CN107556378A - 利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法 - Google Patents
利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107556378A CN107556378A CN201710992460.0A CN201710992460A CN107556378A CN 107556378 A CN107556378 A CN 107556378A CN 201710992460 A CN201710992460 A CN 201710992460A CN 107556378 A CN107556378 A CN 107556378A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lymph node
- antibody
- artificial lymph
- cell
- immune
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法。本发明的方法为：将包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料移植到供体小鼠体内，经过目标抗原的免疫后，得人工淋巴结；将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；分离出获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。本发明的方法将人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，获得阳性克隆的效率更高，大大提高抗体的生产效率，节省了成本。
Description
技术领域
本发明属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法。
背景技术
哺乳动物的免疫系统是最万能的生物系统，因为可以产生超过多个抗体特异性。在个体动物中，存在至少5,000-10,000个能够产生独特抗体的不同B-细胞克隆。此外，由于抗体多样性产生过程中体细胞突变的过程，本质上可以产生无限数量的独特抗体分子。实际上，当前的生物和医学研究中有许多是针对开发这个库(repertoire)。抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，尤其是单克隆抗体，由于其高度均一、针对某一特定抗原表位，因此，广泛用于免疫学分析、放射免疫显像和免疫导向治疗等领域。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲的特征，既能像骨髓瘤细胞一样在体外培养中无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来个单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody)，简称单抗。但是这一技术的主要缺点就是体外筛选过程中，由于能分泌特异性抗体的B淋巴细胞只占极少数，因而效率较低，耗费大量的人力物力。
人工淋巴结技术在2007年日本科学家Takeshi Watanabe发现的，在不具备免疫原性的生物材料上包被基质细胞和树突状细胞(DC cells)，再将包被好的材料移植到小鼠肾盂囊下，经过抗原免疫后，这些生物材料会形成包含分泌抗体的B细胞的小结节，即所谓人工淋巴结(Artificial lymph nodes)。这项技术可以使那些本来缺乏或者丧失免疫功能的小鼠重新获得部分或者全部的免疫功能，因而有着很大的应用前景。
目前还没有将这一技术用于生产单克隆抗体。因此开发一种利用这一人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合的生产方法，就能大大提高抗体的生产效率，缩短抗体生产时间。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，本发明的方法将人工淋巴结技术与杂交瘤细胞技术相结合，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，获得阳性克隆的效率更高，大大提高抗体的生产效率，节省了成本。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
1)人工淋巴结的制备；
2)将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；
3)分离出步骤2)获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。
本发明的方法将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠的体内，由于免疫缺陷型小鼠缺乏免疫性，这些移植的人工淋巴结就能够在免疫缺陷小鼠体内大量扩增，生产出大量的能产生针对特异性抗原的抗体的B淋巴细胞，大大提高抗体的生产效率，缩短抗体生产时间。人工淋巴结包含了数量巨大的针对特异性抗原的B淋巴细胞，因而在与骨髓瘤细胞融合后获得阳性克隆的效率更高，可以不必像传统方法那样通过大批量的筛选才能获得阳性克隆，从而节省了人力与物力成本。
进一步，步骤1)中人工淋巴结的制备为：将包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料移植到小鼠体内，经过目标抗原的免疫后，得人工淋巴结。
作为一种优选，包被到生物材料上的细胞浓度为1×107/ml。
所述生物材料为天然生物材料或合成的可生物降解材料；所述天然生物材料包括但不仅限于胶原、聚糖以及生物衍生材料；所述合成的可生物降解材料包括但不仅限于聚酯类、聚乙二醇类以及聚氨基酸类。
作为一种优选，所述包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料直径约为50-300um。
进一步，步骤1)中生物材料的移植为移植到小鼠肾盂囊下。
在不具备免疫原性的生物材料上包被基质细胞和树突状细胞(DC cells)，再将包被好的材料移植到小鼠肾盂囊下，经过抗原免疫后，这些生物材料会形成包含分泌抗体的B细胞，即所谓人工淋巴结(Artificial lymph nodes)。
进一步，步骤1)中的小鼠为BALB/c小鼠；经过目标抗原的免疫分4次完成。
作为一种优选，BALB/c小鼠3-6月龄，经过目标抗原免疫，每2周免疫一次，一共免疫4次。
进一步，免疫前三次免疫的途径选自皮下、肌肉、腹腔或静脉注射的任一方法，最后一次加强免疫选择腹腔注射或静脉注射。
作为一种优选，免疫前三次免疫的途径为皮下注射，最后一次加强免疫选择腹腔注射。
步骤1)中小鼠经过免疫后，大量产生特异性抗体的B淋巴细胞会在结节处聚集并扩增，即形成了一层由产生特异性抗体的B淋巴细胞包裹的人工淋巴结。
进一步，步骤2)中免疫缺陷型小鼠为SCID小鼠。所述SCID小鼠为6-8周龄SCID小鼠。
进一步，步骤2)中人工淋巴结的移植为移植到免疫缺陷小鼠的肾脏。
进一步，步骤2)中人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内后分两次给予目标抗原免疫刺激，18～25天后分离产生的B淋巴细胞。
作为一种优选，步骤2)中人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠肾脏后，在移植后的第1天和第7天，分别给移植后的受体小鼠注射目标抗原加强免疫效果，在移植21天后，取出免疫缺陷小鼠的脾脏，分离产生的B淋巴细胞。
分离B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在PEG的作用下融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。
由于免疫缺陷小鼠体内有经过初次免疫过的人工淋巴结，这些人工淋巴结在经过二次免疫时，产生B淋巴细胞和记忆细胞的速度和反应更大，因而能产生非常多的针对目标抗原的B淋巴细胞。分离出这些B淋巴细胞后，即可进行有效地细胞融合和单克隆细胞筛选。
进一步，所述方法还包括步骤：4)将步骤3)中筛选的产生特异性抗体的单克隆细胞经扩增、重悬后计数，注射入小鼠腹腔产生腹水，纯化后得单克隆抗体。
获得产生特异性抗体的单克隆细胞后，扩增，待细胞长至足够的量时，收取细胞，用无血清培养基重悬后计数，按照一定数量注射入小鼠腹腔，产生腹水后即可纯化单克隆抗体。
进一步，所述注射入小鼠腹腔的单克隆细胞的浓度为1×107～1×108/ml，每只小鼠的注射量为0.08～0.12ml。
作为一种优选，所述注射入小鼠腹腔的单克隆细胞的浓度为1×108/ml，每只小鼠的注射量为0.1ml。
由于人工淋巴结技术获得的B淋巴细胞超过99％都是能产生特异性抗体的细胞，因而之后的筛选过程更加快速，基本上每轮筛选都会呈现阳性。在经过3轮筛选之后，将融合细胞按1×108/ml，每只小鼠0.1ml的量注射小鼠腹腔，产生腹水后收集腹水，纯化即可获得单克隆抗体。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的方法采用的人工淋巴结包含了数量巨大的针对特异性抗原的B淋巴细胞，因而在与骨髓瘤细胞融合后获得阳性克隆的效率更高，这种方法可以不必像传统方法那样通过大批量的筛选才能获得阳性克隆，从而节省了人力与物力成本。
2)本发明的方法中在获得人工淋巴结后，这些淋巴结可以随时取出用于移植，有免疫活性的B淋巴细胞移植保持在动物体内，保证了无菌、无热源的状态，避免了在传统方法在细胞培养、冻存及复苏过程中的细胞污染问题。
3)本发明的方法人工淋巴结移植到受体小鼠体内，由于受体小鼠是免疫缺陷型，因而不会对非特异抗原产生反应，从而避免了传统方法漫长的动物饲养过程中其它非特异抗原造成的干扰。
附图说明
图1为一实施方式的人工淋巴结技术生产单克隆抗体的流程图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，具体流程见图1。
1.人工淋巴结的制备
生物材料即生物折叠材料可用胶原自行包被，也可商品化购买，货号为KOKEN(CS-35)，大小直径约为50-300um；在生物材料上包被基质细胞和树突状细胞(DC cells)，细胞包被到生物材料上的浓度为1×107/ml。细胞包被的生物材料上后，于37℃，5％CO2中培养5-7天后植入6-8周龄BABL/c雌性小鼠肾盂囊下。移植过程具体操作步骤为：
1)受体小鼠在体外消毒后，用麻醉剂腹腔注射麻醉，受体小鼠麻醉后，皮肤采用70-75％消毒酒精棉擦拭消毒。
2)受体小鼠消毒后，于操作台上用眼科剪暴露腹侧皮肤，于背侧位置找到呈豆状的肾脏，左右各一，将肾脏用眼科剪剪出一个约0.1-0.3cm的小口，将已经包被好细胞的生物材料(结节)埋入肾脏下，并小心缝合，一般一个肾脏可种植3-4个结节。术后严格消毒，缝合好皮肤，精心饲养1-2周。
4)经过种植结节的小鼠恢复1-2周后，用目标抗原免疫小鼠，免疫过程与传统方式相同，即将目标抗原100mg与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀，乳化完全后注射小鼠。初次免疫后每隔两周用50mg抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合均匀，乳化完全后免疫小鼠，一共进行4次免疫。前三次免疫的途径选用皮下注射，最后一次加强免疫一般选择腹腔注射。
小鼠经过免疫后，ELISA检测血液中阳性目标抗体，大量产生特异性抗体的B淋巴细胞会在结节处聚集并扩增，即形成了一层由产生特异性抗体的B淋巴细胞包裹的人工淋巴结。经免疫并ELISA检测血液中有阳性目标抗体
2.人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内
人工淋巴结形成后，移植到6-8周龄雌性SCID小鼠体内，具体操作为：
1)供体小鼠在体外消毒后，用麻醉剂腹腔注射麻醉。所述麻醉剂选用三溴甲醇、戊巴比妥钠或其它麻醉剂。
2)供体小鼠麻醉后，皮肤采用70-75％消毒酒精棉擦拭消毒。
3)供体小鼠消毒后，于操作台上用眼科剪暴露腹侧皮肤，于背侧位置找到呈豆状的肾脏，左右各一。之前接种了人工淋巴结，因而可见肾脏接种部位有白色的结节，小心用眼科剪将这些结节取下，保存于培养液中，所述培养液为常用细胞培养基，这里选用DMEM基础培养基。取下的人工淋巴结作为移植到受体小鼠的材料。
4)受体小鼠在体外消毒后，用麻醉剂腹腔注射麻醉。
5)受体小鼠消毒后，于操作台上用眼科剪暴露腹侧皮肤，于背侧位置找到呈豆状的肾脏，左右各一。小心将肾脏用眼科剪剪出一个约0.1-0.3cm的小口。将从供体小鼠上取下的人工淋巴结埋入肾盂囊下，并小心缝合。一个肾脏科种植3-4个人工淋巴结。术后严格消毒，缝合好皮肤，精心饲养1-2周。
6)受体免疫缺陷小鼠用同种目标抗原免疫1-2次，免疫方法同上，获得表达目标抗体的B淋巴细胞，之后即可后续细胞融合实验。
由于免疫缺陷小鼠体内有经过初次免疫过的人工淋巴结，这些人工淋巴结在经过二次免疫时，产生B淋巴细胞和记忆细胞的速度和反应更大，因而能产生非常多的针对目标抗原的B淋巴细胞。分离出这些B淋巴细胞后，即可进行有效地细胞融合和单克隆细胞筛选。
3.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合
获得产生特异性抗体的B淋巴细胞后，与骨髓瘤细胞进行融合，这里与传统的方法一致，即在PEG的作用下，使两种细胞融合。但是由于通过人工淋巴结技术，这些B淋巴细胞基本都是能产生特异性抗体的B淋巴细胞，因而大大提高了获得阳性融合细胞的概率，从而缩短整个抗体生产的流程。
4.融合细胞筛选后生产抗体
获得产生特异性抗体的单克隆细胞后，扩增，待细胞长至足够的量时，收取细胞，用无血清培养基重悬后计数，按照一定数量注射入小鼠腹腔，产生腹水后即可纯化单克隆抗体。由于人工淋巴结技术获得的B淋巴细胞超过99％都是能产生特异性抗体的细胞，因而之后的筛选过程更加快速，基本上每轮筛选都会呈现阳性。在经过3轮筛选之后，将融合细胞按1×108/ml，每只小鼠0.1ml的量注射入6-8周龄雌性BABL/c小鼠腹腔，产生腹水后收集腹水，纯化即可获得单克隆抗体。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)人工淋巴结的制备；
2)将人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内，给予目标抗原免疫刺激，获得表达目标抗体的B淋巴细胞；
3)分离出步骤2)获得的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得产生特异性抗体的单克隆细胞，得单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中人工淋巴结的制备为：将包被了基质细胞和树突状细胞的生物材料移植到小鼠体内，经过目标抗原的免疫后，得人工淋巴结。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中生物材料的移植为移植到小鼠肾盂囊下。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中的小鼠为BALB/c小鼠；经过目标抗原的免疫分4次完成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，免疫前三次免疫的途径选自皮下、肌肉、腹腔或静脉注射的任一方法，最后一次加强免疫选择腹腔注射或静脉注射。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中免疫缺陷型小鼠为SCID小鼠。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中人工淋巴结的移植为移植到免疫缺陷小鼠的肾脏。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中人工淋巴结移植到免疫缺陷型小鼠体内后分两次给予目标抗原免疫刺激，18～25天后分离产生的B淋巴细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：4)将步骤3)中筛选的产生特异性抗体的单克隆细胞经扩增、重悬后计数，注射入小鼠腹腔产生腹水，纯化后得单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述注射入小鼠腹腔的单克隆细胞的浓度为1×107～1×108/ml，每只小鼠的注射量为0.08～0.12ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710992460.0A CN107556378A (zh) | 2017-10-23 | 2017-10-23 | 利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710992460.0A CN107556378A (zh) | 2017-10-23 | 2017-10-23 | 利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107556378A true CN107556378A (zh) | 2018-01-09 |
Family
ID=60986986
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710992460.0A Pending CN107556378A (zh) | 2017-10-23 | 2017-10-23 | 利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107556378A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117343892A (zh) * | 2023-09-28 | 2024-01-05 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种人工淋巴结原基的构建方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423523A (zh) * | 1999-11-17 | 2003-06-11 | 罗切斯特大学 | 来自人体内的免疫系统 |
| EP1970444A1 (en) * | 2005-12-12 | 2008-09-17 | Riken | Method for production of antigen-specific hybridoma using artificial lymph node with good efficiency |
| CN103613667A (zh) * | 2013-11-02 | 2014-03-05 | 宁夏大学 | 甘草酸酶联免疫检测技术 |
-
2017
- 2017-10-23 CN CN201710992460.0A patent/CN107556378A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423523A (zh) * | 1999-11-17 | 2003-06-11 | 罗切斯特大学 | 来自人体内的免疫系统 |
| EP1970444A1 (en) * | 2005-12-12 | 2008-09-17 | Riken | Method for production of antigen-specific hybridoma using artificial lymph node with good efficiency |
| CN103613667A (zh) * | 2013-11-02 | 2014-03-05 | 宁夏大学 | 甘草酸酶联免疫检测技术 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117343892A (zh) * | 2023-09-28 | 2024-01-05 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种人工淋巴结原基的构建方法及应用 |
| CN117343892B (zh) * | 2023-09-28 | 2024-04-19 | 中山大学孙逸仙纪念医院 | 一种人工淋巴结原基的构建方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Spitz et al. | Intrasplenic primary immunization for the production of monoclonal antibodies | |
| EP0014519B1 (en) | Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies | |
| öSTBERG et al. | Human X (mouse X human) hybridomas stably producing human antibodies | |
| JPH0789909B2 (ja) | ハイブリドーマセルラインの製造法 | |
| EP0038642B1 (en) | A monoclonal antibody against hepatitis b and its production, a hybridoma producing the monoclonal antibody and compositions containing it, the propagation of the hybridoma and the monoclonal antibody for use as an antiviral agent against hepatitus b and in isolating hepatitus b surface antigen from a sample | |
| CN111848779B (zh) | 一种鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体及其应用 | |
| CN105801701B (zh) | 一种pcsk9抗体的重链和轻链可变区及其应用 | |
| DE3245665A1 (de) | Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung | |
| Gigliotti et al. | Reproducible production of protective human monoclonal antibodies by fusion of peripheral blood lymphocytes with a mouse myeloma cell line | |
| CN101885774B (zh) | 去氢甲睾酮单克隆抗体、制备方法及其应用 | |
| CN107556378A (zh) | 利用人工淋巴结技术生产单克隆抗体的方法 | |
| CN105039262B (zh) | 破伤风类毒素单克隆抗体及其应用 | |
| CN105462934B (zh) | 用于提高杂交瘤细胞克隆数量的添加剂及其制备方法 | |
| CN101671655B (zh) | 一种艾滋病毒p24的单克隆抗体杂交瘤细胞及应用 | |
| CN105132376B (zh) | 一个能特异性识别HBsAg多个抗原表位的单克隆抗体及其应用 | |
| JPS60203186A (ja) | ヒト−ヒトハイブリド−マ | |
| CN104789535B (zh) | 抗美沙酮代谢物eddp杂交瘤细胞株及其制备方法和应用 | |
| Letchworth | Methods for production of monoclonal antibodies | |
| CN102391993A (zh) | 布鲁氏菌检测用杂交瘤细胞株17c8及其产生的单克隆抗体 | |
| Groves et al. | The production and application of non-rodent monoclonal antibodies in veterinary science | |
| CN105334324B (zh) | 无乳链球菌单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| CN108330101A (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体和应用 | |
| ENRIQUEZ et al. | Increased proportion of antigen-specific antibody-producing hybridomas following an in vitro immunization with in vivo immunized mouse spleen cells | |
| JPH04500003A (ja) | ブタ多クローン性抗体および単クローン性抗体 | |
| Richman et al. | Heterotransplantation of human prostatic adenoma cells, MA160, into nonimmunosuppressed hamsters |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180109 |