CN107535504A

CN107535504A - 1,3,4‑噻二唑类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用

Info

Publication number: CN107535504A
Application number: CN201710845900.XA
Authority: CN
Inventors: 崔紫宁; 陶辉; �田�浩; 向绪稳; 姜珊; 张炼辉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2037-09-19
Also published as: CN107535504B

Abstract

本发明公开了1,3,4‑噻二唑类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用。该类化合物的结构通式如式I所示。该通式化合物对hpa1启动子活性具有明显的抑制作用。部分化合物还能够在不影响水稻白叶枯病菌正常生长的情况下，对其关键毒力因子T3SS有明显抑制效果，因而可以更好地应用于水稻白叶枯病害的防治。

Description

1,3,4-噻二唑类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用

技术领域

本发明属于杂环化合物应用领域，特别涉及1,3,4-噻二唑类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用。

背景技术

近年来，随着对生物活性好且结构新颖的杂环类化合物更深入的研究，越来越多的研究者们投入到对各种杂环化合物的设计与合成研究中。其中，对1,3,4-噻二唑的研究越来越多，许多1,3,4-噻二唑类化合物在农药中得以商品化并投入使用。

(1)农用杀菌剂

1,3,4-噻二唑类杀菌剂敌枯唑和敌枯双(Bis-ADTA)等曾经是防治水稻难治病害—水稻白叶枯病的特效药剂，但是由于存在严重的致畸作用以及日益严重的抗药性问题而被禁用。后来有报道，在敌枯双的5位引入巯基后所得的化合物无不良的毒副作用，同时保持了其对水稻白叶枯病的防治效果。噻枯唑(Bismerthiazol)就是这样一个衍生物，其作为杀菌剂，具有内吸和保护作用，己经被广泛用于防治水稻白叶枯病，是我国在国际上首创的新型杀菌剂。

目前中国市场上常见的噻二唑类杀菌剂主要有1998年浙江龙湾化工有限公司创制的高效低毒内吸性杀菌剂噻菌铜(thiodiazole-copper，龙克菌)、噻枯唑(Bismerthiazol)、噻菌茂(青枯灵)、噻唑锌(thiodiazole-zinc)、噻森铜等，因其具有优良的杀菌特性，以及低毒、低残留、持效期长的特点使他们在植物真菌细菌病害防治方面广泛使用。

2001年，浙江新农化工有限公司发明专利介绍了一类噻二唑金属络合物的制备方法及其用于防止农作物细菌性病害的有机金属噻二唑类农用杀菌剂。该类杀菌剂均为2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑金属络合物。其中噻唑锌(thiodiazole-zinc)为其自主研发的新一代高效低毒噻二唑有机锌杀菌剂。用来防治农作物细菌性病害，对水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病有特效。

(2)除草剂

Kai等人在敌枯唑2,5位进行衍生化，得到五个系列化合物，其中一个系列表现出良好的除草活性，当5位为叔丁基取代时，活性最好。化合物1和2是其中除草活性最好的两个。化合物1由Elanco公司在1974年开发，商品名为：特丁噻草隆(Tebuthiuron)。Nuesslein等人将特丁噻草隆中的叔丁基换为乙基磺酰基，发现其在5kg/ha的浓度下，对白芥、甜菜、番茄和谷子的种子完全抑制，该化合物在1973年由德国拜耳公司开发，商品名为：磺噻隆(Ethidimuron)。

含1,3,4-噻二唑环的化合物有很多具有除草活性，已经商品化的除草剂有噻氟隆(Thiazfluron)、特丁噻草隆(Tebuthiuron)、磺噻隆(Ethidimuron)等。

吴厚斌等合成的同时包含两种杂环的化合物3和4，二者表现出了对稗草、反枝觅、油菜和苜蓿较好的抑制活性。化合物3对稗草、反枝觅、油菜和苜蓿的抑制率分别为45.3％，87.0％，60.8％和78.4％。徐彦军等以化合物3为先导，将具有典型除草活性的二芳醚结构引入1,3,4-噻二唑中，设计合成了衍生物5，除草活性实验结果表明，该类衍生物具有一定的除草活性，但是远低于先导化合物3。从而说明吡啶环2-位上的氯原子可能对维持该类化合物的除草活性是必需的。

(3)杀虫剂

李兴海等人报道的含1,3,4-噻二唑环苯甲酰脲类化合物6在普筛浓度下具有较好的杀虫活性。经过研究发现，噻二唑环上的R₂为供电子基团时活性较好，R₂为H时无活性，可见基团R₂对化合物的活性有较大的影响。苯环上R₁为2,6-di-F时，对淡色库蚊活性较好，当R₁为2-Cl时对桃蚜活性较好，当R₁为3-CH₃时对粘虫有较好的活性。车超等人研究发现吡啶取代的1,3,4-噻二唑衍生物7杀虫活性较高，在2000μg/mL浓度下施药3天后对棉铃虫的杀死率达90％。柴兵与曹松等将哒嗪酮引入1,3,4-噻二唑，发现该类衍生物8和9具有优良的杀虫活性与昆虫生长调节活性。

发明内容

本发明的目的在于提供1,3,4-噻二唑类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用，更具体地，是提供S-(5-取代-1,3,4-噻二唑)-(5-取代苯基)-2-呋喃硫代甲酸酯类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用，该化合物具有良好的生物活性，可以用于水稻白叶枯病T3SS活性抑制剂。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

1,3,4-噻二唑类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用，所述1,3,4-噻二唑类化合物具有如式I所示结构：

所述R₁基为一个或多个，所述R₁基为氢、卤素、硝基、羟基、碳原子数为1～4的烷基或烷氧基，R₂基为氢、碳原子数为1～3的烷基。

作为一种优选方案，所述R₁基为氢、4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-氯基、4-溴基、3-甲基、4-甲基、2-氟基、3-氟基、4-氟基、2，4-二氟基、2，6-二氟基、2-硝基、3-硝基或4-硝基；R₂基为氢、碳原子数为1～3的直链烷基。

作为一种优选方案，R₂基为氢或甲基。

作为一种优选方案，R₂基为氢时，R₁基为氢、4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-溴基、3-甲基、4-甲基、2-氟基、3-氟基、4-氟基、2，4-二氟基、2，6-二氟基、2-硝基、3-硝基或4-硝基。

作为一种优选方案，所述R₂基为氢时，所述R₁基为4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-甲基、2-氟基、2，6-二氟基、2-硝基或4-硝基。

作为一种优选方案，R₂基为甲基时，R₁基为2-氯基、3-氯基、3-甲基、2-氟基、4-氟基、2，4-二氟基、2，6-二氟基或2-硝基。

作为一种优选方案，所述R₂基为甲基时，所述R₁基为2-氯基或2，6-二氟基。

所述S-(5-取代-1,3,4-噻二唑)-(5-取代苯基)-2-呋喃硫代甲酸酯类化合物作为水稻白叶枯病T3SS活性抑制剂的应用。

更突出地，所述S-(5-取代-1,3,4-噻二唑)-(5-取代苯基)-2-呋喃硫代甲酸酯类化合物作为水稻白叶枯病菌中毒力因子T3SS抑制剂，且不影响水稻白叶枯病菌的生长。

本发明所述化合物的制备方法简单，产率高，经实验证明，其对水稻白叶枯病菌有较好的防效。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开一种S-(5-取代-1,3,4-噻二唑)-(5-取代苯基)-2-呋喃硫代甲酸酯类化合物具有良好的生物活性，可以用于水稻白叶枯病T3SS活性抑制剂。部分化合物还能够在不影响水稻白叶枯病菌正常生长的情况下，对其关键毒力因子T3SS有明显抑制效果，因而可以更好地应用于水稻白叶枯病害的防治，本发明拓展了五元氮杂环类结构在筛选T3SS抑制剂方面的应用前景。

附图说明

图1为小分子化合物存在条件下PXO99^A在丰富培养基M210及贫瘠培养基XOM2中的生长曲线。

图2为小分子化合物在IR24幼苗上对Xoo T3SS产生water soaking症状的影响，图中，从左至右分别为：DMSO，接种野生型菌液(WT)，DMSO+WT，H5，H6，H8，H9，H12，H13。

图3为小分子化合物在IR24幼苗上对Xoo T3SS产生water soaking症状的影响，图中，从左至右分别为：DMSO，接种野生型菌液(WT)，DMSO+WT，H14，H15，H21，H24。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1：S-1,3,4-噻二唑-5-(4-氯苯基)-2-呋喃硫代甲酸酯(H-4)与S-(5-甲基-1,3,4-噻二唑)-5-(4-氯苯基)-2-呋喃硫代甲酸酯(H-23)的制备

在装有温度计的50mL三口烧瓶中加入15mmol 1,3,4-噻二唑-2-硫醇(或者5-甲基-1,3,4-噻二唑-2-硫醇)与10mL二氯甲烷，室温下加入含15mmol氢氧化钠的10％(wt.)溶液，控制滴加速度，使温度保持在室温。待其完毕后，滴加含有7.5mmol 5-(4-氯苯基)-2-呋喃甲酰氯的二氯甲烷溶液。控制滴加速度，使两者同时加完。滴加完毕，慢慢升温至50℃，在50℃反应3～10h。反应完毕后，过滤，去除沉淀，旋蒸滤液以去除溶剂，得到淡黄色固体。用硅胶柱(洗脱剂为V石油醚/V乙酸乙酯＝3/1)分离得到H-4化合物，收率：68％；或者分离得到H-23化合物，收率：73％。

按照实施例1类似的方法，仅将式I所示化合物中的R₁、R₂按照表1所示进行替换，得到相应的式I所示产物。上述化合物的外观、质谱及元素分析数据均列于表1中。由上可知，上述化合物结构正确，均为式I所示化合物。

表1式I所示化合物的理化常数及元素分析数据

实施例2式I所示化合物对水稻白叶枯T3SS抑制活性

供试病原菌种：Xoo野生型菌株PXO99^A及相应的突变体菌株(hpa1inPXO99^A)，主要引发水稻白叶枯病。供试化合物浓度：10μg/mL。1、实验操作：水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)抑制剂的筛选

基于各种不同报告基因的高通量筛选是目前用于筛选T3SS抑制剂的通用方法，其中绿色荧光蛋白(GFP)报告基因结合流式细胞术是常用的筛选系统之一。本研究利用Xoo中的hpa1(harpin蛋白)启动子区域构建的基于GFP报告基因筛选系统。hpa1的表达受到T3SS诱导培养基XOM2的诱导，并且是被hrpX调控的。共筛选了30种化合物，确定了21种化合物对hpa1启动子活性的抑制率超过60％，之后通过检测这21种化合物对菌株生长的影响，发现其中10个化合物对Xoo的各个生长阶段都没有抑制作用，被鉴定为Xoo的T3SS抑制剂。

(1)供试化合物对hpa1基因启动子活性测试

将Xoo的突变体菌株(hpa1in PXO99^A)在PSA平板上划线活化，2-3天后挑取单菌落置于M210液体培养基，加入头孢和氨苄，生长至OD₆₀₀约为2.0，按照1:100转接至新鲜的M210培养基中，生长至OD₆₀₀约为0.6，离心收集菌体，XOM2培养基洗菌体一次，之后重悬于XOM2培养基中，加入头孢和氨苄，调节OD₆₀₀至0.3，加入小分子至终浓度10μg/mL，等体积DMSO作为溶剂对照，每个处理3个重复，28℃，200r/min处理15h，离心收集菌体0.01mol/L PBS(pH＝7.4)缓冲液重悬菌体，调节OD₆₀₀约为0.1，流式细胞仪检测GFP平均荧光强度(MFI)。

(2)对hpa1基因启动子有抑制作用的化合物对Xoo野生型菌株PXO99^A生长的影响

分别测定丰富培养基M210和T3SS诱导培养基XOM2中小分子化合物存在条件下对Xoo野生型菌株PXO99^A的生长曲线。由于XOM2是贫瘠培养基，PXO99^A在其中几乎不生长，因此补充了0.5％蔗糖作为碳源。将Xoo野生型菌株PXO99^A在PSA平板上划线活化，2-3天后挑取单菌落置于M210液体培养基，加入头孢，生长至OD₆₀₀约为2.0，离心收集菌体，无菌水洗菌体一次，之后重悬于M210或者XOM2中，调节OD₆₀₀为0.1。分别加入10μg/mL小分子，置于96孔板上，等体积DMSO作为溶剂对照，每处理设置3个重复。设置温度为28℃，全自动生长曲线仪测定。每1h读取一次数据，共测定72h。该试验独立重复3次。

(3)Xoo接种方法

幼苗：PXO99^A菌株于M210培养基中培养至OD₆₀₀约为2.0，离心收集菌体，无菌水重悬菌体，并调节OD₆₀₀至为0.8，分别加入10μg/mL的小分子化合物，等体积DMSO作为对照，28℃处理2h。之后用一个无针头注射器接种于培养两周的Xoo感病水稻品种IR24上，每片剑叶的中部接种一个样品，每个样品接种10片叶片，接种后继续置于温室培养，72h后拍照观察water soaking现象。

2、结果和分析

(1)供试化合物对hpa1基因启动子活性测试

实验结果显示大部分化合物对hpa1启动子活性具有强烈的抑制作用，抑制率均超过60％，见表2：

表2Xoo T3SS抑制剂的FACS筛选结果

DMSO％＝MFI(化合物)/MFI(DMSO)

选取对hpa1启动子活性的抑制率超过60％的21种化合物进行生长曲线的测定。丰富培养基和模拟植物环境的XOM2培养基中Xoo的72h生长曲线。与DMSO对照相比较，在Xoo生长的迟缓期、对数期和稳定期，10种小分子化合物(H-5、H-6、H-8、H-9、H-12、H-13、H-14、H-15、H-21和H-24)均没有表现出对其生长的明显抑制作用，另外11种化合物对Xoo生长都具有不同程度的影响，具体结果见图1。

(3)Xoo接种结果

幼苗：在感病水稻品种IR24幼苗上，Xoo可以产生水渍状的病斑(water soaking)，10种T3SS抑制剂处理在不同程度上减轻了water soaking症状(图2、图3)。

综合以上生物活性结果，H-5、H-6、H-8、H-9、H-12、H-13、H-14、H-15、H-21和H-24对水稻白叶枯病菌的T3SS具有很好的抑制作用，在防治水稻白叶枯病方面有良好的应用前景。

Claims

1.1,3,4-噻二唑类化合物在防治水稻白叶枯病中的应用，其特征在于，所述1,3,4-噻二唑类化合物具有如式I所示结构：

所述R₁基为一个或多个，所述R₁基为氢、卤素、硝基、羟基、碳原子数为1～4的烷基或烷氧基；R₂基为氢、碳原子数为1～3的烷基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述R₁基为氢、4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-氯基、4-溴基、3-甲基、4-甲基、2-氟基、3-氟基、4-氟基、2,4-二氟基、2,6-二氟基、2-硝基、3-硝基或4-硝基；R₂基为氢、碳原子数为1～3的直链烷基。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，R₂基为氢或甲基。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，R₂基为氢时，R₁基为氢、4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-溴基、3-甲基、4-甲基、2-氟基、3-氟基、4-氟基、2,4-二氟基、2,6-二氟基、2-硝基、3-硝基或4-硝基。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述R₂基为氢时，所述R₁基为4-甲氧基、2-氯基、3-氯基、4-甲基、2-氟基、2,6-二氟基、2-硝基或4-硝基。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，R₂基为甲基时，R₁基为2-氯基、3-氯基、3-甲基、2-氟基、4-氟基、2,4-二氟基、2,6-二氟基或2-硝基。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述R₂基为甲基时，所述R₁基为2-氯基或2,6-二氟基。

8.根据权利要求2～7任一项所述的应用，其特征在于，所述1,3,4-噻二唑类化合物是作为水稻白叶枯病菌中毒力因子T3SS抑制剂。

9.根据权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述1,3,4-噻二唑类化合物作为水稻白叶枯病菌中毒力因子T3SS抑制剂，且不影响水稻白叶枯病菌的生长。