CN107530382A - 防龋剂和防龋组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新防龋剂，其无副作用，因此还可以在对寡糖和糖醇高度敏感的人中获得防龋作用。还提供一种用于预防牙周病或用于治疗牙周病的药剂，其具有预防或治疗牙周病的作用并且其不具有副作用。本发明涉及一种包含双歧杆菌的防龋剂和防龋组合物、包含双歧杆菌的用于预防牙周病的药剂和组合物以及包含双歧杆菌的用于治疗牙周病的药剂和组合物。

Description

防龋剂和防龋组合物
技术领域
本发明涉及一种含有双歧杆菌的防龋剂和防龋组合物。
背景技术
当生活在口腔中的生龋细菌如变异链球菌(Streptococcus mutans)摄取食物和饮料中含有的生龋碳水化合物(如蔗糖、果糖和葡萄糖)，以及产生酸，并且酸溶解牙齿表面的釉质和齿质时，会发生龋齿。
牙齿表面的釉质和齿质的主要组分是羟基磷灰石和氟磷灰石。这些物质通过生龋细菌所产生的酸的活性来分解，并且释放磷酸根离子和钙离子(去矿化)。
同时，口腔中唾液中的钙离子和磷酸根离子并入釉质表面中，并且去矿化的部分重结晶(再矿化)。
在每一餐中，口腔中反复进行去矿化和再矿化，并且通常呈平衡状态。在平衡被打乱时产生龋齿。
作为预防龋齿的方式，已知使用具有防龋活性的寡糖、糖醇等。在专利文件1中，使用帕拉金糖醇(palatinit)作为非生龋寡糖，其不被变异链球菌消耗。专利文件2公开了一种或两种或多于两种选自木糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇和肌醇的糖醇，并且描述糖醇具有防龋活性。
[相关技术文件]
[专利文件]
[专利文件1]JP-A-2000-281550
[专利文件2]JP-A-11-12143
发明内容
[本发明待解决的问题]
然而，在一些人中，因为肠敏感性的个体差异，以上寡糖和糖醇容易引起腹泻、脱水等，因此存在寡糖或糖醇不能提供给这些人的问题。
因此，本发明的一个目的在于提供一种新防龋剂，其无副作用，因此还可以在对寡糖和糖醇高度敏感的人中获得防龋作用。
本发明的另一个目的在于提供一种用于预防牙周病或用于治疗牙周病的药剂，其具有预防或治疗牙周病的作用并且其无副作用。
[解决问题的方式]
本发明者集中于属于双歧杆菌(Bifidobacterium)细菌属的细菌(即双歧杆菌)作为新防龋剂的候选者。双歧杆菌被称为出于营养与细菌学两者的观点有用的肠道细菌，因为双歧杆菌具有如下作用，如改善腹泻、改善便秘、预防或治疗机会性细菌感染和病原微生物感染、抑制有害肠道细菌的生长、产生B族维生素以及通过分解乳糖促进消化和吸收。此外，已知双歧杆菌对宿主肠道免疫系统具有作用、对过敏具有改善作用等。
通过深入研究，本发明者发现双歧杆菌本身具有防龋作用，并且实现了本发明。本发明者还发现双歧杆菌本身具有预防或治疗牙周病的作用。
因此，本发明为如下。
1.一种防龋剂，其包含双歧杆菌。
2.根据以上条目1所述的防龋剂，其中所述双歧杆菌是双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。
3.根据以上条目1或2所述的防龋剂，其中所述双歧杆菌是双歧双歧杆菌OLB6378菌株(登记号：NITE BP-31)。
4.根据以上条目1至3中任一项所述的防龋剂，其中所述双歧杆菌为经过热处理的细胞的形式。
5.根据以上条目1至4中任一项所述的防龋剂，其中以108个细胞/天以上的量连续使用所述双歧杆菌四周或更久。
6.一种防龋组合物，其包含根据以上条目1至5中任一项所述的防龋剂。
7.根据以上条目6所述的防龋组合物，其还包含分散剂。
8.根据以上条目7所述的防龋组合物，其中所述分散剂是糊精。
9.根据以上条目6至8中任一项所述的防龋组合物，其为防龋食物组合物。
10.根据以上条目6至8中任一项所述的防龋组合物，其为防龋药物组合物。
11.一种口服制剂，其包含根据以上条目10所述的防龋组合物。
12.一种包装体，其包含根据以上条目6至10中任一项所述的防龋组合物和包装材料，其中所述防龋组合物被包装在所述包装材料中。
13.一种用于预防牙周病的药剂或用于治疗牙周病的药剂，其包含双歧杆菌。
14.一种防龋剂、用于预防牙周病的药剂或用于治疗牙周病的药剂，其包含双歧杆菌。
15.双歧双歧杆菌OLB6378菌株(登记号：NITE BP-31)，其已经被热处理。
[本发明的优势]
在本发明中，发现双歧杆菌具有防龋作用，因此有可能提供含有双歧杆菌并且无副作用的新防龋剂或防龋组合物。
此外，因为发现双歧杆菌具有预防或治疗牙周病的作用，所以有可能提供用于预防牙周病或用于治疗牙周病的新药剂，其含有双歧杆菌并且无副作用；或用于预防牙周病或用于治疗牙周病的新组合物，其含有双歧杆菌并且无副作用。
具体实施方式
下文详细地说明了本发明。
本发明涉及一种含有双歧杆菌的防龋剂或防龋组合物。
本发明还涉及一种用于预防牙周病或用于治疗牙周病的含有双歧杆菌的药剂；或用于预防牙周病或用于治疗牙周病的含有双歧杆菌的组合物。
在本说明书中，除非另外特别指出，否则防龋剂、用于预防牙周病的药剂和用于治疗牙周病的药剂被统称为“本发明的药剂”，并且防龋组合物、用于预防牙周病的组合物和用于治疗牙周病的组合物被统称为“本发明的组合物”。
<双歧杆菌>
用于本发明的双歧杆菌是一种属于双歧杆菌属的细菌，并且用于本发明的双歧杆菌的种类和来源不受限制。具体来说，双歧杆菌的实例包括双歧双歧杆菌、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)以及嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)。
双歧双歧杆菌菌株的一个特定实例是双歧双歧杆菌OLB6378菌株(登记号：NITEBP-31)。长双歧杆菌菌株的实例包括长双歧杆菌第7号菌株(登记号：FERM BP-11242)和长双歧杆菌OLB6290菌株(登记号：NITE P-75)。有可能使用这些菌株提供本发明的药剂。
申请者将这些菌株保藏在国家技术评估研究院(National Institute ofTechnology and Evaluation)(NITE专利微生物保藏机构(NITE Patent MicroorganismsDepositary))或国家高级工业科技研究院(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)(国际专利生物体保藏机构(InternationalPatent Organism Depositary))。下文描述详细说明所保藏的菌株的内容。
申请者将双歧双歧杆菌OLB6378菌株保藏在以下条件下。
(1)保藏机构的名称：
国家技术评估研究院，NITE专利微生物保藏机构
(2)联系方式：
2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba 292-0818(目前的地址：122,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba 292-0818)
电话号码：0438-20-5580
(3)登记号：
NITE BP-31
(4)识别指示：
双歧双歧杆菌OLB6378
(5)最初保藏日期：
2004年10月26日
(6)依据布达佩斯条约(Budapest Treaty)转移至国际保藏机构的日期：
2006年1月18日。
申请者将长双歧杆菌第7号菌株保藏在以下条件下。
(1)保藏机构的名称：
国家高级工业科技研究院，国际专利生物体保藏机构(目前的保藏机构名称：国家技术评估研究院，NITE专利微生物保藏机构)
(2)联系方式：
Central 6,1-1-1Higashi,Tsukuba,Ibaraki 305-8566
电话号码：029-861-6029
(目前的联系方式：
120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba 292-0818
电话号码：0438-20-5910)
(3)登记号：
FERM BP-11242
(4)识别指示：
长双歧杆菌第7号
(5)最初保藏日期：
1993年4月20日
(6)依据布达佩斯条约转移至国际保藏机构的日期：
2010年3月2日。
申请者将长双歧杆菌OLB6290菌株保藏在以下条件下。
(1)保藏机构的名称：
国家技术评估研究院，NITE专利微生物保藏机构
(2)联系方式：
2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba 292-0818(目前的地址：122,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba 292-0818)
电话号码：0438-20-5580
(3)登记号：
NITE P-75
(4)识别指示：
长双歧杆菌OLB6290
(5)保藏日期：
2005年2月3日。
双歧双歧杆菌OLB6378菌株、长双歧杆菌第7号菌株和长双歧杆菌OLB6290菌株具有以下真菌学特性。
双歧双歧杆菌OLB6378菌株是革兰氏阳性的绝对厌氧杆状细菌，其从人婴儿粪便分离出。当在37℃下在厌氧条件下使用AnaeroPack·Kenki(三菱气体化学制造)在BL琼脂(荣研化学株式会社)平板上培养此细菌48小时时，形成不透明的圆形半球状光滑的菌落。
此外，通过使用双歧双歧杆菌特异性引物(第8届肠道菌群研讨会，肠道微菌群的分子生态学检测和鉴定，光岗知足和松木隆宏)进行PCR来获得PCR产物，具体地，BiBIF-1：CCA CAT GAT CGC ATG TGA TT(SEQ ID NO:1)和BiBIF-2：CCG AAG GCT TGC TCC CAA A(SEQ ID NO:2)，其是16S rRNA区域中的种特异性引物。该菌株还能够发酵半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖以及龙胆二糖。
长双歧杆菌第7号菌株是革兰氏阳性的绝对厌氧细菌，其从成人粪便分离出并且是杆状或有分枝的多态细菌。该菌株不形成孢子并且无运动性。当在37℃下通过钢丝棉法在BL琼脂(荣研化学株式会社)平板上培养此细菌48小时时，形成不透明的圆形半球状光滑的菌落。该菌株能够发酵阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖以及松三糖。
长双歧杆菌OLB6290菌株是革兰氏阳性的绝对厌氧杆状细菌，其从人婴儿粪便分离出并且不形成孢子。已经证实通过PCR使用16S rRNA区域中的以下种特异性引物来获得PCR产物：BiLON-1：TTC CAG TTG ATC GCA TGG TC(SEQ ID NO:3)和BiLON-2：GGG AAG CCGTAT CTC TAC GA(SEQ ID NO:4)。该菌株能够发酵阿拉伯糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖以及松三糖。
一般用作双歧杆菌培养基的培养基可以用于培养本发明的菌株。也就是说，可以用于本发明的培养基不受特别限制，并且可以使用任何培养基，只要该培养基含有预定量的主要碳源以及氮源、无机物和其它营养即可。
作为碳源，可以视所用菌株的同化作用而使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等。作为氮源，可以使用含有机氮的化合物，如酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物以及大豆蛋白水解物。此外，使用肉提取物、鱼提取物、酵母提取物等作为生长刺激物。
培养优选在厌氧条件下进行，并且可以使用已知方法，如在吹碳化气的同时培养菌株的方法。菌株还可以使用另一种方法培养，例如在微需氧条件下使用常用的液体静置培养方法或在分批培养条件下进行。培养温度是25至50℃，特别优选35至42℃。然而，本发明的培养温度不限于所述温度，并且还可以使用另一种温度条件，只要菌株可以在该温度下生长即可。
在培养期间，培养基的pH值优选保持在6.0至7.0，但也可以使用另一种pH条件，只要菌株可以在该pH值下生长即可。培养时间优选是3至48小时，更优选8至24小时，特别优选10至20小时，但也可以采用另一培养时间，只要菌株可以在该培养时间内生长即可。
本发明的药剂(防龋剂、用于预防牙周病的药剂和用于治疗牙周病的药剂)或本发明的组合物(防龋组合物、用于预防牙周病的组合物和用于治疗牙周病的组合物)含有双歧杆菌，并且本发明者发现双歧杆菌是具有防龋作用以及预防牙周病和治疗牙周病的作用的组分，即活性成分。
本发明的药剂或组合物中可以含有所得细菌细胞作为通过以下处理获得的经过处理的双歧杆菌产品。经过处理的双歧杆菌产品的实例包括培养后不进行任何其它处理的培养物；培养后进行离心或过滤的培养物，即其浓缩物；进一步处理成糊剂的培养物；通过各种方法获得的干燥产品(喷雾干燥产品、冷冻干燥产品、真空干燥产品、转鼓式干燥产品等)；其中细胞分散于培养基中的液体；使用稀释剂获得的稀释的产品；经过热处理的产品(经过热处理的细胞)；通过用紫外线和/或辐射处理获得的经过光处理的产品(经过光处理的细胞)；通过用化学品(杀菌剂、抗细菌剂或抑菌剂)处理获得的用化学方法处理的产品(用化学方法处理的细胞)；以及通过用研磨机粉碎干燥产品获得的粉碎的产物等。
离心、过滤、浓缩、粉碎等通过常用方法进行。干燥方法可以例如通过真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥或转鼓式干燥进行。培养基、稀释剂、化学品(杀菌剂、抗细菌剂或抑菌剂)等可以是被适当选择并且使用的已知物质。
在本说明书中，这种经过处理的产品有时简称为“经过处理的双歧杆菌产品”或“经过处理的产品”。
如以下实施例中所述，本发明中发现例如通过在90℃下热处理15分钟失活的双歧杆菌的细胞还具有防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用。因此，含有本发明细菌细胞的处理过的产品不仅在细菌细胞是活细胞时适用，而且在细菌细胞是经过热处理的细胞时(例如，当从经过热处理的双歧杆菌细胞的悬浮液(分散溶液)中获得0.1ml样品，并且在厌氧条件下在含有双歧杆菌可以生长的培养基的皮氏培养皿(petri dish)中培养时，不形成双歧杆菌菌落)同样适用。
通过上述方法获得的双歧杆菌和/或其经过处理的产品可以以活细胞或热处理后粉碎或未粉碎细胞的经过处理的产品的形式包含在本发明的药剂中。本发明的药剂中还可以含有其中一种或其中两种或多于两种的混合物。
以活细菌细胞的形式摄入后，预期会在体内(肠)产生生长的作用。经过热处理的细菌细胞(例如，当从经过热处理的双歧杆菌细胞的悬浮液(分散溶液)中获得0.1ml样品，并且在厌氧条件下在含有双歧杆菌可以生长的培养基的皮氏培养皿中培养时，不形成双歧杆菌菌落)也是优选地，因为不必考虑双歧杆菌不能在氧气存在下容易地存活，因此本发明的药剂可以用于更宽范围的应用。
具体来说，经过热处理的非活细胞形式的双歧杆菌是特别优选的。据推测，当双歧杆菌的细胞经过热处理时，双歧杆菌细胞的结构等变化，并且有助于防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用的物质容易地暴露出来。
关于热处理的条件，例如，加热温度一般是60至300℃，优选60至200℃，更优选60至150℃，进一步优选60至140℃，进一步优选60至130℃，进一步优选60至120℃，进一步优选60至110℃，进一步优选60至100℃，进一步优选70至100℃，进一步优选80至100℃，特别优选85至95℃。
加热温度优选是60℃或高于60℃，因为要将双歧杆菌的活细胞杀灭。此外，加热温度优选是300℃或低于300℃，因为要保持双歧杆菌不被碳化。
热处理时间一般是0.01至120分钟，优选0.015至60分钟，更优选0.02至40分钟，进一步优选0.025至30分钟，进一步优选0.03至25分钟，特别优选0.03至20分钟。
热处理时间优选是0.01分钟或更久，因为要将双歧杆菌的活细胞杀灭。此外，热处理时间优选是120分钟或更短，因为可以有效地杀灭活细胞，同时防止热变性。
在低温范围(60至100℃)中进行热处理时，最佳热处理时间可以是例如0.2至120分钟，优选0.2至60分钟，更优选0.2至40分钟，进一步优选0.2至30分钟，进一步优选0.2至25分钟，特别优选0.2至20分钟。
在高温范围(100至300℃)中进行热处理时，最佳热处理时间是例如0.01至0.5分钟，优选0.015至0.5分钟，更优选0.02至0.5分钟，进一步优选0.025至0.5分钟，特别优选0.03至0.5分钟。
举例来说，双歧杆菌的热处理优选在90℃下进行15分钟。
热处理方法不受特别限制。举例来说，所得细菌细胞可以在预定条件下使用热杀菌器(如板式杀菌器、管式杀菌器、直接加热型杀菌器或具有夹套的罐)加热。
必须服用来获得防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用的双歧杆菌的量以优选次序为例如108个细胞/天以上、108至1012个细胞/天、5×108至5×1011个细胞/天、109至1011个细胞/天、5×109至5×1010个细胞/天、6×109至4×1010个细胞/天或7×109至3×1010个细胞/天。该量更优选是8×109至2×1010，进一步优选9×109至2×1010个细胞/天。
在上述范围中，容易并且实际上获得防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用。在这方面，发现本发明的药剂(防龋剂、用于预防牙周病的药剂和用于治疗牙周病的药剂)是具有防龋作用以及预防牙周病和治疗牙周病的作用的组分，即活性成分。本发明药剂的使用目的不受限制，只要其为能够呈现作用的形式即可。
因为本发明的药剂具有极少副作用，所以本发明的药剂可以连续服用。为获得防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用，本发明双歧杆菌的摄入时间是例如2至10周、2至8周、3至7周、3.5至6.5周或4至6周。摄入时间优选是3.5至6.5周，进一步优选4至6周。
当双歧杆菌的摄入时间在以上范围中时，容易并且实际上获得防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用。具体来说，双歧杆菌优选以108个细胞/天以上的量连续使用四周或更久，并且更优选地，双歧杆菌以1010个细胞/天以上的量连续使用四周或更久。
本发明的药剂可以单独使用，并且还可以通过混合本发明的药剂与另一种组分而以防龋组合物、用于预防牙周病的组合物或用于治疗牙周病的组合物的形式使用。本发明的药剂在组合物中的量可以任选地视目的、应用、形式、制剂、症状、体重等来确定。
尽管本发明不限于此，但本发明的药剂可以相对于组合物的总量以0.01至99％(w/w)、优选0.1至90％(w/w)的量包含在组合物中。进一步优选地，可以含有0.1至50％(w/w)的量的本发明药剂。这是因为当量在该范围内时，摄入(给予)变得容易。
本发明的药剂或组合物可以以口服或非肠道(肌肉内、皮下、静脉内、栓剂形式、经皮等)的方式给予。可以服用本发明的药剂或组合物的受试者可以是成人或可以是婴儿或老人。本发明的药剂或组合物还可以给予对寡糖或糖醇高度敏感而不会受敏感性影响的人。
除已知作用(如改善腹泻、改善便秘、预防或治疗机会性细菌感染和病原微生物感染、抑制有害肠道细菌的生长、产生B族维生素、通过分解乳糖促进消化和吸收、改善宿主肠道免疫系统以及改善过敏)以外，本发明的药剂或组合物还具有防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用。
具体来说，本发明的组合物可以以药物产品与食物或饮料两者的形式使用。预期本发明的组合物在以药物产品形式直接给药或直接作为用于特殊膳食用途的食品(如用于指定的健康用途的食品)或营养食品服用时呈现防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用。用于特殊膳食用途的食品和营养食品的实例包括改性的奶粉、液体食品、用于病人的食品、婴儿食品(包括粉末状婴儿配方食品)、用于使女性泌乳的食品(包括奶粉)、补充食品以及强化食品。
当本发明的药剂作为药物产品使用时，给药途径是例如以药物制剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、微粒、粉末、溶液、糖浆或乳液)形式口服给药。含有防龋药物组合物的口服制剂可以通过根据正常方法使用已知佐剂制备作为主要药物的细菌细胞的药物制剂和/或经过处理的本发明产品来获得，该已知佐剂可以是常用于药物制剂领域的佐剂，如分散剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、调味剂、增溶剂、悬浮剂以及包覆剂。
也就是说，因为含有该药物组合物的口服制剂含有本发明的药剂，所以除已知作用(如改善腹泻、改善便秘、预防或治疗机会性细菌感染和病原微生物感染、抑制有害肠道细菌的生长、产生B族维生素、通过分解乳糖促进消化和吸收、改善宿主肠道免疫系统以及改善过敏)以外，该口服制剂还具有防龋作用、预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用。因此，该口服制剂有效用于各种疾病，如腹泻、便秘、机会性细菌感染、病原微生物感染和由有害肠道细菌生长引起的疾病，以及有效用于龋齿、牙周病等。
具体来说，本发明的药剂优选以与分散剂混合的组合物形式使用。分散剂的实例包括乳蛋白(如酪蛋白)、大豆蛋白、肽、氨基酸、淀粉、糊精、木聚糖、寡糖、糖类(葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖和麦芽糖)以及糖醇(海藻糖、木糖醇、赤藓糖醇、巴拉金糖、海藻酮糖(trehalulose)和木糖)。糊精是特别优选的分散剂。这是因为使用糊精作为分散剂使得可以进行粉末粒化，在分散、溶解等期间容易的处理以及长期储存。
分散剂，特别是糊精，优选为微粒形式。这是因为微粒是高度可溶的并且可以完好地包装，因此组合物可以被分成小部分。此外，微粒在制备中具有如下优势：组合物可以被精确地分成部分，而不会仅仅因为将组合物落在包装材料上而发生质量分布变化。
在本发明的组合物中，本发明的药剂与分散剂的质量比优选是1:100至1:2，更优选1:100至1:10，进一步优选1:100至1:20。这是因为当本发明的药剂与分散剂的质量比在该范围内时，本发明的药剂可以被有效地分散。
当例如口服给予含有本发明的药剂和分散剂(特别是糊精)的本发明组合物时，本发明的组合物可以以包装体形式给药，该包装体通过将本发明的组合物分成预定量的小部分并且将所述部分包装在包装材料中获得。也就是说，本发明的组合物可以以包装体形式给药，该包装体含有预定量的本发明组合物和包装材料，其中组合物被包装在包装材料中。在本发明中，优选地，每个单次剂量被单独封装，或两个或多于两个包装的部分对应于一次剂量。每次剂量被单独包装是特别优选的。
当本发明的药剂或组合物包含在防龋食品组合物中而无副作用时，可以将本发明的药剂或组合物添加到各种食品和饮料(奶、软饮料、发酵奶、酸奶、奶酪、面包、饼干、脆饼、比萨外皮、改性奶粉、液体食品、用于病人的食品、婴儿食品(包括粉末状婴儿配方食品)、用于使女性泌乳的食品(包括奶粉)、营养食品等)中，接着服用。本发明的药剂和组合物可以根据用于一般食品组合物的正常方法使用，例如通过直接使用药剂或组合物或与其它食品或食品组分混合来使用。
其状态可以是食品和饮料的任何一般使用状态，如固体(粉末、微粒等)、糊剂、液体或悬浮液。以这种形式，本发明的药剂可以在无心理问题下服用。
本发明的药剂和组合物还可以以含有无副作用的水、蛋白质、碳水化合物、脂肪或油、维生素、矿物质、有机酸、有机碱、果汁、调味剂等的组合物形式使用。
蛋白质的实例包括动物和植物蛋白，如全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、分离的乳清蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、母鸡蛋的蛋白、肉蛋白和其水解物；以及来源于奶的组分，如黄油、奶矿物质、奶油、乳清、非蛋白氮、唾液酸、磷脂和乳糖。可以使用已经用于药物产品以及食品和饮料的所有种类的无副作用的蛋白质和来源于奶的组分。还可以使用两种以上组分的组合。
碳水化合物的实例包括糖类、改性淀粉(糊精以及可溶性淀粉、英国淀粉(Britishstarch)、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)以及膳食纤维。
脂肪或油的实例包括动物脂肪和油，如猪油、鱼油、从其中分离的脂肪和油、其氢化的脂肪和油以及其酯基转移的脂肪和油；以及植物油，如棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油、从其中分离的油、其氢化的油以及其酯基转移的油。
维生素的实例包括维生素A、胡萝卜素、B族维生素、维生素C、D族维生素、维生素E、K族维生素、维生素P、维生素Q、烟酸、烟碱酸、泛酸、生物素、肌醇、胆碱以及叶酸。
矿物质的实例包括钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌以及硒。
有机酸的实例包括苹果酸、柠檬酸、乳酸以及酒石酸。可以使用已经用于药物产品以及食品和饮料的所有无副作用的有机酸。还可以使用两种以上组分的组合。
当本发明的药剂以食品或药物制剂的形式提供时，其制备方法可以是本领域的技术人员已知的方法。本领域的技术人员可以通过适当地组合如下步骤来制备所要的食品或药物制剂：将双歧杆菌或经过处理的本发明产品与其它组分混合的步骤、成型步骤、灭菌步骤、发酵步骤、焙烧步骤、干燥步骤、冷却步骤、粒化步骤、封装步骤等。
本发明的药剂还可以用于保健功能食品或病人用食品。鉴于日本国内和国外的趋势，以及在考虑与用于特定保健用途的食品的现有制度一致的情况下，已经建立用于保健功能食品的制度，其不仅用于一般食品，而且用于片剂、胶囊等形式的食品。保健功能食品包括用于特定保健用途的食品(个别许可型)和具有营养功能的食品(规格基准型)。预期当直接服用含有本发明的药剂或组合物的用于特殊膳食用途的食品如用于特定保健用途的食品或具有营养功能的食品时，防龋作用被表现出来。
[实施例]
[实施例1]
(双歧杆菌的制备)
在37℃下，在具有表1中所示的组成的厌氧EG培养基中培养双歧双歧杆菌OLB6378菌株(登记号：NITE BP-31)过夜。
[表1]
组分 每升培养基的克数
肉提取物 2.6
朊蛋白胨 10
酵母提取物 5
磷酸氢二钠 4
乳糖 1.5
可溶性淀粉 0.5
L-胱氨酸 0.2
L-半胱氨酸盐酸盐 0.5
消泡剂(硅酮) 0.2
聚山梨酸酯80 0.5
合计 25
培养后，通过离心收集细胞，并且用无菌水洗掉残余的培养基组分。接着，将细胞冷冻干燥。将此处获得的细胞用作未处理的OLB6378细胞粉末。
[实施例2]
(本发明药剂的制备)
a)经过热处理的OLB6378细胞的冻干粉的制备
通过搅拌将180g的量的在实施例1中获得的未处理的OLB6378细胞粉末(活细胞数为3.9×1011cfu/g)完全悬浮在2800ml在45℃下调节的原料水中。接着，加热悬浮液，同时搅拌悬浮液，保持在90℃下15分钟并且冷却。将所获得的加热的细胞的悬浮液冷冻干燥，并且获得156g经过热处理的OLB6378细胞的冻干粉。当在MRS琼脂平板上培养经过热处理的OLB6378细胞时，未观察到活的双歧杆菌细胞。此外，在156g所获得的经过热处理的OLB6378细胞的冻干粉中，约存在7.02×1013个双歧杆菌细胞(3.9×1011cfu/g×180g＝7.02×1013cfu)。此加热细胞的数目代表活细胞数(cfu)。
b)本发明药剂的制备
将120g的量的经过热处理的OLB6378细胞的冻干粉与2880g糊精微粒(松谷化学社)充分混合，并且将混合物分成1g的部分。因此制得本发明的药剂。在本发明的药剂中，约存在1.8×1010个双歧杆菌细胞(7.02×1013cfu/156g×120g/3000g＝1.8×1010cfu)。此加热细胞的数目代表活细胞数(cfu)。
[比较例1]
(安慰剂的制备)
通过将3000g糊精微粒(松谷化学社)分成1g的部分来替换实施例2的药剂来制备比较例1的安慰剂。
[试验例1]
在试验例1中，将接受实施例2的药剂的受试者的组称为“本发明药剂组”，并且将接受比较例1的安慰剂的受试者的组称为“安慰剂组”。根据下述受试者选择标准和受试者排除标准为两个组选择总共三十名受试者。将十五名受试者分配到本发明药剂组，并且将剩余15名受试者分配到安慰剂组。两个组的受试者每天接受实施例2的药剂或比较例1的安慰剂两次。摄入时间是五周。如以下评估条目中所述来评估两个组。
<受试者选择标准>
受试者选择标准如下。选择满足以下A)至E)中全部的受试者。
A)20至40岁的女性。
B)一般一日吃三餐。
C)嘴唇/面颊表面可以测量到以下六颗牙齿中的四颗以上(根据FDI编号系统)：16(上颌右边第一磨牙)；21(上颌左边中切牙)；24(上颌左边第一前磨牙)；36(下颌左边第一磨牙)；41(下颌右边中切牙)；以及44(下颌右边第一前磨牙)。FDI编号为17、15、11、22、25、37、35、31、42和45的牙齿作为六颗代表性牙齿的备选牙齿提供。
D)在筛选测试时具有20颗以上牙齿并且未进行龋齿和牙周病治疗的受试者。
E)获得测试的目的和内容的全部说明并且能够同意的受试者。充分理解地自愿参与测试并且提供参与测试的书面同意书的受试者。
<受试者排除标准>
受试者排除标准如下。排除满足以下a)至j)中的至少一个的人。
a)在筛选测试时被诊断为龋齿(C3以上)或严重的牙周病。
b)患有糖尿病、慢性肾病、胃肠功能失调、肺病、恶性肿瘤等并且接受任何药物。
c)参与或意欲参与药物产品或食品等的另一个测试。
d)五分钟刺激的唾液分泌量为3.0ml或更少。
e)刺激的唾液的pH值为6.2或更小。
f)使用可移动齿桥。
g)在筛选测试一个月内使用/摄入嗽口水、抗生素或抗细菌剂或看过牙医。
h)食物过敏。
i)在测试期期间怀孕、计划怀孕或哺乳的女性。
j)负责测试的牙医判定不足以作为该测试的受试者的任何其它人。
<评估条目>
1.生龋细菌的比例
生龋细菌的比例是本发明的药剂是否具有防龋作用的指标，并且是变异链球菌在唾液中的链球菌中的比例。也就是说，生龋细菌的比例通过以下方程表示。
生龋细菌的比例＝(变异链球菌的数目/链球菌的数目)×100
历经五分钟从属于本发明药剂组和安慰剂组的受试者收集刺激的唾液样品(咀嚼口香糖时分泌的唾液)。通过培养法测量唾液样品中变异链球菌的数目和链球菌的数目，并且计算生龋细菌的比例。在摄入第一天以及开始摄入后四周和五周测量生龋细菌的比例。通过计数当在37℃下在厌氧条件下在Mitis-Salivarius(MS)琼脂平板上培养一定量的经过适当稀释的唾液样品48小时时形成的菌落来测定链球菌的数目。以相同的方式测定变异链球菌的数目，但使用含有杆菌肽(SIGMA)的Mitis-Salivarius琼脂平板(MSB培养基)。
2.齿龈指数
齿龈指数是本发明的药剂是否具有预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用的指标。齿龈指数通过非专利文件1中所述的方法(Periodontal disease in pregnancy.LeeH,Silness J.,Acta Odontologica Scandinavica1963 21:533-51)测量。具体来说，用肉眼观察具有预定的六颗牙齿的舌表面、嘴唇/面颊表面、中央和远端表面(总计24个表面)，并且通过下述的标准和方法来计数齿龈指数。在这方面，预定的六颗牙齿是上颌右边第一磨牙、上颌左边中切牙、上颌左边第一前磨牙、下颌左边第一磨牙、下颌右边中切牙以及下颌右边第一前磨牙。
[标准]
0：临床上正常的齿龈。
1：轻微发炎并且齿龈颜色轻微变化，但在探查时内部齿龈缘未出血。
2：中等发炎，齿龈肿胀发亮且发红，并且在探查时内部齿龈缘出血。
3：严重发炎，明显发红并且肿胀，自发的出血和溃疡。
[方法]
历经五分钟从受试者收集刺激的唾液样品(咀嚼口香糖时分泌的唾液)后，从牙医的问题和口腔诊断的记录计算齿龈指数。在筛选日(开始摄入前一个月)和开始摄入后五周通过以下方程计算齿龈指数。
(齿龈指数)＝(所有牙齿的齿龈评估总分)/(测试的牙齿表面的数目)
3.菌斑指数
菌斑指数是本发明的药剂是否具有预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用的指标。菌斑指数通过非专利文件2中所述的方法(Comparative cleaning efficiency ofmanual and power brushing.Quigley H,Hein JN.,J Am Dent Ass 1962 65:26)测量。具体来说，用肉眼观察具有预定的六颗牙齿的舌表面、嘴唇/面颊表面、中央和远端表面(总计24个表面)，并且通过下述的标准和方法来计数菌斑指数。在这方面，预定的六颗牙齿是上颌右边第一磨牙、上颌左边中切牙、上颌左边第一前磨牙、下颌左边第一磨牙、下颌右边中切牙以及下颌右边第一前磨牙。
[标准]
0：无菌斑粘附。
1：沿着齿龈缘有菌斑点。
2：沿着齿龈缘有菌斑线。
3：菌斑覆盖不超过齿龈侧的牙齿表面的三分之一。
4：菌斑覆盖不超过齿龈侧的牙齿表面的三分之二。
5：菌斑覆盖齿龈侧的牙齿表面的三分之二以上。
[方法]
历经五分钟从受试者收集刺激的唾液样品(咀嚼口香糖时分泌的唾液)后，从牙医的问题和口腔诊断的记录计算菌斑指数。在筛选日(开始摄入前一个月)和开始摄入后五周通过以下方程计算菌斑指数。
(菌斑指数)＝(所有牙齿的菌斑评估总分)/(测试的牙齿表面的数目)
[结果和讨论]
1.生龋细菌的比例
在本发明药剂组中，生龋细菌的平均比例在摄入第一天是0.5，并且在四周后生龋细菌的平均比例显著减少至0.2。另一方面中，在安慰剂组中，生龋细菌的平均比例在摄入第一天是0.2，但在四周后生龋细菌的平均比例并不显著变化并且仍为0.2。
将本发明药剂组和安慰剂组的值进行统计分析以比较所述组之间的值(用于在所述组之间比较的魏克森秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)、用于在组内比较摄入时间前后的值的魏克森带符号的秩检验(Wilcoxon signed-rank test))。因此，摄入第一天的p值是0.218，并且四周后的p值是0.973。
2.齿龈指数
在本发明药剂组中，在摄入第一天平均齿龈指数是0.13，并且五周后平均齿龈指数显著降至0.04。另一方面，在安慰剂组中，在摄入第一天平均齿龈指数是0.21，但五周后的平均齿龈指数并不显著减少，为0.505。
将本发明药剂组和安慰剂组的值进行统计分析以比较所述组之间的值(用于在所述组之间比较的魏克森秩和检验、用于在组内比较摄入时间前后的值的魏克森带符号的秩检验)。因此，筛选日的p值是0.378，并且五周后的p值是0.065。
3.菌斑指数
在本发明药剂组中，在摄入第一天平均菌斑指数是0.17，并且五周后平均菌斑指数并不显著增加并且仍为0.17。另一方面，在安慰剂组中，在摄入第一天平均菌斑指数是0.17，但五周后平均菌斑指数显著增加到0.33。
将本发明药剂组和安慰剂组的值进行统计分析以比较所述组之间的值(用于在所述组之间比较的魏克森秩和检验、用于在组内比较摄入时间前后的值的魏克森带符号的秩检验)。因此，筛选日的p值是0.849，并且五周后的p值是0.043。
如结果所示，仅在本发明药剂组中观察到生龋细菌比例显著降低，而在安慰剂组中未观察到。因此，发现本发明的药剂具有防龋作用。
此外，仅在本发明药剂组中观察到牙龈指数显著降低及菌斑指数恶化的防止，而在安慰剂组中未观察到。因此，发现本发明的药剂具有预防牙周病的作用和治疗牙周病的作用。
尽管本发明已经使用特定的实施方式详细说明，但本领域的技术人员显而易见可在不背离本发明的目的和范畴的情况下进行各种变化和修改。本申请基于2015年5月29日提交的日本专利申请(专利申请第2015-110743号)，并且其全部内容以引用的方式并入本发明中。
[工业实用性]
根据本发明，可以提供一种新防龋剂或防龋组合物，其含有双岐杆菌并且无副作用。此外，可以提供一种用于预防牙周病或用于治疗牙周病的新药剂，其含有双歧杆菌并且无副作用；或用于预防牙周病或用于治疗牙周病的新组合物，其含有双歧杆菌并且无副作用。双歧杆菌可以降低口腔中生龋细菌的比例，因此可以预防并且治疗龋齿。此外，双歧杆菌可以降低齿龈炎的症状并且可以减少菌斑对牙齿的粘附。因此，双歧杆菌可以预防并且治疗牙周病。
序列表
<110> 株式会社明治
<120> 防龋剂和防龋组合物
<141> 2016-05-24
<150> JP2015/110743
<151> 2015-05-29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Bifidobacterium bifidum
<400> 1
ccacatgatc gcatgtgatt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Bifidobacterium bifidum
<400> 2
ccgaaggctt gctcccaaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 3
ttccagttga tcgcatggtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 4
gggaagccgt atctctacga 20

Claims (12)

1.一种防龋剂，其包含双歧杆菌。
2.根据权利要求1所述的防龋剂，其中所述双歧杆菌是双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)。
3.根据权利要求1或2所述的防龋剂，其中所述双歧杆菌是双歧双歧杆菌OLB6378菌株(登记号：NITE BP-31)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的防龋剂，其中所述双歧杆菌为经过热处理的细胞的形式。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的防龋剂，其中以108个细胞/天以上的量连续使用所述双歧杆菌四周或更久。
6.一种防龋组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的防龋剂。
7.根据权利要求6所述的防龋组合物，其还包含分散剂。
8.根据权利要求7所述的防龋组合物，其中所述分散剂是糊精。
9.一种包装体，其包含根据权利要求6至8中任一项所述的防龋组合物和包装材料，其中所述防龋组合物被包装在所述包装材料中。
10.一种用于预防牙周病的药剂或用于治疗牙周病的药剂，其包含双歧杆菌。
11.一种防龋剂、用于预防牙周病的药剂或用于治疗牙周病的药剂，其包含双歧杆菌。
12.双歧双歧杆菌OLB6378菌株(登记号：NITE BP-31)，其已经被热处理。
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