CN109937971A - 人工饲养蠼螋的方法及其在转基因植物环境安全评价上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人工饲养蠼螋的方法，以及该方法在转基因植物环境影响评价中的应用。本发明以创新性的人工饲料和人工土壤饲养革翅目昆虫蠼螋，并根据各品种蠼螋的食性不同建立两套喂饲方法：（1）人工饲料直接喂饲植食性或杂食性蠼螋；（2）低龄棉铃虫或黄粉虫幼虫喂饲捕食性或杂食性蠼螋。使用该方法饲养的蠼螋可以正常生长，发育，繁殖。且与其它昆虫饲养方法相比，该方法蠼螋取食率高，生长活跃，繁殖力强。之后我们将该方法应用于转基因植物的安全性评价研究，使用转基因植物组织添加进人工饲料喂饲蠼螋，以蠼螋的体重、体长和存活率作为指标，比较转基因组与亲本组的差异，通过方差分析比较其差异显著性，评价了转基因作物对蠼螋的影响。

Description

人工饲养蠼螋的方法及其在转基因植物环境安全评价上的 应用

技术领域

本发明涉及蠼螋养殖领域，具体涉及人工饲养蠼螋的方法及其在转基因植物环境安全评价上的应用。

背景技术

蠼螋是革翅目昆虫的通称，革翅目是昆虫纲中较小的一目，全世界已知2028种，含79 化石种，大多分布于热带和亚热带地区，自温带至寒带种类逐渐减少。革翅目昆虫喜温暖、潮湿的环境条件，属于不完全变态昆虫，体形狭长而平扁，头部属前口式，口器属于咀嚼式，具翅或无翅，有翅者前翅短、革质，后翅大部膜质，伸展时似扇形，尾须发达，雄性成虫的尾须常呈铗形或钳形，食性因种类不同而异，有植物性、捕食性或杂食性等，少数种类营寄生生活，寄生于蝙蝠、啮齿类动物。李时珍曾以“蠼螋喜伏氍氍下，故名”，叙述此类昆虫的习性及名称的由来。

蠼螋由于翅不发达，飞翔力不强，它们白天喜隐藏于阴暗潮湿处所，所以他们的分布有一定的局限性，尤其垂直分布的限度更为严格，因此常是动物地理学研究的重要材料。产卵后的雌性蠼螋常像母鸡抱窝似的孵育其卵，甚至还护养解化出的若虫，这种突出的护仔现象，在整个昆虫世界中也属不多见的行为特性。某些种类蠼螋是农田中常见的捕食性天敌昆虫，具有对环境的适应性强、寿命相对较长、捕食害虫种类多、虫态范围广等特点，有巨大的应用潜力。根据室内测定，可以捕食46种昆虫，可捕食多种害虫：小地老虎、棉铃虫、棉小造桥虫、鼎点金刚钻、斜纹夜蛾、红铃虫、短额负蝗、棉蚜等。另有少数种类也会危害农作物如玉米，菇类等，因此，蠼螋也成为研究转基因作物环境安全性的重要非靶标生物。

目前国内对蠼螋的研究不多，没有相应的人工饲养技术，以蠼螋作为非靶标动物研究转基因作物环境安全性的方法和技术也是空白。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种人工饲养蠼螋的方法并将其应用于转基因植物环境安全评价。

本发明以蠼螋为实验对象，发明了一种可以在室内以人工饲料和土壤饲养蠼螋的方法，并以此方法对转基因作物进行安全性评价。

技术方案：本发明提供了一种人工饲料，按重量份数包括如下组分：小麦粉150-250份、草菇粉50-150份、牛肉膏30-70份、蛋白胨30-70份、酵母粉30-70份、海藻糖20-40份、琼脂10-20份、维生素C 4-8份、复合维生素B 0.5-1.5份、山梨酸1-3份、对羟基苯甲酸甲酯1-3份、40％浓度的甲醛3-7份、水800～1200份。

作为优选，按重量份数包括如下组分：小麦粉200-250份、草菇粉100～150份、牛肉膏 50～100份、蛋白胨50～100份、酵母粉50～100份、海藻糖30份、琼脂15份、维生素C 6份、复合维生素B 1份、山梨酸2份、对羟基苯甲酸甲酯2份、40％浓度的甲醛5份，水1000份。

作为进一步优选，按重量份数包括如下组分：小麦粉200份、草菇粉100份、牛肉膏50 份、蛋白胨50份、酵母粉50份、海藻糖30份、琼脂15份、维生素C 6份、复合维生素B 1 份、山梨酸2份、对羟基苯甲酸甲酯2份、40％浓度的甲醛5份，水1000份。

本发明内容还包括所述的人工饲料在饲养蠼螋方面及在转基因植物环境安全评价中的应用。

本发明内容还包括一种人工饲养蠼螋方法，所述饲养蠼螋条件为：饲养垫料为灭菌后人工配制土壤，所述人工配制土壤按质量百分比80％粗黄沙与20％珍珠岩配制而成，新配制的土壤用水浸泡24h，之后滤去水份进行高压湿热灭菌，灭菌后烘干备用。

其中，当饲养植食性蠼螋或杂食性蠼螋时，将所述的人工饲料饲喂蠼螋；当饲养捕食性蠼螋或杂食性蠼螋时，挑选健康棉铃虫或黄粉虫初孵幼虫饲养蠼螋。

其中，所述饲料条件还包括：先将单只蠼螋幼虫在大玻璃试管中饲养，土壤加至三分之一处，水平放置，幼虫成熟后配对后放入1-2L大玻璃烧杯内饲养，土层厚度为1-2cm，每天光暗比为12：12，光照度为20-40LX，土壤湿度以喷淋至中层土壤湿润为准，空气湿度50％-70％。

其中，当饲养植食性蠼螋或杂食性蠼螋时，所述喂养方法还包括将粉碎后的转基因植物组织加入所述的人工饲料饲喂蠼螋，当饲养捕食性蠼螋或杂食性蠼螋时，以转基因植物组织饲喂棉铃虫或黄粉虫初孵幼虫，24h后挑选健康幼虫饲养蠼螋。

本发明内容还包括所述的人工饲养方法在转基因植物环境安全评价上的应用。

其中，所述应用包括将转基因水稻或转基因棉花喂饲蠼螋幼虫观察水稻或转基因棉花对蠼螋的影响。

其中本发明的具体的饲养方法包括：

1)人工土壤的制备：按质量比80％粗黄沙(粒径0.3-0.5mm左右)，20％珍珠岩配制，新配制的土壤许用水浸泡24h，之后滤去水份进行灭菌，灭菌后烘干备用；

2)人工饲料的制备：小麦粉150g-250g，草菇粉50g-150g，牛肉膏30g-70g，蛋白胨30g-70g，酵母粉30g-70g，海藻糖20g-40g，琼脂10g-20g，维生素C 4g-8g，复合维生素B0.5g-1.5g，山梨酸1g-3g，对羟基苯甲酸甲酯1g-3g，40％浓度的甲醛 3ml-7ml，加水至1000ml，搅拌混匀后高压湿热灭菌，冷却凝固后置于冰箱备用。

3)采用灭菌后的人工土壤作为饲养垫料，单只蠼螋幼虫在大玻璃试管中饲养，土壤加至三分之一处，水平放置，幼虫成熟后配对后放入宽大透明容器内饲养，土层厚度为1-2cm。每天光暗比为12∶12，光照度为20-40LX，如条件不具备可以用黑纱遮蔽容器，营造弱光环境，以便观察蠼螋活动。土壤湿度以喷淋至中层土壤湿润为准，空气湿度50％-70％；将人工饲料置于小片滤纸上放入饲养容器，每天定时更换人工饲料和滤纸。

本发明在进行转基因植物安全评价时，将转基因植物茎叶或种子粉碎后按20g/100g 饲料(根据植物自然种植条件下落入土中残体量计算)比例混入人工饲料，喂饲蠼螋幼虫28天。每天更换新鲜饲料，14天更换一次培养土，每天定时记录蠼螋的体重，体长和存活情况。

有益效果：本饲养方法针对蠼螋的食性特点，创新性的加入了草菇粉，牛肉膏，蛋白胨和海藻糖，较之常规昆虫饲料，蠼螋取食率大大增加，存活率和繁殖率也保持良好。草菇为自然条件下蠼螋喜爱的食物。牛肉膏和蛋白胨提供了丰富的碳氮源以及蠼螋喜爱的气味。海藻糖为昆虫几丁质合成初始物质，较之常规使用的蔗糖和葡萄糖更加适合几丁质需求量较大的蠼螋。本发明的土壤配方也不同于常规人造土壤，只使用粗黄沙和珍珠岩，结构较常规土壤更为疏松，不易板结，利于蠼螋活动和筑巢。

具体实施方式

为进一步说明本发明的详细情况，下面列举若干实施例，但本发明不应受此限制。

实施例1人工饲料与常规饲料的比较

人工饲料的制备：小麦粉200g，草菇粉100g，牛肉膏50g，蛋白胨50g，酵母粉50g，海藻糖30g，琼脂15g，维生素C 6g，复合维生素B 1g，山梨酸2g，对羟基苯甲酸甲酯2g， 40％浓度的甲醛5ml，加水至1000ml。搅拌混匀后高压湿热灭菌，冷却凝固后置于冰箱备用。

人工土壤的制备：按质量比80％粗黄沙(粒径0.3-0.5mm左右)，20％珍珠岩配制，新配制的土壤许用水浸泡24h，之后滤去水份进行灭菌，灭菌后烘干备用。

常规饲料配方：

每份人工饲料包括200g的玉米粉、100g的黄豆粉、50g的饲料级酵母粉、40g的白糖、 2g的复合维生素B、2.0g的山梨酸钾、6g的饲料级VC、2.0g的对羟基苯甲酸甲酯、700g的水、1g的棉籽油、1ml的37％～40％浓度的甲醛。

常规土壤配方：70％黄沙，20％高岭土，10％泥炭土。

使用本发明人工饲料和其它昆虫的常规饲料相比较，监测饲养28天后的体重，体长和存活情况，之后继续饲养并择期配对繁殖，饲养至90天，比较新生幼虫数量。

表1不同饲养方法蠼螋生长情况

注：表内数据为平均值±标准误差。同行中字母相同表示处理间在0.05水平差异不显著

表2不同饲养方法新生蠼螋幼虫情况

处理组	人工饲料+人工土壤	常规饲料+常规土壤
			幼虫数	25.33±4.50a	0b

注：表内数据为平均值±标准误差。同行中字母相同表示处理间在0.05水平差异不显著

由表1结果可见，使用本发明饲料和土壤饲养的蠼螋在28天的饲养过程中，无论在体长还是体重方面都要显著优于常规饲养方法。表2结果则表明，在长期传代饲养过程中，使用本发明饲料和土壤饲养的蠼螋可以正常的繁殖传代，而使用常规饲料和土壤的蠼螋在相同时间内则没有繁殖后代。

实施例2转高产基因水稻OsX-1(表达OsX基因和G10evo-epsps蛋白)喂饲蠼螋，评价其对蠼螋的影响。

1)人工土壤的制备：按质量比80％粗黄沙(粒径0.3-0.5mm左右)，20％珍珠岩配制，新配制的土壤许用水浸泡24h，之后滤去水份进行灭菌，灭菌后烘干备用；

2)人工饲料的制备：小麦粉200g，草菇粉100g，牛肉膏50g，蛋白胨50g，酵母粉50g，海藻糖30g，琼脂15g，维生素C 6g，复合维生素B 1g，山梨酸2g，对羟基苯甲酸甲酯2g，40％浓度的甲醛5ml，加水至1000ml。搅拌混匀后高压湿热灭菌，冷却凝固后置于冰箱备用。

3)采用灭菌后的人工土壤作为饲养垫料，单只蠼螋幼虫在大玻璃试管中饲养，土壤加至三分之一处，水平放置，幼虫成熟后配对后放入宽大透明容器内饲养，土层厚度为1-2cm。每天光暗比为12：12，光照度为20-40LX，如条件不具备可以用黑纱遮蔽容器，营造弱光环境，以便观察蠼螋活动。土壤湿度以喷淋至中层土壤湿润为准，空气湿度50％-70％；其中，喂饲植食性蠼螋或杂食性蠼螋时，以人工饲料为基础，将粉碎后的转基因水稻OsX-1的组织粉末按20g/100g饲料加入，饲喂蠼螋，将人工饲料置于小片滤纸上放入饲养容器，每天定时更换人工饲料和滤纸。

4)转基因植物为转基因水稻OsX-1(表达OsX基因和G10evo-epsps蛋白)，对照水稻为其亲水稻本秀水134。蠼螋幼虫统一选取体长、体重接近的个体，每处理组3只， 3次重复。

5)将转基因水稻种子粉碎后混入人工饲料，喂饲蠼螋幼虫28天。每天更换新鲜饲料， 14天更换一次培养土，每天定时记录蠼螋的活动和存活情况。

表3不同处理组蠼螋生长情况

注：表内数据为平均值±标准误差。同行中字母相同表示处理间在0.05水平差异不显著

由表3结果看出，直接喂饲添加水稻组织粉末的人工饲料的蠼螋，其在体重，体长及存活率上转基因组与对照组均没有显著性差异，同时喂饲期间蠼螋均保持正常生长，说明了该人工饲养方法的可行性。

实施例3转基因抗虫棉中棉所30喂饲棉铃虫后，对捕食性蠼螋的影响

1)人工土壤的制备：按质量比80％粗黄沙(粒径0.3-0.5mm左右)，20％珍珠岩配制，新配制的土壤许用水浸泡24h，之后滤去水份进行灭菌，灭菌后烘干备用；

2)采用灭菌后的人工土壤作为饲养垫料，单只蠼螋幼虫在大玻璃试管中饲养，土壤加至三分之一处，水平放置，幼虫成熟后配对后放入宽大透明容器内饲养，土层厚度为1-2cm。每天光暗比为12：12，光照度为20-40LX，如条件不具备可以用黑纱遮蔽容器，营造弱光环境，以便观察蠼螋活动。土壤湿度以喷淋至中层土壤湿润为准，空气湿度50％-70％；喂饲捕食性蠼螋或杂食性蠼螋时，以转棉花叶片喂饲棉铃虫，24h后挑选健康幼虫喂饲蠼螋。

3)转基因植物为转基因棉花中棉所30(表达Bt蛋白)，对照棉花为其亲本中棉所16。蠼螋幼虫统一选取体长、体重接近的个体，每处理组3只，3次重复。

4)以新鲜棉叶饲喂棉铃虫初孵幼虫，待棉铃虫幼虫进食24h后，挑选健康幼虫饲喂蠼螋，一直持续28天。每天更换新的棉铃虫幼虫，并清理棉铃虫残体，14天更换一次培养土，每天定时记录蠼螋的活动和存活情况。

表4不同处理组捕食性蠼螋生长情况

注：表内数据为平均值±标准误差。同行中字母相同表示处理间在0.05水平差异不显著。

由表4结果看出，喂饲取食棉叶后棉铃虫幼虫的蠼螋，其在体重，体长及存活率上转基因棉花组与对照棉花组均没有显著性差异，同时喂饲期间蠼螋均保持正常生长，说明了该人工饲养方法的可行性。

Claims (10)

1. 一种人工饲养，其特征在于，按重量份数包括如下组分：小麦粉150-250份、草菇粉50-150份、牛肉膏30-70份、蛋白胨30-70份、酵母粉30-70份、海藻糖20-40份、琼脂10-20份、维生素C 4-8份、复合维生素B 0.5-1.5份、山梨酸1-3份、对羟基苯甲酸甲酯1-3份、40％浓度的甲醛3-7份、水800~1200份。

2.根据权利要求1所述的人工饲养，其特征在于，按重量份数包括如下组分：小麦粉200-250份、草菇粉100~150份、牛肉膏50~100份、蛋白胨50~100份、酵母粉50~100份、海藻糖30份、琼脂15份、维生素C 6份、复合维生素B 1份、山梨酸2份、对羟基苯甲酸甲酯2份、40％浓度的甲醛5份，水1000份。

3.根据权利要求1所述的人工饲养，其特征在于，按重量份数包括如下组分：小麦粉200份、草菇粉100份、牛肉膏50份、蛋白胨50份、酵母粉50份、海藻糖30份、琼脂15份、维生素C 6份、复合维生素B 1份、山梨酸2份、对羟基苯甲酸甲酯2份、40％浓度的甲醛5份，水1000份。

4.权利要求1~3任一项所述的人工饲料在饲养蠼螋方面及在转基因植物环境安全评价中的应用。

5.一种人工饲养蠼螋方法，其特征在于，所述饲养蠼螋条件为：饲养垫料为灭菌后人工配制土壤，所述人工配制土壤按质量百分比80%粗黄沙与20%珍珠岩配制而成，新配制的土壤用水浸泡24h，之后滤去水份进行高压湿热灭菌，灭菌后烘干备用。

6.根据权利要求5所述的人工饲养蠼螋方法，其特征在于，当饲养植食性蠼螋或杂食性蠼螋时，将权利要求1~3任一项所述的人工饲料饲喂蠼螋；当饲养捕食性蠼螋或杂食性蠼螋时，挑选健康棉铃虫或黄粉虫初孵幼虫饲养蠼螋。

7.根据权利要求5或6所述的人工饲养蠼螋方法，其特征在于，所述饲料条件还包括：先将单只蠼螋幼虫在大玻璃试管中饲养，土壤加至三分之一处，水平放置，幼虫成熟后配对后放入1-2L大玻璃烧杯内饲养，土层厚度为1-2cm，每天光暗比为12：12，光照度为20-40LX，土壤湿度以喷淋至中层土壤湿润为准，空气湿度50%-70%。

8.根据权利要求5或6所述的人工饲养蠼螋方法，其特征在于，当饲养植食性蠼螋或杂食性蠼螋时，所述饲喂方法还包括将转基因植物与人工饲料混合进行饲喂。

9.权利要求5~8任一项所述的人工饲养方法在转基因植物环境安全评价上的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括将转基因水稻或转基因棉花喂饲蠼螋幼虫观察转基因水稻或转基因棉花对蠼螋的影响。