污染物更敏感，适用于土壤生态风险评价。
近年来，转基因植物在全球范围内种植规模不断扩大，但是关于其生态环境安全性争议一直存在，多种生物被用来对转基因植物的环境生态安全性进行评价。蚯蚓作为土壤环境安全的重要指标生物，是转基因植物生态安全评价的重要对象。目前，已有一些转基因植物秸秆对蚯蚓影响的报道，现有的评价方法是将蚯蚓放置于混有转基因植物秸秆的土壤中，定期观察实验体系中蚯蚓的生存、生长、繁殖等情况。对繁殖影响主要监测指标为蚓茧的数量和新生蚯蚓的数量，正常情况下，一个蚓茧中一般含有1-3枚卵，每枚卵均可孵化成幼蚓，现有方法只是考察了成功孵化并最终成活蚯蚓的数量，而对蚓茧孵化则无法观察。现有方法通过在土壤里翻检用来确定蚓茧的数量和新生蚯蚓的数量，而刚孵化幼蚓幼小体弱，在翻检过程中易遗漏且对幼蚓造成伤害。蚯蚓的幼蚓阶段理论上对外部环境质量最为敏感，而现有方法并不能够对刚孵化的幼蚓进行监测。综上，现有转基因植物秸秆对蚯蚓影响评价方法对蚓茧孵化过程和幼蚓生活状态无法估计，可能影响转基因植物对蚯蚓影响整体评估。
随着我国“转基因生物新品种培育”重大科技专项实施，我国转基因生物的研发和应用规模将越来越大，迫切需要建立可靠的转基因植物生态安全评价方法，特别是针对生态环境中重要的指示物种。本发明针对现有转基因植物秸秆对蚯蚓影响评价方法的不足，设计了可监测蚓茧孵化和幼蚓生活状态的实验方法，完善了转基因植物秸秆对蚯蚓影响评价监测体系，丰富了监测指标。
发明内容
发明目的：针对现有技术不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种既满足蚯蚓蚓茧孵化和生长发育需要，又可实时观察蚓茧孵化情况，确定新生蚯蚓日龄，测定获得更可靠的转基因植物秸秆对蚯蚓繁殖影响数据，避免现有方法的只能够获得最终新生蚯蚓数量而无蚓茧孵化率、幼蚓存活率和生长发育数据的缺陷的评价转基因植物秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和新生蚯蚓发育影响的方法。
技术方案：本发明所述一种评价转基因植物秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和新生蚯蚓发育影响的方法，包括以下步骤：
1)配制人工土壤，并将转基因植物秸秆粉碎，将转基因植物秸秆与配置好的人工土壤混合，并添加去离子水，调节pH值，将混合后的人工土壤放至玻璃容器中。
2)将蚯蚓放入装有混合后的人工土壤的玻璃容器中，用纱布封口并放入人工气候箱中培养。
3)取步骤2)玻璃容器中经蚯蚓处理消化的混合人工土壤即含有转基因植物秸秆成分的蚯蚓土，放入透明培养皿中，培养皿中放置蚓茧，将培养皿放回人工气候箱中培养；
4)每天观察蚓茧孵化情况，记录每粒蚓茧孵化幼蚓数量、幼蚓成活率、生存状态、每隔7天记录幼蚓体重，比较处理组与对照组的差异，评价转基因植物秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和新生蚯蚓发育的影响，所述比较组为转基因植物秸秆组，所述对照组为非转基因植物秸秆组。
其中，步骤1)中，所述人工土壤的成分与质量比为石英砂：高岭土：泥炭藓灰为7:2:1，所述转基因植物秸秆为成熟的转基因植物茎叶(穗)部的总称，所述转基因植物秸秆占转基因植物秸秆和人工土壤质量和的2-10％。
其中，步骤1)中，所述去离子水含量占土壤总重的30％。
其中，步骤1)中，所述pH为6.0-7.0。
其中，步骤2)中，所述蚯蚓为大小一致，健康，带有生殖环的成年蚯蚓。
其中，步骤2)中，所述培养的温度为22±2℃，相对湿度为80±5％。
其中，步骤3)中个，所述含有转基因植物秸秆成分的蚯蚓土为经蚯蚓初步消化的混合人工土壤。
其中，步骤3)中，所述培养皿为透明，皿内平铺2-3层湿润普通滤纸，普通滤纸上铺有3-4mm含有转基因植物秸秆成分的蚯蚓土。
其中，步骤3)中，所述培养皿中放置蚓茧数量1粒/皿。
针对现有技术不足，本发明也可监测蚓茧孵化和幼蚓生活状态，并测定转基因植物秸秆对蚯蚓发育的影响。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下显著优点：
(1)本发明可以直接监测蚓茧孵化情况和新生蚯蚓存活、生存状态，获得更可靠的转基因植物秸秆对蚯蚓繁殖影响数据，避免现有方法只能够获得最终新生蚯蚓数量而无蚓茧孵化率、幼蚓存活率和生长发育数据的缺陷。
(2)利用亲代蚯蚓部分处理消化的土壤来孵化蚓茧，既保证蚓茧孵化和新生蚯蚓生长始终处于含有转基因植物秸秆中，同时提供了稳定蚯蚓土介质，保证蚓茧孵化率和新生蚯蚓成活率。
(3)初孵幼蚓体内生化酶对外界物质敏感，但由于在土壤中幼蚓孵化时间不一，通过外形无法区分，发育时间不确定性导致幼蚓体内生化酶数据不能够用于评价转基因植物秸秆对幼蚓影响，本发明通过透明平皿和薄层土壤可视化监测每条新生蚯蚓准确的孵化时间，并在这一实验装置中单独饲喂，可获得相同日龄幼蚓，测定同一日龄幼蚓体内生化酶的变化，可准确获得转基因植物秸秆对初孵幼蚓体内生化酶活性影响。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步说明。
蚯蚓品种：赤子爱胜蚓，来源：实验室繁殖；
实施例1转基因玉米秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和幼蚓生长情况评价
设置2种处理方式：转基因玉米秸秆处理(DBN9938)和亲本玉米秸秆处理(DBN318)。
取石英砂、高岭土、泥炭藓灰按照质量比为7:2:1进行配置，得到人工土壤。取转基因玉米秸秆50g粉碎后加入到950g人工土壤中，加入去离子水300g混合，使得土壤含水量为30％，调节pH为6.0，将上述混合人工土壤放置于玻璃容器中。向玻璃容器中放入大小一致，健康，带有生殖环的蚯蚓100条，用纱布封口并放入人工气候箱中培养，设定培养温度为22℃，相对湿度为80％。
在35mm玻璃培养皿中放入2-3层滤纸，用去离子水润湿，取培养28天后的玻璃容器中经蚯蚓处理消化的混合人工土壤即含有转基因秸秆成分的蚯蚓土，放入培养皿中约3-4mm。每培养皿放置1粒蚓茧，每次处理20皿，将培养皿放回人工气候箱中培养。
每天观察蚓茧孵化情况，记录每粒蚓茧孵化新生蚯蚓数量、新生蚯蚓成活率、生存状态、每隔7天记录幼蚓体重，并随机选择3条幼蚓，测定幼蚓体内SOD酶活性变化，比较转基因玉米秸秆处理与亲本玉米秸秆处理的差异，评价转基因玉米秸秆对蚓茧孵化和幼蚓生长发育的影响。
亲本玉米秸秆处理和培养方法同转基因玉米秸秆处理和培养方法。
由于蚓茧孵化周期较长，孵化情况共计观察30天进行统计，用平均值加标准偏差表示，具体蚓茧孵化的情况见表1。
表1不同处理组蚓茧孵化的情况
| 处理 | 蚓茧孵化率 | 新生蚓(条/茧) |
| 亲本玉米处理 | 80.00 | 1.94±0.66a |
| 转基因玉米处理 | 85.00 | 1.88±0.68a |
同列相同字母表示无显著差异(P>0.05)
由表1可知，与亲本玉米秸秆处理下蚓茧孵化率相比，转基因玉米秸秆处理下蚓茧孵化率差异不大，每蚓茧孵化新生蚯蚓数量无显著性差异。
在新生蚯蚓孵化后第7、14、21、28分别测定幼蚓体重，对同一日龄幼蚓体重进行显著性分析，用平均值加标准偏差表示，具体结果见表2。
表2不同处理组幼蚓体重变化情况(mg，N＝20)
| 日龄 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 |
| 亲本玉米处理 | 17.23±3.72a | 38.35±4.38a | 61.39±2.57a | 89.61±5.27a |
| 转基因玉米组处理 | 19.46±2.51a | 34.26±5.75a | 65.11±6.36a | 94.39±7.28a |
同列小写字母表示无差异显著(P>0.05)
由表2可知，相对于亲本玉米秸秆处理下幼蚓体重，转基因玉米秸秆处理下幼蚓体重变化无显著性差异。
取7日龄蚯蚓测定体重后，将蚯蚓全组织匀浆，检测其体内SOD酶活性，用平均值加标准偏差表示，具体结果见表3。
表3 7日龄蚯蚓体内SOD酶活性(U/mg)
| 处理 | SOD酶活性 |
| 亲本玉米处理 | 3.56±0.24a |
| 转基因玉米组处 | 3.28±0.41a |
同列小写字母表示无差异显著(P>0.05)
由表3可知，相对于亲本玉米处理下蚯蚓SOD酶活性，转基因玉米秸秆处理下蚯蚓SOD酶活性无显著性差异。
由此可知，转基因玉米秸秆处理对蚓茧孵化情况、幼蚓体重以及幼蚓SOD酶活性相对于亲本玉米处理均无显著性差异。
实施例2不同转基因棉花叶片添加量对蚯蚓蚓茧孵化化和幼蚓生长情况评价
处理方式同实施例1，2种棉花叶片(中30转基因棉花叶片和中16亲本棉花叶片)，每种棉花叶片设置3个剂量添加组2％、5％和10％，每组各20个重复。取石英砂、高岭土、泥炭藓灰按照质量比为7:2:1进行配置，得到人工土壤。取转基因棉花叶片20g粉碎后加入到980g人工土壤中，加入去离子水300g混合，使得土壤含水量为30％，调节pH为7.0，将上述混合人工土壤放置于玻璃容器中。向玻璃容器中放入大小一致，健康，带有生殖环的蚯蚓100条，用纱布封口并放入人工气候箱中培养，设定培养温度为20℃，相对湿度为75％。
在35mm玻璃培养皿中放入2-3层滤纸，用去离子水润湿，取培养28天后的玻璃容器中经蚯蚓处理消化的混合人工土壤即含有转基因秸秆成分的蚯蚓土，放入培养皿中约3-4mm。每培养皿放置1粒蚓茧，每次处理20皿，将培养皿放回人工气候箱中培养。
每天观察蚓茧孵化情况，记录每粒蚓茧孵化幼蚓数量、生存状态、每隔7天记录新生蚓体重，并随机选择3条蚯蚓，测定幼蚓体内SOD酶活性变化。
亲本棉花叶片处理和培养方法同转基因棉花叶片的处理和培养方法。
由于蚓茧孵化周期较长，孵化情况共计观察30天进行统计，具体蚓茧孵化的情况见表4。
表4不同处理组蚓茧孵化率(％)
由表4可知，蚯蚓蚓茧在不同的棉花叶片添加剂量下孵化率相似，转基因棉花处理和亲本棉花处理变化不大。
不同处理组蚓茧孵化新生蚯蚓平均数量，用平均值加标准偏差表示，具体见表5。
表5不同处理组蚓茧孵化新生蚯蚓平均数量(条/茧)
同行大写字母表示无差异显著(P>0.05)；同列小写字母表示无差异显著(P>0.05)
由表5可知，不管转基因棉花处理还是亲本棉花处理，不同的棉花叶片添加剂量对每蚓茧孵化新生蚯蚓数量无显著性差异。
在新生蚓孵化后第7、14、21、28分别测定幼蚓体重，对同一日龄幼蚓体重进行显著性分析，用平均值加标准偏差表示，具体结果见表6。
表6不同处理组幼蚓体重变化(mg，N＝20)
同列小写字母表示无差异显著(P>0.05)
由表6可知，不管转基因棉花处理还是亲本棉花处理，不同叶片添加剂量对幼蚓体重变化无显著性差异。
取7日龄蚯蚓测定体重后，将蚯蚓全组织匀浆，检测其体内SOD酶活性，用平均值加标准偏差表示，具体结果见表7。
表7 7日龄蚯蚓体内SOD酶活性(U/mg，N＝3)
同列小写字母表示无差异显著(P>0.05)
由表7可知，不管转基因棉花处理还是亲本棉花处理，不同的棉花叶片添加剂量对幼蚓SOD酶活性无显著性差异。
由此可知，不同棉花叶片添加剂量对蚓茧孵化情况、幼蚓体重以及幼蚓SOD酶活性相无显著性差异，相同叶片添加剂量下，转基因棉花组和亲本棉花组间蚓茧孵化情况、幼蚓体重以及幼蚓SOD酶活性相无显著性差异。
实施例3转基因杨树叶片对蚯蚓蚓茧孵化和幼蚓生长情况评价
处理方式同实施例1，转cry1Ac基因欧洲黑杨(世纪杨)，对照杨树品种为欧美107杨，收集仍在枝头的完整的枯黄杨树叶片，自然晾干粉碎后备用。取石英砂、高岭土、泥炭藓灰按照质量比为7:2:1进行配置，得到人工土壤。取100g转基因凋落枯黄杨树叶片加入到900g人工土壤中，加入去离子水300g混合，使得土壤含水量为30％，调节pH为6.5，将上述混合人工土壤放置于玻璃容器中。向玻璃容器中放入大小一致，健康，带有生殖环的蚯蚓100条，用纱布封口并放入人工气候箱中培养，设定培养温度为24℃，相对湿度为85％。
在35mm玻璃培养皿中放入2-3层滤纸，用去离子水润湿，取培养28天后的玻璃容器中经蚯蚓处理消化的混合人工土壤即含有转基因秸秆成分的蚯蚓土，放入培养皿中约3-4mm。每培养皿放置1粒蚓茧，每次处理20皿，将培养皿放回人工气候箱中培养。
每天观察蚓茧孵化情况，记录每粒蚓茧孵化幼蚓数量、生存状态、每隔7天记录新生蚯蚓体重，并随机选择3条蚯蚓，测定幼蚓体内SOD酶活性变化。
对照杨树叶片处理和培养方法同转基因杨树叶片的处理和培养方法。
由于蚓茧孵化周期较长，孵化情况共计观察30天进行统计，用平均值加标准偏差表示，具体蚓茧孵化的情况见表8。
表8不同处理组蚓茧孵化的情况
| 处理 | 蚓茧孵化率(％) | 新生蚓(条/茧) |
| 对照杨树处理 | 75.00 | 1.8±0.83a |
| 转基因杨树处理 | 75.00 | 1.53±0.72a |
同列相同字母表示无显著差异(P>0.05)
由表8可知，与对照杨树处理下蚓茧孵化率相比，转基因杨树处理下蚓茧孵化率差异不大，每蚓茧孵化新生蚯蚓数量无显著性差异。
在新生蚯蚓孵化后第7、14、21、28分别测定幼蚓体重，对同一日龄幼蚓体重进行显著性分析，用平均值加标准偏差表示，具体结果见表9。
表9不同处理组幼蚓体重变化(mg，N＝20)
| 日龄 | 7天 | 14天 | 21天 | 28天 |
| 对照杨树处理 | 14.31±2.69a | 29.64±5.23a | 55.79±4.35a | 78.62±6.18a |
| 转基因杨树处理 | 17.52±3.10a | 33.27±4.26a | 59.87±7.11a | 84.53±5.36a |
同列小写字母表示无差异显著(P>0.05)
由表9可知，相对于亲本杨树处理下幼蚓体重，转基因杨树处理下幼蚓体重变化无显著性差异
取7日龄蚯蚓测定体重后，将蚯蚓全组织匀浆，检测其体内SOD酶活性，用平均值加标准偏差表示，具体结果见表10。
表10 7日龄蚯蚓体内SOD酶活性(U/mg，N＝3)
| 处理 | SOD酶活性 |
| 对照杨树处理 | 2.94±0.43a |
| 转基因杨树处理 | 2.76±0.31a |
同列小写字母表示无差异显著(P>0.05)
由表10可知，相对于对照杨树处理蚯蚓SOD酶活性，转基因杨树处理下蚯蚓SOD酶活性无显著性差异。
由此可知，转基因杨树处理对蚓茧孵化情况、幼蚓体重以及幼蚓SOD酶活性相对于对照杨树处理均无显著性差异。
Claims (1)
1.一种评价转基因植物秸秆对蚯蚓蚓茧孵化和新生蚯蚓发育影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）配制人工土壤，并将转基因植物秸秆粉碎，将转基因植物秸秆与配置好的人工土壤混合，并添加去离子水，调节pH值，将混合后的人工土壤放至玻璃容器中；
2）将蚯蚓放入装有混合后的人工土壤的玻璃容器中，用纱布封口并放入人工气候箱中培养；
3）取步骤2）玻璃容器中经蚯蚓处理消化的混合人工土壤即含有转基因植物秸秆成分的蚯蚓土，放入透明培养皿中，培养皿中放置蚓茧，将培养皿放回人工气候箱中培养；
4）每天观察蚓茧孵化情况，记录每粒蚓茧孵化新生蚯蚓数量、幼蚓成活率、生存状态、每隔7天记录幼蚓体重，比较处理组与对照组的差异，评价转基因植物秸秆对蚓茧孵化和新生蚯蚓发育的影响，所述处理组为转基因植物秸秆组，所述对照组为非转基因植物秸秆组；
步骤1）中，所述人工土壤的成分为石英砂、高岭土、泥炭藓灰，其质量比为7:2:1，所述转基因植物秸秆占转基因植物秸秆和人工土壤质量和的2-10%；所述去离子水含量占人工土壤总重的30%；所述pH为6.0-7.0；
步骤2）中，所述蚯蚓为大小一致，健康，带有生殖环的成年蚯蚓；所述培养的温度为22±2℃，相对湿度为80±5%；
步骤3）中，所述含有转基因植物秸秆成分的蚯蚓土为经蚯蚓初步消化的混合人工土壤；所述培养皿为透明，皿内平铺2-3层湿润普通滤纸，普通滤纸上铺有3-4mm含有转基因植物秸秆成分的蚯蚓土，所述培养皿中放置蚓茧数量1粒/皿。
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