CN107519166A - 一种GSK‑3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GSK‑3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用。本发明通过GSK‑3β抑制剂Ar‑a014418下调Myocardin的mRNA与蛋白表达水平，削弱Doxycycline对Myocardin的诱导表达作用，有效地阻断Myocardin下游平滑肌标志基因SM22，Caponin的转录与表达，并且有效削弱Doxycycline诱导Myocardin表达所致的SM22、Caponin的mPNA与蛋白表达水平的增高，进而达到治疗动脉粥样硬化的目的。本发明通过大量的实验验证GSK‑3β抑制剂Ar‑a014418对于动脉粥样硬化具有高效的抑制作用，为治疗动脉粥样硬化提出了一种全新的、独特的治疗方法，为进一步探讨动脉粥样硬化类疾病的治疗进展道路提供理论依据，进而为动脉粥样硬化药物干预与基因治疗提供新策略，值得推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是指在动脉及其分支的动脉壁内膜及内膜下有脂质沉着(主要是胆固醇及胆固醇酯)，同时伴有中层平滑肌细胞移行至内膜下增殖，使内膜增厚，形成黄色或灰黄色状如粥样物质的斑块。目前，AS是严重威胁人类健康的疾病，心、脑、肾是主要的AS靶器官，可导致心肌梗死、缺血性心肌病，脑卒中和慢性肾病，最终导致多器官功能衰竭和死亡。在西方发达国家其年死亡数可以占到总死亡数的1/3左右，占心脏病死亡数的50％-75％，据近年来WHO统计冠心病是目前世界上最常死亡原因，超过所有肿瘤的总和，列死因的首位。而在我国本病不如欧美多见，但近30年来其发病率和死亡率正迅速增高，已严重威胁到我国国民生活水平和质量。
N-(4-Methoxybenzy)-N′-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea(N-(4-甲氧苄基)-N′)-(5-硝基-1,3噻唑-2-烃))即Ar-a014418，其化学结构式为：
Ar-a014418是一种1,3-硫氮杂茂类化合物，常温下为白色固体，微溶于水，在二甲基亚砜中的溶解度为5mg/ml，目前常在实验室内作为糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的特异性抑制剂应用于凋亡信号转导通路的研究，还在动物模型上作抑郁症治疗的研究工作。
GSK-3β在动脉粥样硬化发病中的作用及分子机制尚未明确，目前国内外文献亦未见GSK-3β调控SMC特异性转录因子Myocardin对动脉粥样硬化发生发展的作用的报道。本发明实验研究发现，抑制Myocardin上游的GSK-3β基因的活性能下调Myocardin并有效地阻断其下游SM22、Caponin基因的转录与表达，可影响平滑肌细胞的增殖和分化功能，进而达到治疗动脉粥样硬化的目的。
发明内容
为了达到上述目的，本发明提供了一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用。
本法明是通过以下技术方案实现的。
一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述治疗方法为通过GSK-3β抑制剂抑制Myocardin上游的GSK-3β基因的活性，进而治疗动脉粥样硬化。
优选的，所述治疗方法为药物干预、基因调控中的一种或一种以上。
优选的，所述药物干预方法为将GSK-3β抑制剂Ar-a014418与其他辅药按常规制药工艺制成试剂、片剂、胶囊剂、乳剂中的一种或一种以上。
优选的，所述试剂按Ar-a014418与注射用水以1g:1000毫升的比例与其他辅药均匀混合制得。
优选的，所述基因调控方法为通过转染重组技术重组GSK-3β质粒，以达到调控GSK-3β活性的目的，检测比较使用Ar-a014418进行调控的作用，进而达到确定使用Ar-a014418治疗动脉粥样硬化的目的。
优选的，所述GSK-3β抑制剂包括AR-A、LiCl中的一种或一种以上。
优选的，所述GSK-3β抑制剂为Ar-a014418。
优选的，所述GSK-3β抑制剂Ar-a014418分子式为：
本发明的有益效果是：本发明通过T-Rex系统成功构建高灵敏度可调控的稳定表达Myocardin的平滑肌细胞系，可清楚灵敏的反映目的基因的转录水平和蛋白表达的细微变化，能更好地研究目的基因的功能特性。同时，本发明通过大量实验结果表明GSK-3β抑制剂AR-A能下调Myocardin的mRNA与蛋白表达水平，削弱Doxycycline对Myocardin的诱导表达作用，有效地阻断Myocardin下游平滑肌标志基因SM22，Caponin的转录与表达，并且有效削弱Doxycycline诱导Myocardin表达所致的SM22、Caponin的mPNA与蛋白表达水平的增高，达到治疗动脉粥样硬化的目的；为进一步探讨动脉粥样硬化的治疗进展道路提供理论依据，进而为动脉粥样硬化药物干预与基因治疗提供新策略。
附图说明
图1为构建高灵敏度可调控的稳定表达Myocardin的血管平滑肌实验细胞系的示意图。
图2为体内实验qPCR实验结果示意图。
图3为建立动脉粥样硬化动物模型的示意图。
图4为体外实验qPCR实验结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本法明进一步作详细的说明。
一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，治疗理论依据为：通过GSK-3β抑制剂抑制Myocardin上游的GSK-3β基因的活性，下调Myocardin活性，并阻断其下游SM22、calponin基因的转录与表达，进而影响平滑肌细胞的增殖和分化功能，最终达到预防或治疗动脉粥样硬化的目的。
具体的，本治疗方法通过以下实验方案得以验证。
实验1、体内实验：
体内实验：通过使用特定质粒构建高灵敏度可调控的稳定表达Myocardin的血管平滑肌实验细胞系，以便清楚反映目的基因的转录水平和蛋白表达的细微变化，更好地研究目的基因。然后应用基因重组质粒转染技术及基因抑制药物，调控实验细胞系中的GSK-3β基因的活性，检测其对VSMC特异性转录因子Myocardin的mRNA及蛋白水平的影响以及因此而导致的SM22，Calponin等平滑肌标志基因的转录水平和蛋白表达的水平的影响；应用更新更准确的的蛋白免疫共沉淀结合Western blot方法研究目的蛋白与组蛋白共价修饰关系以明确GSK-3β调节Myocardin的具体信号转导机制，并采用激光共聚焦显微镜在细胞水平上进行蛋白的定量分析研究；与此同时，使用目前处于国际最前沿的也是唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用染色体免疫共沉淀结合real-time Q-PCR方法研究目的基因与目的蛋白转录调控机制。从而在分子机理和细胞学角度研究和分析GSK-3β是否通过调节Myocardin的转录与表达活性从而对AS斑块形成产生影响及其分子机制。实验示意图见图1。
实验结果表明：GSK-3β抑制剂AR-A能下调Myocardin的mRNA与蛋白表达水平，并且能削弱Doxycycline对Myocardin的诱导表达作用。实验结果示意图见图2。
实验2、体外实验：
体外实验：建立动脉粥样硬化动物模型，分析干预GSK-3β基因的活性对动脉粥样硬化斑块形成的调节作用。实验示意图见图3。
实验结果表明：GSK-3β抑制剂AR-A能有效地阻断Myocardin下游平滑肌标志基因SM22，Caponin的转录与表达，并且能有效削弱Doxycycline诱导Myocardin表达所致的SM22，Caponin的mPNA与蛋白表达水平的增高。实验结果示意图见图4。
实施例1、注射液的制备
称取1gAR-A014418溶于1000ml注射用水中，并加入100ml乙醇溶液，溶解、超微滤膜过滤，蒸去乙醇，即得浓度为1g/100ml的注射液，灭菌，按20ml一支分装。
实施例2、片剂的制备
一种治疗动脉粥样硬化的片剂药物，包括以下重量份的原料加工制成：
a、称取AR-A014418抑制剂30g、淀粉3g、酒石酸0.2g、10％的淀粉浆适量、滑石粉0.5g。
b、10％淀粉浆的制备：将0.2g酒石酸溶于约20ml纯化水中，再加入淀粉约2g分散均匀，加热糊化，制成10％的淀粉浆；
c、制粒：称取AR-A014418抑制剂10g与剩余淀粉混合均匀，加适量10％淀粉浆制软材，过16目筛制粒，将湿粒于40～60℃干燥，用16目筛整粒并与滑石粉混匀；
d、在常力下压片：将上述颗粒在常压下压片，测定各片剂的硬度、净含量，检验是否合格；
e、服用方法：对动脉粥样化患者：口服一次一片，一日三次。
Claims (8)
1.一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述治疗方法为通过GSK-3β抑制剂抑制Myocardin上游的GSK-3β基因的活性，进而治疗动脉粥样硬化。
2.根据权利要求1所述一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述治疗方法为药物干预、基因调控中的一种或一种以上。
3.根据权利要求2所述一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述药物干预方法为将GSK-3β抑制剂Ar-a014418与其他辅药按常规制药工艺制成试剂、片剂、胶囊剂、乳剂中的一种或一种以上。
4.根据权利要求3所述一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述试剂按Ar-a014418与注射用水以1g:1000毫升的比例与其他辅药均匀混合制得。
5.根据权利要求2所述一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述基因调控方法为通过转染重组技术重组GSK-3β质粒，以达到调控GSK-3β活性的目的，检测比较使用Ar-a014418进行调控的作用，进而达到确定使用Ar-a014418治疗动脉粥样硬化的目的。
6.根据权利要求1所述的一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂包括AR-A、LiCl中的一种或一种以上。
7.根据权利要求6所述一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂为Ar-a014418。
8.根据权利要求7所述一种GSK-3β抑制剂在治疗动脉粥样硬化的药物上的应用，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂Ar-a014418分子式为：
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